全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 328-333(2012)
收稿日期: 2011-08-20; 修回日期: 2012-02-20
基金项目: 国家甘薯产业技术体系建设项目资助(CARS-11-B-07)
通讯作者: 张振臣,研究员,主要从事植物病毒病害研究; Tel: 0371-65711547, E-mail: zhangzhenchen@126. com。
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췍研究简报
我国发现由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒
协生共侵染引起的甘薯病毒病害
张振臣*, 乔 奇, 秦艳红, 张德胜, 田雨婷
(河南省农业科学院植物保护研究所, 郑州 450002; 河南省农作物病虫害防治重点实验室, 郑州 450002;
农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室, 郑州 450002)
First evidence for occurrence of Sweet potato virus disease (SPVD) caused by dual
infection of Sweet potato feathery mottle virus and Sweet potato chlorotic stunt
virus in China 　 ZHANG Zhen-chen, QIAO Qi, QIN Yan-hong, ZHANG De-sheng, TIAN Yu-ting
( Institute of Plant Protection, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; Henan Key Laboratory of
Crop Pest Control, Zhengzhou 450002, China; IPM Key Laboratory in Southern Part of North China for Ministry of Agriculture,
Zhengzhou 450002, China)
Abstract: Sweet potato virus disease(SPVD), the most important viral disease of sweet potato, is caused by
the synergistic interaction between Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV) and Sweet potato chlorotic
stunt virus (SPCSV) . During 2009 and 2010, vine cuttings with typical SPVD symptoms were collected from
Jiangsu, Anhui, Guangdong and Sichuan Provinces to be tested for the presence of SPCSV and SPFMV.
NCM-ELISA testing indicated that three samples reacted positively with SPFMV and SPCSV antiserum simul-
taneously. Reverse-transcription (RT) -PCR and nucleotide sequencing showed that total 10 samples were in-
fected by both SPFMV and SPCSV. Graft transmission experiments were done by side graft. Transmissions of
SPVD by grafting to virus-free sweet potato plants was achieved easily, and developed typical symptoms 30
days after graft inoculation. SPCSV and SPFMV can be detected from the diseased sweet potato plants by
grafts. To our knowledge, this is the first report of SPVD in China.
Key words: Sweet potato virus disease(SPVD); Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV); Sweet pota-
to chlorotic stunt virus (SPCSV)
文章编号: 0412-0914(2012)03-0328-06
　 　 甘薯病毒病害 ( Sweet potato virus disease,
SPVD)是由毛形病毒属(Crinivirus)的甘薯褪绿矮
化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)
和马铃薯 Y病毒属(Potyvirus)的甘薯羽状斑驳病
毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)协生
共侵染甘薯引起的病毒病害[1]。 20 世纪 70 年代
首先在非洲发现,主要分布在非洲和南美的一些国
