全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 314鄄318(2011)
收稿日期: 2009鄄12鄄30; 修回日期: 2010鄄11鄄10
基金项目: 国家留学基金委资助项目; 国家科技支撑计划(2006BAD01A7鄄2鄄05); 辽宁省自然科学基金项目(20082129)
通讯作者: 李海涛,博士,研究员, 主要从事番茄育种研究; E鄄mail: haitao57@sohu. com。
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研究简报
番茄抗晚疫病 Ph鄄3 基因 RAPD标记
的克隆与 CAPS标记的建立
邹庆道1, 吴媛媛1,2, 李海涛1*, 张子君1, 吕书文1, 杨国栋1
( 1辽宁省农业科学院蔬菜研究所, 沈阳 110161; 2辽宁省农业科学院经济作物研究所, 辽阳 111000)
Clone and development of RAPD and CAPS markers of Ph鄄3 gene resistant to Phyto鄄
phthora infestans 摇 ZOU Qing鄄dao1, WU Yuan鄄yuan1,2, LI Hai鄄tao1, ZHANG Zi鄄jun1, L譈
Shu鄄wen1,YANG Guo鄄dong1 摇 ( 1Vegetable Research Institute, Liaoning Academy of Agriculture Sciences, Shenyang
110161, China; 2Economic Crops Research Institute,Liaoning Academy of Agriculture Sciences,Liaoyang 111000,China)
Abstract: A RAPD fragment linked to Ph鄄3 gene was cloned in the study. According to the sequencing re鄄
sult, SCAR primer was designed. A 592 bp fragment was amplified in resistant and susceptible parents,resis鄄
tant and susceptible bulks,F1 individuals and F2 plants ,and then the PCR products were digested with restric鄄
tion enzyme XbaI. Susceptible genotypes and heterozygous resistant genotypes could produce respectively 261,
193,95 bp and 592,261,193,95 bp bands. Homozygous resistant genotypes still presented 592 bp fragment.
These DNA bands which could distinguish resistant materials,susceptible materials,F1 individuals and F2 plants
successfully and they could be CAPS markers for Ph鄄3 gene.
Key words: tomato; late blight; gene Ph鄄3; CAPS marker
文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0314鄄05
摇 摇 目前,番茄晚疫病(Phytophthora infestans)在
世界各番茄主产区普遍发生,并造成严重的经济损
失,已经成为番茄生产的主要障碍之一。 防御番茄
晚疫病最有效的方法是培育抗病品种。 依靠常规
方法耗时、耗力,同时由于人为鉴定标准的差异,会
直接影响鉴定结果,延长育种周期,分子标记技术
的发展为解决此问题提供了可能。 分子标记可被
用于在苗期进行大量的抗病鉴定,不受时间、地域
的限制,从而加速育种工作进程[1]。 Qiu 等[2]已找
到 1 条与抗晚疫病 Ph鄄3 基因连锁的 RAPD 标记,
本研究旨在将此 RAPD 标记转化为稳定的 CAPS
标记,为抗晚疫病分子辅助选择育种(MAS)奠定
良好的基础。
1摇 材料与方法
1. 1摇 试验材料
试材为抗病亲本 CLN2037,感病亲本 T2鄄03
及其建立的 F1、F2 代群体。 CLN2037 含抗病基因
Ph鄄3,由亚蔬中心提供;T2鄄03 不含抗晚疫病基因,
高感番茄晚疫病生理小种 T1,由辽宁省农业科学
院蔬菜所提供。
1. 2摇 试验方法
1. 2. 1摇 接种鉴定及抗、感池建立摇 抗病鉴定及病
害分级标准参照 Qiu等的方法[2]。 从 F2 代单株中
选择 10 株病害级别为 0 的单株建抗病池,8 株病
摇
摇 3 期 邹庆道,等:番茄抗晚疫病 Ph鄄3 基因 RAPD标记的克隆与 CAPS标记的建立
害级别为 6 的单株建感病池。
1. 2. 2摇 叶片 DNA的提取摇 参照 Williamson 等[3]
的方法,由 CTAB法提取。
1. 2. 3摇 RAPD 体系 摇 RAPD 分析的 PCR 反应体
系为:在 25 滋L反应体系中,2. 0 滋L dNTP,2. 0 滋L
