全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 310鄄313(2011)
收稿日期: 2010鄄01鄄14; 修回日期: 2010鄄11鄄30
基金项目: 国家自然科学基金(30860168)
通讯作者: 向本春, 教授, 主要从事植物病毒及其病害防治研究; Tel: 0993鄄2058009, E鄄mail: xbc@shzu. edu. cn。
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研究简报
新疆西瓜花叶病毒 2 号遗传变异的 PCR鄄SSCP分析
黄素芳1, 向本春1*, 李 虎2, 刘升学1, 安仙丽3
( 1石河子大学农学院植物保护系, 石河子 832003; 2自治区植物保护站, 乌鲁木齐 830006;
3新疆油田公司白碱滩物业管理公司, 克拉玛依 834008)
Detection of genetic variations among Xinjiang isolates of WMV鄄2 by PCR鄄SSCP
analysis摇 HUANG Su鄄fang1, XIANG Ben鄄chun1, LI Hu2, LIU Sheng鄄xue1, AN Xian鄄li3 摇 ( 1Department
of Plant Protection, Agricultural College, Shihezi University, Shihezi 832003,China; 2Station of Plant Protection, Wulumuqi
830006, China; 3Baijiantan Property Management Company of Xinjiang Oilfield Company, Kelamayi 834008, China)
Abstract: Twelve isolates of Watermelon mosaic virus 2(WMV鄄2) were collected from Cucurbitaceae plants
in different areas of Xinjiang Uygur Autonomous Region in 2008, and their genetic variations were analyzed
by RT鄄PCR鄄SSCP. A specific fragment of about 421 bp was amplified among all the isolates by RT鄄PCR.
Using analysis of single鄄strand conformation polymorphism (SSCP), 12 isolates of WMV鄄2 were classified as
five variant types: KS2 ( type玉), S7( type 域), S4( type 芋), KS1 and S6 ( type 郁), M1,M2,K1,S3,
S5,S1 and S2( type 吁) . It was shown that there were genetic variations and differences in regional distribu鄄
tion among the isolates of Cucurbitaceae WMV鄄2 in Xinjiang, and there was obvious differentiation among the
isolates of the different Cucurbitaceae plants in the same place.
Key words: Xinjiang; Cucurbitaceae; Watermelon mosaic virus 2; PCR鄄SSCP; genetic variations
文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0310鄄04
摇 摇 新疆地域广阔,各地气候条件差异大。 西瓜、
甜瓜在新疆种植面积较广,其病毒病的发生和危害
较重。 西瓜花叶病毒 2 号(Watermelon mosaic vi鄄
rus 2,WMV鄄2)是致病的主要毒源之一。 前人对
WMV鄄2 的研究仅限于病原鉴定以及它对瓜类氨
基酸的影响,而对它的遗传变异未做研究。 为了深
入研究新疆不同地域 WMV鄄2 致病性的差异,有必
要弄清楚新疆的 WMV鄄2 有无遗传变异的发生。
PCR鄄SSCP是一种基于 PCR 的单链构象多态性
( single鄄stranded conformation polymorphism)分析
技术,主要用于 DNA 已知突变的检测或未知变异
的分析[1]。 利用 SSCP,本实验室曾对新疆不同地
区的甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)RNA2 的区间变
异进行了研究,发现 12 个分离物共有 4 种变异类
型[2]。 本研究利用 SSCP 对采自不同瓜类种植区
WMV鄄2 的遗传变异进行了初步研究,研究结果为
该病害的防治奠定了基础。
1摇 材料和方法