家[1,2]。 感染 SPVD 的甘薯表现叶片扭曲、畸形、
叶片褪绿、明脉以及植株矮化等症状。 SPVD 对甘
薯产量影响极大,严重时可造成 90%以上的产量
损失,甚至绝收,是甘薯上最严重的病毒病害之
一[1]。 2010 年 Qiao 等[3]首先报道了 SPCSV 在我
　
　 3 期 　 　 张振臣,等:我国发现由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染引起的甘薯病毒病害
国的发生,并检测到多种病毒混合侵染甘薯的现
象[4]。 目前尚未见有关 SPVD 在我国发生的详细
报道。 2009 ~ 2010 年,从我国广东、江苏、四川、安
徽和福建采集了 10 份疑似 SPVD 的甘薯植株样
品,利用血清学、分子生物学和嫁接传染试验等方
法进行了鉴定,初步证明我国甘薯上已发生
SPVD。
1　 材料与方法
1. 1　 疑似 SPVD甘薯样品的采集
2009 ~ 2010 年,分别从我国广东省惠州市、江
苏省徐州市、四川省南充市、安徽省阜阳市和福建
省龙岩市各采集 2 份疑似 SPVD的甘薯植株,症状
均表现为植株矮化、叶片畸形和褪绿等(图 1、表
1),样品采回后种植于防虫温室内。
Fig. 1 　 Diseased sweet potato plants with
SPVD symptoms in field
1. 2　 检测试剂盒
SPFMV和 SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫
吸附测定(NCM-ELISA)检测试剂盒购自国际马
铃薯中心(CIP)。 UNIQ-10 柱式总 RNA抽提试剂
盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品,
AMV反转录酶、ExTaq DNA 聚合酶以及 pMD19-
T 载体购自宝生物工程(大连)有限公司。
1. 3　 引物
根据 GenBank 中登录的序列, 设计扩增
SPFMV CP基因以及 SPCSV Hsp70 基因的简并引
物[4]。 SPFMV CP 基因正向引物 FM5CP 的序列
为: 5′-CCGGGTCTRRTGAGARHACTGAATTTA-
AAGATGC-3′,反向引物 FMVCP3 的序列为:5′-
GACTCTCGAGCCTATTGCACACCCCTCATTCC-
3′,扩增片段大小为 945 bp;SPCSV Hsp70 基因正
向引 物 CSV70P1 的 序 列 为: 5′-GACGGKGG-
TACKATGAARGTCC-3′,反向引物 CSV70P2 的序
列为:5′-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-
3′,扩增片段大小为 431 bp。 引物由上海生工生物
工程技术服务有限公司合成。
1. 4　 血清学检测
利用 NCM-ELISA方法对疑似 SPVD 的甘薯
样品进行 SPFMV 和 SPCSV 的血清学检测。 分
别从甘薯植株的顶部、中部和底部叶片上取直径
1 cm的叶盘,混合研磨后点于硝酸纤维素膜上,
然后利用 NCM-ELISA 检测试剂盒对 SPFMV 和
SPCSV2种病毒进行检测,检测方法按照试剂盒
Table 1　 Serological and RT-PCR detection of SPCSV and SPFMV
Sample name Origin
NCM-ELISA RT-PCR
SPCSV SPFMV SPCSV SPFMV
Min-10-3 Longyan,Fujian Province - + + + + + +
Min-10-6 Longyan,Fujian Province - + + + + +
Su-10-32 Xuzhou,Jiangsu Province - + + + + +
Su-10-36 Xuzhou,Jiangsu Province - + + + + + +
Wan-10-4 Fuyang,Anhui Province - - + +
Wan-10-7 Fuyang,Anhui Province + + + + +
Chuan-10-60 Nanchong,Sichuan Province - + + + + + +
Chuan-10-71 Nanchong,Sichuan Province - - + +
Yue-09-26 Huizhou,Guangdong Province + + + + + + + + +
Yue-09-28 Huizhou,Guangdong Province + + + + + + +
Note: “ + ” positive results; “ - ”negative results.
923
　
植物病理学报 42 卷
使用说明书进行。 肉眼观察检测结果,阳性样品
在膜上形成紫色沉淀,阴性样品则无颜色反应。
1. 5　 RT-PCR检测
采用 RT-PCR 方法,扩增 SPFMV 的 CP 基因
和 SPCSV的 Hsp70 基因片段。 具体步骤为:首先
利用 UNIQ-10 柱式总 RNA抽提试剂盒,提取甘薯
叶片总 RNA,分别利用 FMVCP3 和 CSV70P2 引物
反转录合成 cDNA 第一链;再利用正向引物
FM5CP和 CSV70P1 进行 PCR 扩增。 PCR 反应体
系为:cDNA 2 μL、10 × ExTaq 缓冲液(含 MgCl2)
2. 5 μL、2. 5 mol / L dNTP 混合物 2 μL、正向引物
和反向引物各 2 μL、ExTaq DNA 聚合酶 (5 U /
μL) 0. 2 μL,补充 ddH2O 至总体积 25 μL。 PCR
反应条件为:94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min,
