全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41(6): 640-644(2011)
收稿日期: 2010-12-17; 修回日期: 2011-08-10
基金项目: 农业部公益性行业科研专项(nyhyzx07-051)
通讯作者: 张仲凯,研究员,主要从事植物病毒学研究; Tel: 0871-5183204, E-mail: zhongkai99@sina. com。
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췍研究简报
云南水稻上检测到南方水稻黑条矮缩病毒
丁 铭1, 尹跃艳2, 方 琦1, 韦加贵3, 顾中量4,
李红祥5, 卢 训1, 赵 健1, 张仲凯1*
( 1云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 昆明 650223; 2 云南省农业科学院高山经济植物研究所, 丽江 674100;
3 文山州富宁县植保站, 富宁 663400; 4 德宏州植保站, 潞西 678400; 5 西双版纳州植保站, 景洪 666100)
Detection of Southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV) in rice in Yunnan
Province DING Ming1, YIN Yue-yan2, FANG Qi1, WEI Jia-gui3, GU Zhong-liang4, LI Hong-xiang5,
LU Xun1, ZHAO Jian1, ZHANG Zhong-kai1 ( 1 Biotechnology and Genetic Gerplasm Resources Institute, YAAS,
Kunming 650223, China; 2The Institute of Alpine Economic Plant, YAAS, Lijiang 674100, China; 3Plant Protection Station of
Funing County , Funing 663400, China; 4Plant Protection Station of Dehong State; Luoxi 678400, China; 5Plant Protection Sta-
tion of Xishuangbanna State, Jinghong 666100, China)
Abstract: Rice samples showing symptoms similar to the disease caused by Southern rice black streaked
dwarf virus (SRBSDV, Genus Fijivirus, Family Reoviridae) collected from three municipalities of southern
Yunnan were detected by electron microscopy and RT-PCR. Electron microscopy observation of crude infected
leaf extracts after negative staining revealed spherical particles of 70 - 75 nm, and about 411 bp fragment of
RT-PCR shared 97. 6% - 100% nucleotide identities with reported capsid protein gene of SRBSDV isolates.
The phylogenetic tree based on the partial capsid protein gene sequences indicated that the virus causing rice
dwarf in Yunnan should be identified as SRBSDV.
Key words: Yunnan Province; rice; Southern rice black streaked dwarf virus; RT-PCR
文章编号: 0412-0914(2011)06-0640-05
南方水稻黑条矮缩病 ( Southern rice black
streaked dwarf disease)是我国南方稻区一种新的
水稻病毒病害。 自 2001 年在广东省阳西县首次发
现以来,该病危害范围逐年扩大,2009 年我国湖
南、江西、广东、广西、海南、浙江、福建、湖北和安徽
9 个水稻主产省(区)及越南北部 19 个省发病面积
约 33. 33 万 hm2,基本绝收面积 0. 67 万 hm2 [1, 2],
对水稻生产威胁巨大。
南方水稻黑条矮缩病毒( Southern rice black
streaked dwarf virus, SRBSDV)是由周国辉等鉴定
和命名的经由白背飞虱传播为害禾本科作物和杂
草的病毒新种,属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐
济病毒属(Fijivirus)。 SRBSDV 病毒粒子呈球状,
直径约 70 ~ 75 nm,病毒基因组由 10 个线状 dsR-
NAs片段组成,这些 dsRNAs 片段大小范围在 1. 4
kb ~ 4. 5 kb 之间,根据其大小分别命名为 S1-
S10[3]。
云南地处我国西南边陲,由高山与盆地相间组
成的独特地理地貌特征造就了特有的植物病原微
生物种间和种内的生物多样性。 根据其地理位置,