1. 1摇 病毒毒源的采集
感染病毒病的供试样品为 150 个,于 2008 年
7 ~ 8 月采自新疆石河子、玛纳斯、奎屯、昌吉、阿克
苏及喀什地区的甜瓜、南瓜、西瓜、黄瓜、瓠子、丝瓜
等葫芦科作物(表 1)。
摇
摇 3 期 黄素芳,等:新疆西瓜花叶病毒 2 号遗传变异的 PCR鄄SSCP分析
Table 1摇 Sources of Watermelon mosaic virus 2 isolates
Sample Name Collection location Host Symptom
S1 The village of Shihezi Cucumber Mosaic
S2 Vegetable Research Institute of Shihezi Zucchini Malformation, Shoestring
S3 Experiment field of Shihezi University Pumpkin Chlorosis, Mosaic
S4 Experiment field of Shihezi University Cucumber Chlorosis, Mosaic
S5 No. 145 Regimental Farm in Shihezi Cucumber Mosaic
S6 No. 146 Regimental Farm in Shihezi Watermelon Chlorosis, Mosaic
S7 No. 147 Regimental Farm in Shihezi Pumpkin Yellowing, Mosaic
K1 Kuitun city Cucumber Mosaic
M1 Manasi county Pumpkin Chlorosis, Mosaic
M2 Manasi county Watermelon Chlorosis, Mosaic
KS1 Kashi city Muskmelon Chlorosis,Mosaic
KS2 Kashi city Jiashi melon Yellowing
1. 2摇 引物合成
根据报道的美国 WMV鄄2 分离物的外壳蛋白
(CP)基因(GenBank序列号:D13913)序列设计引
物对 WMV鄄2鄄GF:5忆鄄ATGATGAGCAAATGGGTG鄄
3忆(与 2 558 ~ 2 575 nt 相对应),WMV鄄2鄄GR:5忆鄄
TCGGAATTGGTCGAGATA鄄3忆(与 2 961 ~ 2 978
nt相对应),扩增片段大小为 421 bp,由上海捷瑞
生物工程有限公司合成。
1. 3摇 总 RNA的提取
取感病瓜叶 0. 25 g,并以健康的瓜叶为对照,
在液氮中研磨;加入 800 滋L Trizol抽提缓冲液,将
匀浆样品在 15 ~ 30益放置 5 min,4益 12 000 rpm
离心 10 min,取上清;加 0. 2 mL 氯仿,剧烈振荡
15 s,室温放置 3 min;4益 12 000 rpm离心 10 ~ 15
min,取上清;加等体积的异丙醇,混匀,室温放置
20 ~ 30 min;4益 12 000 rpm 离心 10 min,去上清;
加 1 mL 75%乙醇(DEPC 处理过的水配制)洗涤
沉淀;4益 5 000 rpm离心 3 min,倒出液体,剩余液
体瞬时离心,用枪头吸出;室温放置晾干,加 30 滋L
RNase鄄free ddH2O,反复吹打,混匀,充分溶解
RNA。 1%琼脂糖凝胶电泳检测是否降解, - 70益
保存备用。
1. 4摇 逆转录(RT)
向 0. 2 mL的 PCR反应管中依次加入WMV鄄2
模板 RNA 5 滋L(1 ng - 1 滋g),随机引物(25滋M)
1 滋L,70益保温 10 min 后迅速在冰上冷却 2 min
以上;离心数秒使模板、RNA引物的变性溶液聚集
于管底;再加入 5 伊 M鄄MLV Buffer 2 滋L, dNTP
Mixture(各 10 滋M)0. 5 滋L,RNase Inhibitor(40 U /
滋L)0. 25 滋L,M鄄MLV RTase RNaseH (200 U / 滋L)
0. 25 滋L,加 RNase free ddH2O 到 10 滋L;30益 10
min,42益 1 h,70益 15 min 后冰上冷却,得到的
cDNA溶液直接用于 PCR扩增。
1. 5摇 PCR扩增
在 0. 2 mL 的 PCR 反应管中,加入 10 伊 Taq
DNA 聚合酶反应缓冲液 (含 Mg2 + ) 5 滋L,2. 5
mmol / L dNTP 4 滋L,10 滋mol / L 5忆和 3忆端引物各
1 滋L,逆转录产物 1 滋L,Taq DNA 聚合酶 1 个单
位,反应总体积 25 滋L。 反应程序:94益预变性 5
min;94益 30 s,47. 5益 45 s,72益 30 s,共 30 个循
环;72益 10 min。 各取 2 滋L扩增产物,经 1%琼脂
糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后,观察记录结果。
1. 6摇 SSCP分析
1. 6. 1摇 SSCP条件的优化摇 采用同一交联度不同
胶浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析,按表 2 配