Mg2 + ,0. 25 滋L Taq酶,5 滋L DNA(5 ng·滋L - 1),
2. 5 滋L primer(2 pmol·滋L - 1 ),2. 5 滋L 10 伊 buf
fer,10. 75 滋L水,上覆 10 滋L矿物油。 PCR扩增程
序为:94益预变性 5 min,94益变性 1 min,32益复性
1 min,72益延伸 1. 5 min,45 个循环,72益延伸
10 min。 扩增产物于 1. 5%的琼脂糖凝胶中电泳
检测[2]。
1. 2. 4摇 RAPD 特异片段的克隆、测序和 SCAR 引
物的设计、扩增 摇 利用 DNA 快速回收试剂盒,从
1. 5%琼脂糖凝胶中回收 RAPD 特异片段,纯化后
pMD18鄄T载体连接,转化感受态大肠杆菌 JM109,
蓝白斑筛选阳性克隆。 提取阳性克隆质粒 DNA,
用 EcoRI和 Hind芋双酶切鉴定重组质粒 DNA。 当
酶切鉴定出目的 DNA 片段后,用新鲜菌液或纯化
的质粒 DNA 进行测序,测序由大连宝生物完成。
根据测序结果,利用 DNAMEN 软件设计出 1 对
SCAR标记的特异引物。 反应条件为:在 25滋L 反
应体系中,2. 0 滋L dNTP,1. 2 滋L Mg2 + ,0. 25 滋L
Taq酶,5 滋L DNA(5ng·滋L - 1 ),2. 5 滋L primer
(2 pmol·滋L - 1 ),2. 5 滋L 10 伊 buffer,11. 55 滋L
水,上覆 10 滋L矿物油。 PCR 扩增程序为:94益预
变性 5 min,94益变性 1 min,62益复性 1 min,72益
延伸 1. 5 min,35 个循环,72益延伸 10 min。 扩增
产物于 1. 5%的琼脂糖凝胶中电泳检测。 同时利
用所合成的 SCAR 引物对亲本、抗感池及 F1 个体
进行扩增验证。
1. 2. 5摇 限制性内切酶 Xba玉酶切反应摇 20 滋L 体
系,10滋L PCR扩增产物,2. 4 滋L 10 mol / L,1. 2 滋L
XbaI,2. 4滋L 1% BSA,用 ddH2O 补足体积。 37益
保温 2. 0 h,然后加入 loading buffer 终止反应,用
3%琼脂糖凝胶在 120 V·cm - 1电压条件下电泳
22 ~ 27 min,用 Goldview 染色,紫外凝胶成像系统
拍照。
1. 2. 6摇 数据分析摇 通过抗病鉴定与电泳检测结果
的比较,利用 MapMaker 3. 0 软件分析得出连锁
距离。
2摇 结果与分析
2. 1摇 抗病性鉴定
抗病亲本材料 CLN2037 病级指数为 0. 1,表
现高抗,感病亲本材料 T2鄄03 病级指数为 6. 0,表
现高感,F1 材料的病级指数为 2. 1,表现高抗。 F2
代单株 220 株,抗病单株为 154 株,感病单株为 66
株。 经适合性检验,字2C = 2. 39 < 字20. 05 = 3. 84,抗病
与感病植株分离符合 3颐 1 的比例。
2. 2摇 特异片段的回收、克隆和测序
随机引物 CCPB272鄄03(序列为 GGTCGATC鄄
TG)在抗病亲本、抗感池中均扩增出 1 条 740 bp
左右的差异性片段,经大连宝生物测序后得到该片
段的实际大小为 709 bp(包括两端的 RAPD 引物
序列),命名为 CCPB272鄄03740,见图 1。 该序列输
入 NCBI(national center biotechnology information)
核酸数据库作 BLAST分析,未发现与 GenBank 中
已有序列有较高的同源性。
2. 3摇 SCAR引物设计及 SCAR标记的获得
根据测序结果以及引物设计原则,利用 DNA鄄
MEN软件设计出了 1 对 20 和 21 个碱基的核苷酸
引物。 Sense primer P1:5忆鄄TGAAGCTTTGACAT鄄
GACGCC鄄3忆; Antisense primer P2: 5忆鄄GATCT鄄
GAGGGAACTGGCCTTC鄄3忆。 为了确定这对引物
的特异性,对供试植株进行了 PCR 扩增,因此,本
试验中共设计了 6 个退火温度梯度和 6 个Mg2 +浓
度梯度,来达到优化反应程序的目的。 最终确定退
火温度为 62益, Mg2 +浓度为 1. 2 mmol / L, 循环数
为 35 时,可以实现稳定扩增,反应的其他条件没有
改变。 用设计的特异引物在亲本、抗感池、F1 个体
及 F2 抗感单株上进行 PCR 扩增,结果表明,均能
稳定扩增出 1 条大小为 592 bp 左右的特异片段见
图 2 和图 3。
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植物病理学报 41 卷
Fig. 1摇 Nucleotide sequence of the CCPB272鄄03740( the framed part
is the sequence of RAPD primer CCPB272鄄03)
Fig. 2 摇 PCR amplification with SCAR primer
in parents, resistant and susceptible
bulks and F1 individual of tomato
M: Marker; 1: Resistant parent; 2: Susceptible parent; 3:
Resistant bulk; 4: Susceptible bulk; 5: F1 individual.
