全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""()"!$
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#
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-
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收稿日期$
!"#)("(#1
&修改稿收到日期$
!"#)(##(!$
基金项目$国家梨产业技术体系项目"
0
2
3
2
45(!1(#!
#
作者简介$丁
!
伟"
#11"&
#!男!在读硕士研究生!主要从事果树分子生物学的研究
6(78.9
$
!%$$%$$
!::
+3;7
"
通信作者$朱立武!硕士!教授!主要从事果树分子生物学的研究
6(78.9
$
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!
8=8>+@A>+30
缺铁胁迫对梨叶片中
$%
信号
转导相关基因的影响
丁
!
伟!周
!
葱!刘
!
超!何家轩!贾
!
兵!朱立武"
"安徽农业大学 园艺学院!合肥
!%""%*
#
摘
!
要$以不同程度缺铁的(砀山酥梨)组培苗为实验材料!应用
6BCDE
法测定叶片中内源
FE
含量!并依据
GHIC
上
FE
氧化酶
!"!#$
同源基因的保守序列!采用
JEH6
技术克隆其基因全长!从梨基因组数据库中比对获得
FE
受体
FCK#
的
)
个等位基因和
K6BBE
蛋白的
)
个等位基因!通过实时
JL(MHJ
分析
!"!#$
基因和
FCK#
的
)
个
等位基因和
K6BBE
蛋白的
)
个等位基因的相对表达量!以探讨缺铁对梨叶片
FE
含量及其信号转导相关基因表
达的影响结果表明$"
#
#梨叶片中
FE
含量随着其缺铁程度的加重而增加"
!
#克隆出梨叶片中
!"!#$
基因!其
3KGE
全长为
#"#)N
O
"
F@0I80P
登录号为
QR""1,*
#"
%
#
!"!#$
基因的表达量并未随梨缺铁程度增加而上升&
FE
受体
FCK#
的
)
个等位基因相对表达量均随梨缺铁程度的加重而增加!其相对表达量与
FE
含量呈正相关关
系&在
K6BBE
蛋白的
)
个等位基因中!仅
%&"#
相对表达量随着梨缺铁程度的加重而逐渐增加!说明
%&"#
对缺铁胁迫最敏感推测梨缺铁诱导了
FE
合成!但并没有促进活性
FE
向无活性
FE
转化
关键词$赤霉素&赤霉素氧化酶基因&赤霉素受体蛋白&赤霉素效应抑制蛋白
中图分类号$
S,$
&
S,1
文献标志码$
E
&()*"+,"-.!(#)#(-)
/
"-*0(&1
2
,(33#"-"$%4#
5
-67
8,6-3!9)*#"-:(76*(!$(-(3#-;(6"
(
<6-
5
306-397#
)
=(6,
"
1
2
(345()#4"6/)-.)(-:(0!>
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KCGFT@.
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O
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Y
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"
FE
#
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O
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Y
@0@/.09@8Z;Z
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Y
[@@;Z.[;0(A@Z.3.@03
2
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2
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2
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6BCDE
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Y
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O
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JEH6
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Y
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"
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JL(MHJ
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#
#
L=@FE3;04@04.09@8\@/.0(
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Y
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Y
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39;0@A?8/#"#)N
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O
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Y
@0@84A.ZZ@[@04A@
Y
[@@;Z.[;0(A@Z.3.@03
2
A.A0;4.03[@8/@A8/
FE3;04@04/[8./@A+L=@9@\@9/;Z[@984.\@@5
O
[@//.;0;Z4=@Z;>[89@9@/;Z!6%#89.03[@8/@A8/A@
Y
[@@;Z.(
[;0(A@Z.3.@03
2
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O
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O
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2
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Y
[@@;Z.[;0(A@Z.3.@03
2
N@3;7@/@\@[@
!