制凝胶。
1. 6. 2摇 SSCP 检测 摇 取 PCR 产物 10 滋L,加等体
积载样缓冲液 (95% 去离子甲酰胺、20 mmol / L
EDTA、0. 5%溴酚蓝、0. 5%二甲苯氰),混匀后在
113
摇
植物病理学报 41 卷
Table 2摇 The preparation of PAGE gel
Gel concentration 10% 11% 12% 13% 14%
49% Acrylamide鄄1% Bis Acrylamide (mL) 20. 0 22. 0 24. 0 26. 0 28. 0
5 伊 TBE (mL) 20. 0 20. 0 20. 0 20. 0 20. 0
Free water (mL) 59. 2 57. 2 55. 2 53. 2 51. 2
10% Ammonium persulfate (mL) 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8 0. 8
TEMED (滋L) 30. 0 30. 0 30. 0 30. 0 30. 0
Total volume (mL) 100. 0 100. 0 100. 0 100. 0 100. 0
85益变性 5 min,立即冰浴几分钟,上样于非变性聚
丙烯酰胺凝胶(交联度 = 49:1,尺寸为 15 cm 伊
15 cm 伊0. 075 cm),电泳缓冲液为 1 伊 TBE,在 4益
下 200 V恒压电泳 12 ~ 18 h,银染观察结果。
2摇 结果与分析
2. 1摇 12 个WMV鄄2 分离物
用引物 WMV鄄2鄄GF / GR 对所采集的 150 个病
样进行 RT鄄PCR 扩增,初步筛选出 12 个 WMV鄄2
分离物,分别是 S1鄄S7、K1、M1、M2、KS1 和 KS2
(表 1)。
2. 2摇 PCR扩增
利用 WMV鄄2鄄GF 和 WMV鄄2鄄GR 进行 RT鄄
PCR,除阴性对照外,12 个新疆分离物均扩增到
421 bp左右的片段(图 1),和预先设计的片段大小
基本一致,彼此没有差异。
2. 3摇 RT鄄PCR 产物 SSCP 分析
经过优化 SSCP 条件,最后采用丙烯酰胺:甲
叉双丙烯酰胺 = 49:1,凝胶浓度为 12%的聚丙烯
酰胺凝胶对 12 个WMV鄄2 分离物进行 SSCP分析。
结果显示,除 KS2 分离物出现 1 条带外,其他分离
物均出现2条带,只是迁移率不同(图2 ) 。12个
Fig. 1摇 Electrophoresis of PCR products of Watermelon mosaic virus 2 isolates
M: Marker; CK: Negtive control (sterile ddH2o); 1鄄4: S1,S2,S3 and S4; 5: K1; 6: S5; 7鄄8:
M1, M2; 9鄄10: S6, S7; 11鄄12: KS1, KS2.
Fig. 2摇 Electrophoresis of SSCP products of 12 of Watermelon mosaic virus 2 isolates
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摇
摇 3 期 黄素芳,等:新疆西瓜花叶病毒 2 号遗传变异的 PCR鄄SSCP分析
分离物之间有明显差异,可归为 5 类:KS2 归为玉
类,S7 归为域类,S4 归为芋类,KS1 和 S6 归为郁
类,M1、M2、K1、S3、S5、S1 和 S2 归为吁类。 这表
明 12 个新疆的WMV鄄2 分离物之间存在着明显的
差异,有明显的地域分布性。 而且来自同一地方的
不同瓜类的分离物之间也存在明显差异,如来自石
河子的 7 个样品分属域、芋、郁和吁类,而来自玛纳
斯县、奎屯和石河子地区的 7 个样品同属第吁类,
来自喀什地区的 2 个样品分属玉和郁类,而来自玛
纳斯县的 2 个不同瓜类的样品却又同属吁类。
3摇 讨论
据 Jiang 等[3]研究报道 WMV鄄2 存在株系划
分。 Xu等[4]对新疆的WMV鄄2 进行了外壳蛋白的
研究。 Yang等[5]对从南瓜上分离得到的 WMV鄄2
进行了鉴定及外壳蛋白测序分析。 新疆从 20 世纪
八十年代开始对侵染甜瓜的 WMV鄄2 开始进行鉴
定分析和序列测定,但对其是否存在遗传变异尚未
有报道。 本文对来自石河子、玛纳斯、奎屯和喀什
地区的感染 WMV鄄2 的黄瓜、南瓜、西瓜、甜瓜和葫
芦瓜的 12 个分离物通过 RT鄄SSCP分析,结果表明
WMV鄄2 广泛发生在新疆的不同葫芦科作物上,而
且还在多个地区均有分布。 更重要的是这些分离
物之间存在明显的遗传变异,这些变异不仅表现在
地域分布上,也表现在不同的寄主上。 利用 PCR鄄
SSCP分析技术可以有效地说明 WMV鄄2 不同分离
物间的变异,但要揭示这种变异与遗传多样性的相
关性,还需要进一步检测分析和比较各基因组组
分。
参考文献
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责任编辑:李晖
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