2. 4摇 Ph鄄3 基因 CAPS标记的获得
分别对抗感材料产生的 592 bp 片段进行测
序,之后利用 DNAMEN软件对上述 2 个片段进行
内切酶的酶切位点查询。 结果表明,二者有差异的
酶有 Bsu36玉、Cvn玉、Sau玉、Mst域和 Xba玉,因前
4 种酶不常用,故本试验采用 Xba玉进行酶切。 感
病材料产生的片段有 2 个 Xba玉酶切位点,利用该
酶可获得长度分别为 261、193 和 95 bp 的 3 个片
段,而抗病材料产生的片段无 Xba玉酶切位点,见
图 4。 据此推测,利用酶切位点的多态性有可能获
得 Ph鄄3 基因的特异分子标记[4]。
本研究中,利用限制性内切酶 Xba玉对特异扩
增片段进行酶切,电泳检测结果见图 5 和图 6。 感
Fig. 3摇 PCR amplification with SCAR primer in parents,F1 and part F2 plants of tomato
M: Marker; 1: Resistant parent; 2: Susceptible parent; 3: F1 individuals; 4鄄17: F2 plants.
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摇 3 期 邹庆道,等:番茄抗晚疫病 Ph鄄3 基因 RAPD标记的克隆与 CAPS标记的建立
Fig. 4摇 Comparison of cleavage site in resistant and susceptible material
A: Susceptible material, B: Resistant material. The framed part is the difference.
Fig. 5摇 Enzyme digestion of PCR products
M: Marker; 1: Resistant parent; 2: Susceptible parent; 3:
Resistant bulk; 4: Susceptible bulk; 5: F1 individuals.
病基因型和杂合抗病基因型酶切后分别产生了
261、193 和 95 bp以及 592、261、193 和 95 bp 的特
异性片段(100 bp 以下片段较难分辨),纯合抗病
基因型酶切结果仍为 592 bp的产物。 该标记在 F2
分离群体中表现了与 CCPB272鄄03740一致的分离,
与 Ph鄄3 的连锁距离为 5. 8 cM,为抗晚疫病分子标
记辅助选择奠定基础。
3摇 讨论
近年来,随着分子技术的迅速发展,利用分子
标记辅助育种已极大地加快了育种速度。 国内外
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植物病理学报 41 卷
Fig. 6摇 Enzyme digestion of PCR products in part F2 plants
M: Marker; 1: Resistant parent; 2: Susceptible parent; 3: F1 individuals; 4 -10: F2 resistant homozygous Individuals;
11 -14: F2 resistant heterozygous individuals; 15 -17: F2 Susceptible individuals
已获得了多个与番茄抗病基因紧密连锁的标记,这
都为番茄分子辅助育种提供了有利的工具。 CAPS
标记作为 PCR 和酶切技术相结合的分子标记技
术,可以从单个碱基的差异进行分别,比 RFLP、
AFLP等标记快速、简便,与 RAPD、 ISSR 等 PCR
标记相比,稳定性和特异性更强[5]。
摇 摇 本试验将已获得的与番茄抗晚疫病基因紧密
连锁的 RAPD标记转化成 CAPS标记,从上述试验
结果看,此 CAPS标记稳定、可靠,成为分子育种的
有利辅助工具。 经 Xba玉酶切后的 95 bp 的小片
段有时难以观察到,究其原因可能是使用了扩增产
物酶切,DNA 量较少,酶切后小片段 DNA 浓度较
低所致,但这并不影响对植物抗性的鉴定。
参考文献
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责任编辑:曾晓葳
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