全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(6): 631-634(2011)
收稿日期: 2010-12-15; 修回日期: 2011-08-30
基金项目: 现代农业(柑橘)产业技术体系(MATS)专项经费资助
通讯作者: 李红叶,教授,主要从事植物病理学研究; E-mail: hyli@zju. edu. cn。
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췍研究简报
金橘脚腐病病原菌鉴定
朱 丽1, 赵小龙2, 吴礽超2, 李红叶1*
( 1浙江大学生物技术研究所, 杭州 310029; 2广西柑橘研究所, 桂林 541000)
Identification of the pathogen causing foot rot of Fortunella margarita ( Lour. )
Swingle　 ZHU Li1, ZHAO Xiao-long2, WU Ren-chao2, LI Hong-ye1 　 ( 1 Institute of Biotechnology, Zhejiang
University, Hangzhou 310029, China; 2 Citrus Institute of Guangxi, Guangxi 541000, China)
Abstract: Foot rot of kumquat [Fortunella margarita (Lour. ) Swingle] is a big problem in Guilin, Guangxi
Zhuang Autonomous Region, where kumquat is one of the main cash crops. The affected trees decline gradual-
ly and finally wilt as the lesion girding the trunk. The suspected pathogen isolates of Phytophthora citrophtho-
ra, which identified by morphology, were always obtained from affected trunks. The pathogenicity of those
isolates were confirmed by inoculating the representative isolate GLC15 on kumquat seedlings, shoots and
branches . The identification was further confirmed by alignment the sequences of internal transcribed spacer
( ITS) and translation elongation factor 1 alpha gene (TEF-1α), amplified by PCR. The sequences were de-
posited in GenBank with accession numbers GU133068 ( ITS) and HQ637486 (TEF-1α), while the pathogen
culture was deposited in Institute of Biotechnology, Zhejiang University.
Key words: kumquat (Fortunella margarita); foot rot; pathogen identification; Phytophthora citrophthora
文章编号: 0412-0914(2011)06-0631-04
　 　 金橘[Fortunella margarita (Lour. ) Swingle]
为芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurantioideae)金
柑属(Fortunella)多年生常绿木本植物,原产于我
国,全国各柑橘产区均有栽培。 广西桂林阳朔地区
盛产金橘,随着金橘树栽培面积的扩大,病害逐渐
加重。 其中,尤以金橘脚腐病最为突出。 金橘脚腐
病主要发生在近地面的根茎部,表现为皮层组织腐
烂、流胶;轻者植株生长衰退、果小、产量降低、品质
变劣,重者全株枯死,给当地果农造成巨大经济损
失。 脚腐病在世界各柑橘产区均有发生,一般认为
引起柑橘脚腐的病原是疫霉属 ( Phytophthora
spp. )真菌,在不同国家或地区,种类有所不同。 如
在美国佛罗里达主要以 P. citrophthora、 P. nicoti-
anae和 P. palmivora 为主[1];在西班牙主要以 P.
citrophthora、P. nicotianae 和 P. citricola 为主[2]。
在我国,Cheng等[3]报道广东柑橘脚腐病的疫霉菌
有 P. citrophthora、 P. nicotianae、 P. palmivora、
P． capsici、P. drechsleri 和 P. citricola。 然而国内
的这些结果还需致病性试验的支持,迄今鲜有人开
展金橘脚腐病原的相关研究。 笔者于 2008 年 8 月
和 2009 年 3 月,先后 2 次对桂林阳朔金橘脚腐病
进行调研和采样,根据病原菌鉴定的常规程序对所
