全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(4): 445-448(2012)
收稿日期: 2010-08-09; 修回日期: 2012-02-08
基金项目: 山西省科技攻关项目(20090311028); 山西农业大学科技创新基金项目(2006021)
通讯作者: 王金胜, 教授, 博士生导师, 主要从事植物生物化学研究; E-mail: sxndwjs@163. com。
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췍研究简报
万寿菊杀菌素Ⅰ抗菌性及其对西瓜枯萎病菌
作用机理的初步研究
范志宏1, 郭春绒1, 王金胜2*
( 1山西农业大学文理学院, 太谷 030801; 2山西农业大学生命科学学院, 太谷 030801)
Antifungal activity of marigold fungicide I and its mechanism on Fusarium oxyspo-
rum f. sp. niveum 　 FAN Zhi-hong1, GUO Chun-rong1, WANG Jin-sheng2 　 ( 1College of Arts and
Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University,
Taigu 030801, China)
Abstract: Marigold fungicide I was studied about the antifungal activity on several pathogenic fungi and the
mechanism against Fusarium oxysporum f. sp. niveum (FON), synthetic analogue of extracts of Tagetes pat-
ula root. The results showed that marigold fungicide I remarkably inhibited the mycelial growth of several
pathogenic fungi, which possessed the content and time effects on Fusarium oxysporum schlecht. f. sp. niveum,
Phytophthpra capsici Loen, Botrytis cinerea Pers. and Fulvia fulva (Cookee) Ciferri, threshold effects on Fu-
sarium oxysporum f. sp. capsici and Gibberella zeae(Schw. )Petch and content effects on Glomerella gossypii
(Southw. )Edgertin. Marigold fungicide I was applied on FON and manifested the following findings: re-
duced the dry weight of mycelium, amplified membrane permeability, shortly increased chitinase activity, but
no change of POD isozyme. The electrophoresis of total protein by SDS- PAGE showed that marigold fungi-
cide I apparently affected the species and expression amounts of protein of FON.
Key words: marigold fungicide I; watermelon Fusarium wilt; mechanism; antifungal activity
文章编号: 0412-0914(2012)04-0445-04
　 　 西瓜枯萎病又称萎蔫病或蔓割病,是一种世界
性瓜类土传病害。 自 1894 年在美国南卡罗来纳州
首次发现以来,目前几乎发生于世界各个西瓜产
区,严重威胁着西瓜的安全生产,是西瓜的主要病
害之一[1]。 近几年来,由于西瓜种植面积不断扩
大,造成轮作困难,致使枯萎病的危害也逐年加
重[2]。 研究表明[3],万寿菊根的提取物对西瓜枯
萎病菌有明显的抑制作用,能诱导西瓜保护酶活性
提高而减轻西瓜枯萎病菌对西瓜幼苗的毒害作用,
在鉴定了万寿菊中对西瓜枯萎病菌的抑菌活性成
分为精油及其组成并且合成了万寿菊杀菌素Ⅰ
(中国发明专利) [4]的基础上,本文研究万寿菊杀
菌素Ⅰ对多种植物源病原菌的抑菌作用,探讨其对
西瓜枯萎病菌的作用机理。 以期为开发新的防治
西瓜枯萎病的植物源农药提供理论基础和科学
依据。 　 　
1　 材料与方法
1. 1　 供试病菌材料与试剂
西瓜枯萎病菌 ( Fusarium oxysporum f. sp.
niveum)、辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp.
