全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(6): 649-653(2011)
收稿日期: 2010-12-02; 修回日期: 2011-08-22
基金项目: 山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2009NY040)
通讯作者: 迟玉成,副研究员,主要从事花生病害和微生物研究; Tel:0532-87626681, E-mail: chiyucheng@hotmail. com。
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췍研究简报
逆转录环介导等温扩增技术检测花生条纹病毒
谢宏峰, 迟玉成*, 许曼琳, 樊堂群, 张建建, 吴菊香, 许婷婷
(山东省花生研究所, 青岛 266100)
Detection of Peanut stripe virus by the reverse transcription loop-mediated isother-
mal amplification method　 XIE Hong-feng, CHI Yu-cheng, XU Man-lin, FAN Tang-qun, ZHANG
Jian-jian, WU Ju-xiang, XU Ting-ting　 (Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, China)
Abstract: A simple and sensitive Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification ( RT-
LAMP) method was established to detect Peanut Stripe Virus (PStV) . A set of four specific primers were de-
signed based on PStV coat protein gene for RT-LAMP assay. Amplification products were detected by SYBR
green I staining and agarose gel electrophoresis. The specificity and sensitivity of the RT-LAMP assay were
tested. The results showed that the RT-LAMP assay was rapid, specific and sensitive. The RT-LAMP reaction
could be finished within 1 hour, and it was 10 times more sensitive than RT-PCR. The RT-LAMP assay repor-
ted here will become a useful method for rapid and reliable detection of PStV.
Key words: Peanut stripe virus (PStV); reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-
LAMP); RT-PCR
文章编号: 0412-0914(2011)06-0649-05
　 　 花生条纹病毒病(Peanut stripe virus, PStV)
是我国花生上流行最广[1]、田间发病率最高的一
种花生病毒病,严重影响花生的产量和品质。 由于
PStV存在不同症状类型株系,在中国占优势的轻
斑驳株系,引起花生症状较轻,并且与其他花生病
毒病症状类似,不易分辨,目前主要利用 PCR 方法
对 PStV进行检测[2],但该方法检测时间长,并且
需要专业仪器,较难普及。 环介导等温扩增(Loop-
mediated isothermal amplification, LAMP)技术是
Notomi 等[3] 2000 年首先提出来的一种新的核酸
扩增技术,已经广泛应用于各种病毒、细菌的检测
中,国内研究人员在转基因作物外源基因检测上也
有应用。 本研究根据 PStV 外壳蛋白保守序列设
计了特异性引物,成功建立了 RT-LAMP 检测体
系,用于花生条纹病毒的快速检测。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
PStV感病植株叶片采自山东省花生研究所莱
西试验基地,置 - 70℃冰箱冻存。 黄瓜花叶病毒
(Cucumber mosaic virus, CMV)、花生斑驳病毒
(Peanut mottle virus,PeMoV)花生矮化病毒(Pea-
nut stunt virus,PSV)样品由本实验室保存。 Tran-
sZol、cDNA第一链合成试剂盒、Taq DNA 聚合酶、
逆转录酶购自全式金公司,Bst DNA 聚合酶购自
NEB公司,Betaine 购自 Sigma公司,SYBR Green I
购自 Invitrogen公司。
1. 2　 引物设计
在 GenBank中下载 PStV CP 基因的序列,利
　
植物病理学报 41 卷
用 DNAMAN进行序列比对,找到 1 段 370bp 的保