35 个循环;最后延伸 10 min。
1. 6　 PCR产物的克隆和序列测定
为了验证扩增得到的 PCR 产物为目的基因
片段,将 PCR产物进行纯化,然后分别与 pMD19-
T 载体连接,连接产物转化大肠杆菌 JM109,经蓝
白斑筛选和 PCR 鉴定后获得阳性克隆。 核苷酸
序列测定由宝生物工程(大连)有限公司完成。
利用 DNAMAN和 BLAST 对所测序列进行比较
分析。
1. 7　 嫁接传染试验
以具有典型 SPVD症状并且经血清学和 RT-
PCR检测呈阳性的甘薯植株为接穗,以经过血清
学检测和嫁接指示植物巴西牵牛检测,证明为脱
毒植株的甘薯“济薯 18”茎尖苗为砧木进行嫁接
传染试验。 嫁接后定期观察症状并进行拍照。
1. 8　 嫁接发病甘薯植株中 SPCSV 和 SPFMV 的
RT-PCR检测
分别提取嫁接发病甘薯、接穗甘薯和未嫁接健
康甘薯叶片的总 RNA,按照 1. 5 和 1. 6 中的方法,
进行 SPFMV CP基因和 SPCSV Hsp70 基因的扩增
和序列测定,以确定嫁接发病甘薯植株中是否存在
2 种病毒,以及病毒基因序列与接穗甘薯中病毒基
因序列的相似性。
2　 结果与分析
2. 1　 血清学及 RT-PCR检测结果
对采集到的 10 份具有典型 SPVD症状的甘薯
样品进行了 NCM-ELISA和 RT-PCR 检测。 NCM-
ELISA检测结果表明(表 1),供试的 10 份样品中,
有 3 份与 SPCSV 的多克隆抗体呈阳性反应,8 份
样品与 SPFMV 的多克隆抗体呈阳性反应。 其中,
采自安徽阜阳的样品Wan-10-7 和采自广东惠州的
Yue-09-26 和 Yue-09-28,3 个样品同时与 2 种抗体
呈阳性反应。 说明这 3 个样品同时感染 SPCSV和
SPFMV;RT-PCR检测结果表明(表 1),从供试的
10 份样品中,均能扩增出与 SPCSV 和 SPFMV 目
的基因片段大小一致的条带,说明 10 份疑似
SPVD 的甘薯样品可能均感染了 SPCSV 和
SPFMV 2 种病毒。
2. 2　 核苷酸序列测定结果
分别对 RT-PCR产物进行了克隆和序列测定,
结果表明,扩增出的 SPFMV 的 CP 基因与 Gen-
Bank中已发表的其他分离物 CP 基因的核苷酸序
列一致性为 77% ~ 94% ,扩增获得的 SPCSV
Hsp70 基因的核苷酸序列与其他分离物 Hsp70 基
因的一致性达 78% ~ 99% ,说明 RT-PCR 扩增所
获得的核苷酸序列分别为 SPFMV 和 SPCSV 的目
的基因序列。
选取 GenBank中登录的 SPFMV 4 个株系(O、
C、EA和 RC)以及 SPCSV 2 个株系(EA 和 WA)
有代表性的核苷酸序列,与本研究测定的序列进行
进化树分析 (表 2、图 2 ),发现我国甘薯上的
SPFMV 和 SPCSV 均存在明显的株系分化,
SPFMV存在 4 个株系类型,SPCSV 存在 2 个株系
类型。
2. 3　 嫁接传染试验结果
以具有典型 SPVD 症状并且经血清学和 RT-
PCR检测呈阳性的甘薯植株为接穗,脱毒甘薯“济
薯 18”植株为砧木进行嫁接传染试验。 结果表明,
嫁接后 7 d 脱毒甘薯“济薯 18”叶片开始出现明
脉、花叶症状,嫁接 30 d 后出现叶片褪绿、皱缩、扭
曲变形、植株矮化等典型的 SPVD 症状(图 3),说
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　 3 期 　 　 张振臣,等:我国发现由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染引起的甘薯病毒病害
明该病能通过嫁接传染。
2. 4　 嫁接发病甘薯植株中 SPCSV 和 SPFMV 的
RT-PCR检测
RT-PCR检测结果表明,从嫁接发病甘薯和接
穗甘薯中均能扩增出与 SPCSV 和 SPFMV 目的基
因大小一致的条带,而未嫁接健康甘薯中没有扩增
出相应条带。 对 RT-PCR 产物进行了克隆和序列
测定。 序列比对结果表明,从嫁接发病甘薯叶片中
Table 2　 Virus sequences used in this study
Sample or isolate name Virus Strain Geographic origin Accession number
Min-10-3
SPCSV
SPFMV
WA
O
Longyan,Fujian Province
JN131555
JN131575
Min-10-6
SPCSV
SPFMV
WA
O
Longyan,Fujian Province
JN131557
JN131577
Su-10-32
SPCSV
SPFMV
WA
O
Xuzhou,Jiangsu Province
JN131560
JN131578
Su-10-36
SPCSV
SPFMV
WA
C
Xuzhou,Jiangsu Province
JN131561
JN131579
Wan-10-4
SPCSV
SPFMV
WA
O
Fuyang,Anhui Province
JN131549
JN131569
Wan-10-7
SPCSV
SPFMV
WA
C
Fuyang,Anhui Province
JN131551
JN131571
Chuan-10-60
SPCSV
SPFMV
WA
C
Nanchong,Sichuan Province
JN131563
JN131581
Chuan-10-71
SPCSV
SPFMV
WA
EA
Nanchong,Sichuan Province
JN131566
JN131584
Yue-09-26
SPCSV