　
植物病理学报 42 卷
capsici)、 辣 椒 疫 霉 病 菌 ( Phytophthpra capsici
Loen. )、 棉 花 炭 疽 病 菌 [ Glomerella gossypii
(Southw. )Edgertin]、小麦赤霉病菌[Gibberella zeae
(Schw. ) Petch]、番茄灰霉病菌 (Botrytis cinerea
Pers. )、番茄叶霉病菌[Fulvia fulva (Cookee) Cifer-
ri]由山西农业大学植物病理学系提供。 将菌种接
种到 PDA固体培养皿内,25℃无光倒置进行繁殖。
万寿菊杀菌素Ⅰ由本课题组合成(药剂);3,5-
二硝基水杨酸(DNS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、
丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺(北京鼎国生物技术有限
责任公司,AR)。
1. 2　 药效试验
将菌种接种到含药剂浓度为 0. 01 μg·mL -1
(TR1)、0. 05 μg·mL -1 (TR2)、0. 1 μg·mL -1
(TR3)、0. 5 μg·mL -1 (TR4)、0. 8 μg·mL -1
(TR5)、1 μg·mL -1 (TR6)的 PDA 固体培养基
上,25℃培养 36、48 h 后记录菌丝生长直径,计算
相对抑制率。
相对抑制率 =对照菌丝生长直径-处理菌丝生长直径对照菌丝生长直径 ×
100%
1. 3　 万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌膜透性的
影响
往 10 μg·mL -1药剂培养基中加入西瓜枯萎
病菌,取 2 mL 培养液离心后加双蒸水,立即测定
电导率的本底值 Jo,然后于不同时间测定电导率
Jt。 取处理沸水中煮沸 15 min,冷却至室温后测定
电导率 Js。
某时间的相对渗透率 =
某时间的电导率(Jt) -零时间的电导率(Jo)
煮沸后的电导率(Js) -零时间的电导率(Jo) ×
100%
1. 4　 西瓜枯萎病菌几丁质酶活性的测定
西瓜枯萎病菌在含 10 μg·mL -1药剂培养基
中培养 3 d后,取 0. 5 mL培养液加 2 mL磷酸盐缓
冲液、0. 5 mL 几丁质胶体,37℃水浴 1 h。 对照管
提前煮沸灭活。 离心后取 2 mL上清液,加 1. 5 mL
DNS试剂,沸水浴 5 min,冷却至室温,544 nm 下
测量同一时间点 OD值。
1. 5　 西瓜枯萎病菌过氧化物酶的电泳测定[5]
西瓜枯萎病菌在含 10 和 20 μg·mL -1的药剂
培养基中 25℃培养 5 d,过滤,无菌水洗涤菌丝体,
除去水份后冷冻储存。 在 0. 4 g 菌丝中加入 2 mL
Tris-HCl浸提液,加少许石英砂,冰浴研磨,离心后
取上清液备用。
分离胶浓度 7. 5% ,浓缩胶浓度 2. 5% ,电极缓
冲液 Tris-甘氨酸缓冲液,用溴酚蓝作指示剂,双板
电泳,每个样品槽加样 50 μL,浓缩胶电压 80 V,进
入分离胶后改为 120 V,联苯胺法染色。
1. 6　 西瓜枯萎病菌总蛋白的电泳测定
取西瓜枯萎病菌菌丝接种到含 10 和 20 μg·
mL -1的药剂培养基中,25 ℃培养 5 d,过滤,无菌
水冲洗菌丝,除去水份后冷冻储存。 未加药剂处理
菌丝作为对照。 取 1 g 菌丝加石英砂和 Tris-HCl
浸提液冰浴中研磨至糊状,离心后取上清液加等体
积的蔗糖溶液混匀,冷冻储存即为电泳样品液。 分
离胶浓度 10% ,浓缩胶浓度 5% ,点样量为 5 μL,
样品在浓缩胶中用 80 V 电压,进入分离胶后调至
160 V进行电泳,银染。
2　 结果与分析
2. 1　 万寿菊杀菌素Ⅰ对各种供试病原菌菌丝生
长的影响
万寿菊杀菌素Ⅰ(表 1)对西瓜枯萎病菌、辣椒
疫霉病菌、番茄灰霉病菌和番茄叶霉病菌的抑制作
用,随着药剂浓度的增大抑制作用增强,随着时间
的延长抑制作用减弱,说明既有浓度效应又有时间
效应;万寿菊杀菌素Ⅰ低浓度时对辣椒枯萎病菌和
小麦赤霉病菌抑制作用变化不大,浓度大于 0. 1
μg·mL -1时抑制作用明显,随着时间的推移抑制
作用变化不明显,可能有阈值效应;万寿菊杀菌素
Ⅰ对棉花炭疽病菌的抑制具有浓度效应,时间效应
不明显。 万寿菊杀菌素Ⅰ具有较好的抑菌作用。
2. 2　 万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌膜透性的
影响
万寿菊杀菌素Ⅰ作用于西瓜枯萎病菌丝体后,
病原菌细胞膜通透性增大(图 1),药剂对西瓜枯萎
病菌膜透性产生一定影响。
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　 4 期 　 　 范志宏,等:万寿菊杀菌素Ⅰ抗菌性及其对西瓜枯萎病菌的作用机理的初步研究
Table 1　 Effect of marigold fungicide I on mycelial growth of Fusarium oxysporum f. sp.
niveum at different incubation time and different concentrations
Different
fungus
Time / h
Inhibition rate / %
TR1 TR2 TR3 TR4 TR5 TR6 EC50 / μg·mL -1
Fusarium oxysporum f. sp. niveum
36 55. 8 61. 9 75. 3 80. 6 91. 2 100. 0 0. 007
48 50. 2 51. 1 56. 1 62. 4 68. 1 74. 6 0. 009
F. oxysporum f. sp. capsici
36 45. 1 55. 5 70. 1 79. 2 90. 3 100. 0 0. 025
48 44. 9 53. 3 69. 5 75. 4 89. 5 100. 0 0. 032
Phytophthpra capsici Loen.