守序列,作为 LAMP 引物设计的靶序列,利用
LAMP引物设计软件 Primer Explorer V4(http: / /
primerexplorer. jp / e / index. html)设计 1 套特异性
引物(图 1),包括 2 条外引物 F3、B3 和 2 条内引物
FIP(F1c + F2)、BIP(B1c + B2)。 LAMP 引物和
RT-PCR引物由南京金斯瑞生物技术公司合成。
引物序列见表 1。
1. 3　 总 RNA提取和 cDNA 第一链合成
按照 TransZol的使用说明提取感病叶片的总
RNA,溶解于 50μL 经 DEPC 处理的 ddH2 O 中。
以提取的总 RNA 为模板,按照试剂盒说明扩增
cDNA 第一链。
1. 4　 RT-LAMP 扩增及产物分析
LAMP反应在 25 μL 体系中进行,体系包括:
cDNA 5 μL、10 × Bst buffer 2. 5 μL、Bst DNA聚合
酶(8 U / μL) 1 μL、dNTPs(10 mmol / L) 2. 5 μL、
Betaine (5 mo1 / L) 5 μL、MgSO4 (100 mmol / L)
2 μL、F3 / B3 (10 pmol / μL)各 0. 5 μL、BIP / FIP
(20 pmol / μL) 各 2 μL、ddH2O 2 μL。 混匀,65℃
恒温反应 1h。 LAMP 反应结果通过 2 种方法分
析:(1)直接向扩增管中加入嵌入型染料 SYBR
GreenⅠ(1 000 × ),没有扩增产物的阴性管呈橙
色,有扩增产物的阳性管为黄绿色;(2)取扩增产
物 5 μL,1． 5%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察
结果。
1. 5　 RT-PCR扩增
反应体系 25 μL:10 × buffer 2. 5 μL,PCR-F /
PCR-R(10 pmol / μL)各 1 μL,dNTPs(2. 5 mmol / L)
2 μL,Taq 酶 0. 5 μL,cDNA 4 μL,ddH2O 14 μL。
反应条件:94℃预变性 3 min;94℃变性 45 s,51℃
退火 50 s,72℃延伸 1 min 循环 30 次;72℃延伸
10 min。
Fig. 1　 The conserved sequence of Peanut stripe virus coat protein gene and
the design of loop-mediated isothermal amplification primers
Table 1　 Nucleotide sequences of the primers used in the study
Primer Sequence(5′to 3′)
F3 GATTGCTCCGGAATTTGAGG
B3 GTGCCTTTCAGTATTCTCGC
FIP(F1c + F2) GCTTCCCTTGCACGATCTGATGCTAGCTCGCTACGCTTTCG
BIP(B1c + B2) AGTAGCACAGATGAAGGCAGCACCACATTCCCATCAAGTCCA
PCR-F TACATAGCAGAATCAGCACT
PCR-R CCACACTGAAACTAAAGAGA
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　 6 期 　 谢宏峰,等:逆转录环介导等温扩增技术检测花生条纹病毒
1. 6　 RT-LAMP方法的特异性和灵敏性
按上述反应体系同时对健康植株、 PStV、
CMV、PeMoV、PSV 进行检测,检验 RT-LAMP 方
法的特异性。 将模板 cDNA 用 10 倍浓度梯度稀释
至 10 -8倍,分别进行 RT-LAMP 和 RT-PCR 扩增,
比较 RT-LAMP方法的灵敏性。
2　 结果与分析
2. 1　 PStV的 RT-LAMP检测
RT-LAMP扩增结束后,直接向反应管中加入
2. 5 μL 1 000 × SYBR Green 荧光染料,充分混匀,
在正常光照条件下即可明显观察到,阳性反应呈现
黄绿色,对照管呈现橙色,颜色差异明显(图 2-C);
取 5 μL 反应液进行 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳,可以
观察到阳性反应有明显的特异性梯状条带,对照反
应没有条带出现(图 2-A),这与反应后直接加入荧
光染料的结果是一致的。 取 5 μL RT-PCR反应结
果进行琼脂糖凝胶电泳,结果阳性反应出现约 1. 1
kb的特异性条带,与预期结果相符(图 2-B),并且
同 RT-LAMP检测结果一致,证明 RT-LAMP 能够
检测出 PStV。
Fig. 2　 Results of Peanut stripe virus RT-LAMP and RT-PCR amplification
A:Results of 1. 5% agarose gel electrophoresis of RT-LAMP; B: Results of 1% agarose gel electrophoresis of RT-PCR;
C: The RT-LAMP results with SYBR Green I. 1-3: Peanut stripe virus; 4: Blank control.