获菌株进行鉴定,结果如下。
1　 材料与方法
1. 1　 样品采集
从广西桂林阳朔县白沙镇观桥村韦家碧和委
　
植物病理学报 41 卷
玲华果园,刮取具有典型脚腐病症状的树干病健交
界处的皮层和木质部组织,置于干净的采集袋,带
回实验室进行分离培养。
1. 2　 疫霉菌的分离和培养
新鲜样品带回实验室后,立即进行组织分离或
诱捕分离。 培养基为玉米粉选择性培养基
PARPH[2],置 24℃光照培养箱(12 h / d)中培养 2
~ 3 d,切取菌落边缘菌丝块,转移至 PDA 斜面培
养基上保存,备用。
1. 3　 致病性测定
供试接种材料有 2 年生盆栽阳朔金橘幼树
(根茎部),成年结果树 2 ~ 4 年生枝干,以及当年
生新梢。 用 75%酒精擦拭待接种部位,用无菌手
术刀片轻轻削开皮层。 切取培养 7 d 的菌丝块(5
mm × 5 mm),菌丝面朝下贴于伤口表面,用 Para-
film胶缠绕固定,喷雾,套袋保湿 24 h。 定期观察
并记录嫩梢的发病情况,症状明显后,从发病枝干
病健交界处取样,根据上述方法再分离,根据菌落
形态、孢子囊特征以及测定 ITS 和 TEF 序列,确定
再分离的培养物是否与接种的培养物一致。
1. 4　 疫霉菌的培养性状和子实体形态
用打孔器在培养约 7 d的菌落边缘打孔,制备
菌碟,移至 PDA 平板中央,在 24℃光照条件下培
养 4 d后,观察记录菌落形态,测量菌落直径,计算
菌落扩展速度。 另取菌丝块,置于灭菌自来水中,
每隔 12 ~ 24 h 换一次水,并定期观察菌丝丛上孢
子囊产生情况,大约 1 星期后,挑取菌丝丛,置于显
微镜下观察,并拍摄病菌的孢囊梗和孢子囊形态特
征,统计 60 个孢子囊的长、宽,计算其长宽比。 根
据疫霉菌菌落形态、孢囊梗以及孢子囊形态特征,
对病菌进行初步鉴定。
1. 5　 rDNA- ITS及延长因子 TEF 的 PCR 扩增与
序列分析
采用改良的月桂酰肌氨酸钠(SLS)法[4]提取
疫霉菌基因组 DNA。 用真菌核糖体 rDNA通用引
物 ITS4 ( 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 和
ITS6(5′-GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3′),扩
增 18S rDNA 和 28S rDNA 基因之间的 2 个转录间
隔区序列( internal transcribed spacer),以及其中的
5. 8S 基因序列[5]。 翻译延长因子 TEF( translation
elongation factor 1 alpha gene (TEF-1α))的引物,
根据公共数据库 GenBank (www. ncbi. nlm. nih.
gov / genbank / ) 提供的 Phytophthora citrophthora
EF 序列 (登录号:EU080539、AY564112)自行设
计: EF1(5′-CACGCTCTGCTTGCTTTC-3′)和 EF2
( 5′-GGCATCACCCGACTTCAC-3′)。 PCR 产 物
纯化后,送上海 Invitrogen 公司进行测序。 测序结
果用 DNAman软件分析,然后与 GenBank 数据库
中相关序列进行同源性比较并登录,最后用
MEGA4. 0 软件构建系统进化树。
2　 结果与分析
2. 1　 疫霉菌的分离结果与形态特征观察
从广西桂林地区共采集金橘脚腐病标样 19
个,均分离或诱导获得菌落(菌丝团)白色、无隔膜
的培养物,培养物之间的菌落特征、生长速率、孢囊
梗和孢子囊形态大致相同,因此视为同一种真菌。
选择代表性菌株 GLC15 进行如下描述。
GLC15 在 PDA 培养基上,25℃条件下培养
7 d,菌落呈花瓣放射状,菌丝白色,紧贴培养基生
长,较致密,气生菌丝较少(图 1-A),生长速率为
8. 3 mm / d。 菌丝无隔膜,粗细均匀,在分枝处常略
缢缩(图 1-B 箭头所指),未见菌丝膨大体和厚垣
孢子,经过水培诱导产生大量孢子囊。 孢囊梗分化
不明显,分枝不规则。 孢子囊形态变异极大,有卵
形、不规则形、倒梨形、长椭圆形、近圆形和椭圆形
等(图 1-C ~ H),长 ×宽大小范围大约(36 ~ 105)
μm × (18 ~ 40)μm,平均 57 μm × 30 μm,长宽比
1． 2 ~ 3. 0,平均 1. 9。 孢子囊通常具乳突 1 ~ 2 个,
明显或不明显。 这些形态学特征与柑橘褐腐疫霉
(P. citrophthora)特征一致,所以将菌株 GLC15 初
步鉴定为柑橘褐腐疫霉。
2. 2　 致病性测定
选择代表性菌株 GLC15 进行人工接种。 共接
种 8 株盆栽的阳朔金橘幼树,15 d 后观察,幼树的
根茎部围绕接种部位呈现褐色稍凹陷的病斑,部分
病斑有流胶现象,削开表皮,皮层和木质部变褐。
对照组伤口愈合,削开表皮,皮层组织白净,无
褐变。
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　 6 期 　 朱 丽,等:金橘脚腐病病原菌鉴定
Fig. 1　 Morphology of Phytophthora citrophthora, the pathogen of
foot rot of Fortunella margarita (Lour. ) Swingle
A: Colony on PDA (9 d); B: Hyphae ; C - H: Sporangia.