SPFMV
EA
O
Huizhou,Guangdong Province
JN131558
HM989022
Yue-09-28
SPCSV
SPFMV
EA
C
Huizhou,Guangdong Province
JN131559
HQ844082
Is SPCSV WA Israel EU124487
Egypt1 SPCSV WA Egypt AJ515381
Nigeria clon2 SPCSV WA Nigeria AJ278653
Nigeria clon1 SPCSV WA Nigeria AJ278652
B4 SPCSV WA Spain EF667069
Hoima1c SPCSV EA Uganda DQ864357
Iganga1 SPCSV EA Uganda DQ864358
Bongoma SPCSV EA Kenya DQ864370
Kabale7d SPCSV EA Uganda DQ864359
Bag SPCSV EA Tanzania AJ783445
Ordinary SPFMV O Japan AB465608
S SPFMV RC Japan D86371
Piu3 SPFMV EA Peru FJ155666
Bungo SPFMV C Japan AB509453
SPFMV: Common (C), East-African (EA), ordinary (O), and russet crack (RC) strains.
SPCSV: East-African (EA), and West-African (WA) strains.
133
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 2　 Phylogenetic trees of partial nucleotide sequence of heat shock protein 70 homologue
(Hsp70h) gene of SPCSV(A)and coat protein (CP) gene of SPFMV(B)
The sequence of an isolate of Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV, accession number AY580981)
and Sweet potato vein mosaic virus isolate Henan (SPVMV-HN, accession number FJ687211) were
used as an out group respectively. The number beside each node indicates bootstrap value,
which was obtained based on 1 000 replications.
Fig. 3　 Healthy sweet potato plant ( left) and
diseased sweet potato plant by grafts
(right)
扩增出的 SPFMV CP 基因和 SPCSV Hsp70 基因
与接穗甘薯叶片中扩增出的相应基因的核苷酸序
列一致性均达 99%以上,说明嫁接发病甘薯和接
穗甘薯中的病毒为同一病毒。
3　 讨论
根据症状观察、血清学和分子生物学鉴定以及
嫁接传染试验等方法,初步证明我国甘薯上已发生
SPVD。 这是我国甘薯上发现 SPVD 的首次报道。
SPVD是由 SPCSV 和 SPFMV 协生共侵染甘薯引
起的病毒病害。 研究表明,SPCSV和 SPFMV单独
侵染甘薯时,甘薯只出现轻微的症状,当 SPCSV和
SPFMV 复合侵染甘薯时,甘薯出现叶片扭曲、皱
缩、畸形、明脉和植株矮化等严重症状,而且
SPFMV的含量比其单独侵染时增加 600 倍,但
SPCSV的含量不变化或比其单独侵染时降低,推
测 SPCSV能增强 SPFMV 的复制[5]。 本研究在利
用血清学检测时,10 份样品中有 8 份呈 SPFMV阳
性,只有 3 份呈 SPCSV阳性,也说明了甘薯植株中
SPFMV的含量较高,更容易被检测到。 在用 RT-
PCR检测时,10 份样品均同时检测到了 2 种病毒
的存在,与血清学检测结果并不一致,这可能是
RT-PCR检测方法更加灵敏的缘故。
本项研究采集的甘薯样品分别来自广东、江
苏、四川、安徽和福建,这些省份都是我国甘薯的主
要产区,说明 SPVD在我国已有较广泛的分布。 虽
然有些甘薯病毒样品采自科研单位的试验田或育
苗圃,但由于甘薯是无性繁殖作物,病毒容易随种
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　 3 期 　 　 张振臣,等:我国发现由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染引起的甘薯病毒病害
薯、种苗进行远距离传播。 因此,有必要加强对该
病的监测和预警,防止病害进一步蔓延。
致谢:国家甘薯产业技术体系的岗位科学家和试验
站站长协助样品采集。
参考文献
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virus disease ( SPVD): Distribution, incidence, and
effect on sweet potato yield in Peru [ J ] . Plant
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于金枝
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