相邻区域发生的病虫害极易传播至云南省内,尤其
是迁徙性昆虫扩散引起的病虫害更为突出。 近年
6 期 丁 铭,等:云南水稻上检测到南方水稻黑条矮缩病毒
来,云南南部及中部稻区自 3 ~ 8 月份受境外越冬
虫源地灰飞虱、白背飞虱及褐飞虱的危害较为严
重,局部低海拔区域,如西双版纳州、德宏州、临沧
市、文山州以及红河州等,气候环境周年适合于多
种病虫草害的发生流行。 本研究通过发病植株典
型症状描述、电镜负染色法观察病样粗汁液病毒粒
子形态及 RT-PCR方法,对云南不同地区的样品进
行了检测鉴定,为该病害的发生流行提供了快速、
准确、科学的病毒检测方法。
1 材料与方法
1. 1 水稻病株
2010 年 8 月,分别在云南省文山州富宁县、西
双版纳州景洪市和德宏州盈江县水稻田中采集到
水稻病株,症状类似南方水稻黑条矮缩病[3],主要
表现为病株矮化、叶色浓绿、上部新生叶片基部皱
褶,病株节部有倒生须根及高节位分枝,茎秆表面
有蜡点状、纵向排列成条形或不规则形的的白色瘤
状突起,稻穗较少且无灌浆籽粒。 发病田块病株率
5% ~ 40% ,部分重病田块,病株率达到 90% ~
95% 。
采集的病株样品移栽种植于防虫温室中保存
备用。 随机挑选典型症状病株进行编号,文山州样
品编号为 WS-1、WS-4、 10YV975-1、 10YV974-3、
10YV973-5;西双版纳州样品编号为 10YV995-1、
10YV995-2;德宏州样品编号为 10YV1028-1、
10YV1028-2。
1. 2 病毒粒子形态观察
参照 Zhang等[4]的方法进行样品粗汁液负染
色,置于 JEM100CX-Ⅱ型透射电子显微镜观察。
1. 3 RT-PCR检测
根据 GenBank数据库报道的 SRBSDV 基因组
S10 核苷酸序列设计合成一对用于检测外壳蛋白
基因部分序列的引物:SRBSDV105 (5′- CAA CCG
ACC AAC AAT CAC A-3′)和 SRBSDV515 (5′-
ACT TCT AAA CCG TCA GCG G -3′)。 采用
RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen 公司)提取植物总
RNA。 以反向引物 SRBSDV515 为起始引物,合成
病毒基因组 RNA的 cDNA第一链。 20 μL反转录
体系包含 5 × 反转录酶 buffer 4 μL、10 mmol / L
dNTP 1 μL、 10 μmol / L 反向引物 SRBSDV515
1 μL、RNASIN 0. 5 μL、M-MLV 逆转录酶 ( Pro-
mega公司)1 μL、RNA模板 5 μL 和 DEPC 水 7. 5
μL。 逆转录步骤参照厂家说明书。 PCR反应体系
50 μL,其中含超纯水 36. 7 μL、10 × PCR buffer 5
μL、10 mmol / L dNTPs 1 μL、反转录产物 5 μL、
Taq酶(宝生物(TaKaRa)工程(大连)有限公司)
0. 3 μL、10 μmol / L SRBSDV105 和 SRBSDV515
引物各1 μL。 反应程序为 94℃变性 2 min 后,
94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 30 s,30 个循环;最后
72℃延伸10 min。
1. 4 序列克隆、测定和分析
PCR产物经 1. 0% (w / v)琼脂糖凝胶电泳分
离,用 QIAquick Gel Extration Kit 回收目标条带,
纯化产物克隆到 pGEM-T 载体中,转化大肠杆菌
DH5α感受态细胞,方法参照厂家说明。 PCR法筛
选阳性重组子。 自动测序由深圳华大基因有限公
司完成,测序时每个分离物选取 3 个阳性克隆,单
向测序。
利用 BLAST ( www. ncbi. nlm. nih. gov /
BLAST / )、DNAMAN Version 5. 22 (Lynnon Bio-
soft,Quebe Canada) 和 MEGA 4. 0 进行序列比较
及分析。
2 结果与分析
2. 1 水稻病株中病毒粒子形态
3 个不同采集地的水稻病株样品粗汁液电镜
负染色法均观察到球形病毒粒子,其直径约 70 ~
75 nm,无被膜 (图 1),这与典型的斐济病毒属
(Fijivirus)病毒粒子特征相同。
2. 2 RT-PCR检测
以 9 个病株分离物总 RNA的反转录产物为模
板进行 PCR 扩增,PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶
电泳,均可见一条约 0. 4 kb 的特异性扩增片段。
该片段大小与预期的片段大小一致。 引物对
SRBSDV105 和 SRBSDV515 具有很好的特异性,
仅能从感病的水稻总 RNA 提取物中扩增出预期
目的片段(410 bp),而健康水稻总 RNA 中则未扩
增到 (图 2)。
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植物病理学报 41 卷
Fig. 1 Virions (↑) in crude extracts of rice
sample
2. 3 SRBSDV 外壳蛋白基因部分序列的测定及
同源性比较
PCR产物克隆测序后,应用 BLASTn 和 DNA-
MAN程序分析序列测定结果表明,所得目的片段
大小为 411 bp ( GenBank 登录号: HQ535798、
HQ535799、 HQ535800、 HQ535801、 HQ535802、
HQ535803、 HQ535804、 HQ535805、 HQ535806 )。
将序列进行 BLAST 检索发现,分离物 WS-1、WS-
4、10YV975-1、10YV974-3、10YV973-5、10YV995-