　 　 菌丝块接种金橘当年生幼嫩枝梢 2 d 后,接种
处发生流胶现象(图 2-A),且枝梢逐渐干枯变褐,
接种发病率 100% 。 对照组则只留有愈伤疤痕。
接种 4 ~ 6 年生的金橘枝干 6 d 后,伤口处流
胶,13 d后流胶加重,伤口及周围组织呈水渍状褐
色。 一年后再观察,接种处表皮开裂(图 2-B),削
开表皮,可见皮层和木质部变褐(图 2-C)。 试验共
接种 15 个枝干,检查发现每个接种点均发病,发病
率 100% 。 对照组起初偶见胶滴产生,但伤口很快
愈合,停止流胶,削开表皮可见内部健康清白(图
2-D)。
取接种发病金橘根茎部、幼稍和枝干组织进行
再分离,均能获得与 GLC15 表型一致的病原菌。
根据柯赫氏法则,可以说明 GLC15 为金橘脚腐病
的病原。
2. 3　 序列分析
应用真菌通用引物对 ITS4 和 ITS6,以及自行
设计的引物 EF1 和 EF2,可从 GLC15 菌株基因组
中分别扩增获得 896 bp和 756 bp 的序列,在 Gen-
Bank数据库中进行搜索比对,发现 ITS序列(登录
号:GU133068)与已报道的柑橘褐腐疫霉菌(P.
citrophthora) ITS 序列(登录号:AJ854299)一致性
达 99% ,而 EF序列(登录号:HQ637486)与已报道
的柑橘褐腐疫霉菌 EF 序列(登录号:EU080539)
一致性达 98% 。 从公共数据库中获得柑橘上已报
道的疫霉菌以及其他作物上的部分疫霉菌序列,作
为外参,用 MEGA4. 0 软件选择 Neighbour-joining
法和 Kimura-2-parameter 模型构建系统进化树,
rDNA -ITS和EF聚类分析结果均表明,GLC15与
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植物病理学报 41 卷
Fig. 2　 Inoculation with isolate GLC15 in field test
A: Symptoms on shoot 2 days after inoculation; B,C: Symptoms on branch 1year after inoculation; D: CK.
P． citrophthora 聚为同一个分支,进一步证明
GLC15 菌株为柑橘褐腐疫霉。
基于形态学特征、分子特征以及致病性测试的
结果,将广西桂林阳朔金橘脚腐病菌鉴定为柑橘褐
腐疫霉菌(Phytopathora citrophthora Leonian)。
3　 讨论
金橘脚腐病在广西桂林阳朔金橘产区发生普
遍,局部地区病害严重,病株一旦发现很难治愈,成
为当地金橘产业发展的一大障碍。 虽然从田间症
状分析,极有可能是疫霉属真菌,但也有人推测是
镰刀菌(Fusarium spp. )或镰刀菌和疫霉菌的混合
感染。 本研究也分离到一些镰刀菌,但接种试验未
见引起明显症状,而疫霉菌接种却能很快诱发症
状,推测这些镰刀菌属于腐生菌或次要致病菌,疫
霉菌是桂林金橘脚腐病的主要病因。
桂林金橘脚腐病严重的原因主要有两点,一是
已有桂林金橘大多是实生苗,抗病性弱;二是嫁接
苗嫁接位置过低,种植过深,嫁接口埋在土下,病菌
极易入侵。 通过选用抗病砧木、适当提高嫁接部
位、避免栽植过深等栽培措施,可预防金橘脚腐病
发生。 同时定期检查,尽早发现,局部刮除病斑、涂
药,或在每年春季和秋季选用乙磷铝、甲霜灵等药
剂进行浇根处理,均可有效防治脚腐病。
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责任编辑:于金枝
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