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植物病理学报 41 卷
2. 2　 RT-LAMP的特异性
如图 3 所示,只有 PStV 有特异的阶梯状条带
出现,和预期结果相符,健康植株、CMV、PeMoV、
PSV和阴性对照的相应泳道无特异性条带出现,
说明本试验所设计的引物特异性良好,能够特异性
地检测 PStV。
2. 3　 RT-LAMP方法的灵敏性
灵敏性试验结果显示,本试验所建立的 RT-
LAMP检测方法最小检测限为 10 -8倍(图 4-B),
RT-PCR仅能检测到 10 -7稀释度(图 4-A),说明
RT-LAMP检测方法有良好的灵敏性。
3　 讨论
本试验将 RT-LAMP 技术应用于 PStV 的检
测,取得明显的效果。 综合本研究结果,笔者认为
RT-LAMP克服了传统检测方法的一些不足,具有
其他方法无法比拟的优点:(1)特异性高。 该技术
只有在 4 条引物完全与靶序列匹配的情况下才能
顺利进行,在很大程度上使检测特异性得到提高,
Fig. 3　 Specificity of RT-LAMP assay to Pea-
nut stripe virus
M:Trans2K Plus DNA marker; 1: Blank control; 2: Healthy
plant; 3: Peanut stripe virus; 4: Cucumber mosaic virus; 5:
Peanut mottle virus; 6: Peanut stunt virus.
Fig. 4　 Sensitivity of RT-LAMP assay to Peanut stripe virus
A:Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products; B: Agarose gel electrophoresis of RT-LAMP products.
M: Trans2K Plus DNA marker; 1: Blank control; 2: 10 -2; 3: 10 -4; 4: 10 -6; 5:10 -7; 6: 10 -8; 7: 10 -9 .
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　 6 期 　 谢宏峰,等:逆转录环介导等温扩增技术检测花生条纹病毒
特异性试验结果证明了这一点; (2)操作简单。
LAMP反应在恒温条件下进行,不需要复杂仪器设
备,只要有维持恒温的金属浴或水浴锅就能完成;
检测结果可以通过添加荧光染料,肉眼观测,不需
要电泳仪和紫外观测。 (3)高效灵敏。 该技术反
应时间短,仅需要 1 h。 如同时具有很好的灵敏度
高,本试验中 RT-PCR 仅能检测到 10 -7, 而 RT-
LAMP能够检测到 10 -8。 因此,RT-LAMP 技术检
测 PStV适合基层应用,有很好的应用前景。
此外,LAMP反应还可以通过反应管的浑浊沉
淀来判断是否有扩增产物[4],这种沉淀主要是副
产物焦磷酸镁,但在试验中我们发现产生沉淀的重
复性不高,灵敏性也低于琼脂糖凝胶电泳分析法,
这与 Zhang等[5]的报道相似。
RT-LAMP 检测方法,靶序列的选择和引物设
计是一个非常关键的步骤。 引物设计可以采用专
业的设计软件 Primer Explorer 进行。 LAMP 反应
对内引物(FIP 和 BIP)的纯度要求比较高,最好选
择 HPLC纯化,还可以在目标序列中设置限制性内
切酶位点,用来确认扩增产物的正确性。 LAMP
检测方法具有高效和灵敏度高的特点,在操作时易
污染,因此应严格遵守分区操作,进行 LAMP 试验
的工作桌面及相关物品应定期消毒,防止交叉污
染。
总之,本试验建立的 PStV 的 RT-LAMP 检测
方法,操作简单快速,灵敏度高,不需要特殊昂贵的
仪器就能够特异性的检测 PStV,特别适合基层单
位使用。
参考文献
[1] 　 Xu Z Y, Chen K R, Yan L Y. Progress on research of
some major viruses infecting peanut ( in Chinese)[J] .
Acta Phytopathologica Sinica (植 物 病 理 学 报 ),
2004, 34 (1): 1 -7.
[2] 　 Yan L Y, Xu Z Y, Chen K R. Cloning and sequen-
cing the coat protein gene of Peanut stripe virus Hon-
gan isolate ( in Chinese) [ J] . Chinese Journal of Oil
Crop Sciences (中国油料作物学报), 2007, 29(1):
83 - 85.
[3] 　 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-
mediated isothermal amplification of DNA [ J] . Nuc-
leic Acids Research, 2000, 28 (12): 63.
[4] 　 Parida M M, Santhosh S R, Dash P K, et al. Deve-
lopment and evaluation of reverse transcription loop
mediated isothermal amplification assay for rapid and
real-time detection of Japanese Encephalitis virus [ J] .
Journal of Clinical Microbiology, 2006, 44 ( 11 ):
4172 -4178.
[5] 　 Zhang K, Huang W, Li G. Development of rapid as-
say for avian influenza a (H5N1) virus by loop-media-
ted isothermal amplification method ( in Chinese) [J] .
Letters in Biotechnology (生物技术通讯), 2009, 20:
217 -220.
责任编辑:曾晓葳
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