1、10YV995-2、10YV1028-1 和 10YV1028-2 与越南
报道的 SRBSDV 分离物 SRBSDV-UCH19-20、
SRBSDV-UCH21-22和 SRBSDV-UCH23-24(GenBank
登录号: GU017740、GU017741、GU017742)相同
核苷酸片段的同源性最高,均在 98%以上,而采自
云南文山的 WS-1 和 10YV975-1 分离物更是与
SRBSDV-UCH19-20 和 SRBSDV-UCH23-24 的同
源率达到 100% 。 此外,云南各分离物与 Zhang
等[5]报道的水稻黑条矮缩病毒 2 ( Rice black
streaked dwarf virus 2, RBSDV 2)分离物同源性在
97. 8% ~ 99. 8%之间,而与国内海南报道的分离物
同源性在 97. 6% ~ 99. 5% 之间。 进一步利用
MEGA 4. 0 软件的邻近相连法(Neighbor-Joining)
对 Fijivirus 中不同病毒或分离物与获得的云南各
SRBSDV分离物外壳蛋白部分氨基酸序列构建系
统进化树显示(图 3),云南 3 个样品采集地的分离
物与越南、海南报道的 SRBSDV 以及 Zhang 等报
道的 RBSDV 2 相互聚集在一起,因地理隔离的差
异而具有微小的进化分离,该类病毒独立形成的分
支与 Fijivirus中不同病毒间具有明显的进化分离,
但 SRBSDV各分离物形成的分支与水稻黑条矮缩
病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)各
分离物和玉米矮缩病毒(Maize rough dwarf virus,
MRDV)具有一定的进化关系,而与该属的马德里
约柯托病毒(Mal de Río Cuarto virus,MRCV)和斐
济病病毒(Fiji disease virus,FDV)具有明显的进化
分离。
Fig. 2 RT-PCR products obtained with primer SRBSDV105 and
SRBSDV515 using RNA extracts from rice
Lane M: DL2000 DNA marker; Lane 1: Negative control; Lane 2: WS-1; Lane 3: WS-4; Lane 4: 10YV975-1;
Lane 5: 10YV974-3; Lane 6: 10YV973-5; Lane 7: 10YV995-1; Lane 8: 10YV995-2;
Lane 9, 10YV1028-1; Lane 10, 10YV1028-2.
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6 期 丁 铭,等:云南水稻上检测到南方水稻黑条矮缩病毒
Fig. 3 Phylogenetic analysis based on the partial capsid protein
gene nucleotide sequences of fijiviruses
3 讨论
本研究利用病害症状比较、电镜负染色法和
RT-PCR,从云南南部稻区 3 个州市的水稻病株中
检测到南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black
streaked dwarf virus, SRBSDV),云南各分离物与
其他已报道的 SRBSDV分离物的外壳蛋白核苷酸
部分序列同源性在 97. 6% ~ 100% 。 这是首次从
典型症状描述、病毒形态学和分子水平证明云南部
分州市田间水稻被 SRBSDV感染。
通过对云南不同分离物基因组 S10 片段中外
壳蛋白基因部分序列的扩增及序列分析发现,云南
分离物和已报道的 SRBSDV 及 RBSDV 2 各分离
物有较高的同源性及较近的系统进化关系,但不同
区域采集的分离物,因地理隔离具有一定的进化分
离,其中文山大部分分离物及德宏分离物进化关系
较为接近,它们与海南、越南及浙江的分离物有较
近的进化关系,而西双版纳采集的 2 个分离物和文
山的一个分离物与云南其他分离物具有一定的进
化分离,因此从病毒基因组 S10 部分片段分析发现
云南不同区域的分离物有一定的微小差异。
南方水稻黑条矮缩病毒是一类对水稻危害严
重的病毒病原,其不但可以危害水稻和玉米两类我
国主要的禾本科作物还可以侵染为害多种南方田
间常见的禾本科杂草,如稗草(Echinochloa crus-
galli)、水莎草(Juncellus serotinus)和白草(Penni-
setum flaccidum)等,作为田间重要的中间寄主或
侵染源常年危害当地水稻和玉米[3]。 SRBSDV 传
毒介体白背飞虱(Laodelphax striatellus)是我国及
亚洲许多国家和地区主要迁飞性害虫之一,云南地
处亚洲热带、亚热带与温带区的连接处,从越南、缅
甸和老挝等东南亚国家迁飞进入国内的灰飞虱、白
背飞虱及褐飞虱等害虫对云南水稻主产区的早、晚
稻造成了严重的危害,同时也为 SRBSDV 等危险
性病毒病原提供了大量的传播介体。 开展 SRBS-
DV监测与快速检测技术研究,可有效监控该病毒
病发生流行动态,减少病害引起的产量损失,提供
快速、准确、科学的病毒检测方法。
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植物病理学报 41 卷
参考文献
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于金枝
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