36 25. 4 58. 4 100. 0 100. 0 100. 0 100. 0 0. 046
48 22. 3 40. 5 61. 9 72. 8 76. 1 81. 9 0. 085
Glomerella gossypii(Southw. ) Edgertin
36 30. 2 45. 8 56. 4 60. 2 63. 8 65. 2 0. 075
48 32. 2 44. 2 55. 8 60. 7 63. 5 66. 3 0. 070
Gibberella zeae (Schw. ) Petch
36 42. 5 45. 7 75. 9 81. 2 73. 6 68. 2 0. 060
48 43. 1 46. 0 77. 4 83. 5 76. 1 69. 1 0. 055
Botrytis cinerea Pers.
36 43. 5 64. 1 80. 3 89. 5 95. 4 100. 0 0. 030
48 38. 9 55. 3 74. 1 80. 2 85. 3 90. 3 0. 035
Fulvia fulva (Cookee) Ciferri
36 61. 3 71. 2 81. 2 83. 3 85. 1 86. 1 0. 006
48 34. 8 50. 7 55. 1 59. 4 63. 7 66. 5 0. 043
Fig. 1　 Changes of membrane permeability of
Fusarium oxysporum f. sp. niveum
2. 3　 几丁质酶的活性变化
经过万寿菊杀菌素Ⅰ处理的西瓜枯萎病菌分
泌的几丁质酶活性稍高于对照(图 2),病菌细胞壁
受到一定程度的破坏。
2. 4　 万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌过氧化物
酶谱带的影响
在含药培养基上生长的西瓜枯萎病菌过氧化
物酶的条带数与对照相比(图 3),没有条带数的增
减,万寿菊杀菌素Ⅰ对 POD同工酶没有影响。
Fig. 2　 Changes chitinase activity of Fusarium
oxysporum f. sp. niveum
　 　 试验中随着药剂浓度的增加,分子量高的区
域,蛋白含量增加,条带清晰;在小分子量区域,蛋
白含量减少,条带变浅,出现了条带的缺失(图 4)。
万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌蛋白表达种类和
表达量产生影响。
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植物病理学报 42 卷
Fig. 3 　 Electrophoretogram of POD isozyme
of Fusarium oxysporum f. sp. nive-
um
CK: The mycelium grown in the medium without fungicide;
Lane 1: The mycelium grown in the medium with 10 μg·
mL -1 marigold fungicide Ⅰ 3 d; Lane 2: The mycelium
grown in the medium with 20 μg·mL -1 marigold fungicide
Ⅰ 3 d.
2. 5　 万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌总蛋白表
达的影响
Fig. 4 　 SDS- PAGE electrophoretogram of
total protein
CK: Natural mycelium; Lane 1: Mycelium cultured in 10 μg
·mL -1 marigold fungicide Ⅰ after 5 d; Lane 2: Mycelium
cultured in 20 μg·mL -1 marigold fungicide Ⅰ after 5 d.
3　 结论与讨论
试验中,万寿菊杀菌素Ⅰ对供试的 7 种植物致
病菌均有一定程度的抑制,并且对不同的病菌表现
出不同的作用效应;对菌丝细胞膜的破坏作用表现
出时间依赖性。 经过药剂处理后西瓜枯萎病菌的
几丁质酶活性增大,病菌细胞壁受到一定程度的破
坏;POD同工酶表达的种类没有变化。 细胞内一
些蛋白质表达量水平的高低产生变化,高分子量的
蛋白表达增多,小分子量蛋白表达减少,并伴有条
带的缺失,西瓜枯萎病菌在万寿菊杀菌素Ⅰ的作用
下,为适应环境的变化,蛋白表达的种类和数量都
产生了变化。 总之,万寿菊杀菌素Ⅰ从生长、代谢、
分子水平对西瓜枯萎病菌产生了影响,但具体的作
用机理还有待于进一步研究。
参考文献
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oxysporum f. sp. niveum ( in Chinese) [ J] . China
Watermelon and Muskmelon (中国西瓜甜瓜), 2004,
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[2] 　 Fang Z H, Guo C R, Wang J S. Active antifungal
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Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its mechanism
( in Chinese) [ J] . Acta Phytopathologica Sinica (植
物病理学报), 2010, 40 (2): 195 -201.
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extract from root of Tagetes patula on watermelon
resistance against Fusarium wilt disease ( in Chinese)
[J] . Acta Phytopathologica Sinica (植物病理学报),
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tain antiseptic and its synthesis method[P] . Chinese,
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[5] 　 Wang J S. Research technology of agricultural bio-
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责任编辑:曾晓葳
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