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2
+C4?8//
O
@3>(
984@A4=844=@.[;0(A@Z.3.@03
2
3;>9A833@9@[84@4=@/
2
04=@/./;ZFE80A?;>9A0;4
O
[;7;4@834.\@FE.04;
.0834.\@;0@/+
@(
/
A",!3
$
FE
&
!"!#$
&
FCK#
&
K6BBE#
!!
赤霉素"
Y
.NN@[@9.0/83.A
!
FE
#是一类存在于植
物整个生命周期的内源激素!调控植物的生长发育
过程
FE
可促进细胞分裂和伸长!诱导开花!打破
植物休眠!促进雌花分化!增强细胞内生长素
CEE
水平从而促进养分积累!促进某些梨树座果和单性
结实!延缓叶片衰老等*#(!+
FE!(
氧化酶"
FE!(;5.(
A8/@
!
FE!;5
#是
FE
合成过程中关键调控酶!以
!(
酮戊二酸和氧分子为底物,
]@
!^ 和抗坏血酸为辅助
因子的双加氧酶!在
FE
合成过程中!将活性
FE
氧
化为无活性
FE
!维持着植物体内生物活性
FE
和
无活性
FE
的平衡!受
FE
正反馈调节*%()+
K6BBE
蛋白是一类
H
端非常保守,
G
端含有
E/
O
(F9>(B@>(B@>(E98
结构域的蛋白质家族
K6B(
BE
蛋白定位于细胞核内!与某种转录因子结合!对
基因转录起阻遏作用!抑制赤霉素效应!间接或直接
调节
FE
响应基因的转录*$+
]>
等*(1+发现
K6B(
BE
蛋白对赤霉素,茉莉酸,脱落酸,乙烯和生长素
等多种激素的信号转导过程都有抑制作用!抑制植
物的发育&
E3=8[A
等*#"+研究拟南芥
K6BBE
蛋白在
植物激素处理和逆境胁迫下的变化!结果发现
K6BBE
蛋白可以实时调节植物生长以响应外界环
境变化!以此提高植物的抗逆性
FCK#
"
Y
.NN@[@9.0.0/@0/.4.\@A?8[Z
#是一种
FE
受
体!定位于细胞核内!是一种可溶性受体*##+
FCK#
与活性
FE
结合形成
FE(FCK#
二聚体!二聚体上
G
端构象发生改变!易于同
K6BBE
蛋白连接!形成
FE(FCK#(K6BBE
三聚体!然后
DH]
聚合体标记该
三聚合体!诱导泛素
!*D
蛋白酶体降解
K6BBE
蛋
白!解除
K6BBE
蛋白对基因转录的阻遏作用!产生
-赤霉素效应.*#!(#)+
(砀山酥梨)种植面积约占中国梨栽培面积的
#
%
)
!其主产区在西北和黄河故道地区该地区梨园
缺铁现象严重影响了梨品质和产量的提高*#$(#*+
J;7=@9A
等*#,+研究发现!缺铁胁迫导致向日葵根系
的
CEE
含量显著提高!
B.
等*#+用
CIE
或
CEE
处理
正常供铁植物!发现能诱导类似植物的高铁还原酶
的活性
J;7@[8
*
#1
+将乙烯合成前体
EHH
加入缺
铁植株后!显著促进高铁还原酶活性和根毛发育
F[8<.80;
*
!"
+则研究了
GW
对植物缺铁的调控!发现
GW
能促进缺铁条件下植株的各种缺铁响应!但是
不能诱导正常供铁植株产生缺铁相关的反应
关于缺铁条件下
FE
含量变化及其信号转导相
关基因表达研究目前尚未见报道试验以(砀山酥
梨)组织培养试管苗叶片为试材!测定不同程度缺铁
胁迫下叶片内源
FE
含量&采用
JL(MHJ
技术!分
析
FE
信号转导相关基因
!"!#$
,受体蛋白
FCK#
的
)
个等位基因和
K6BBE
蛋白
)
个等位基因相对
表达量变化&研究缺铁胁迫下梨叶片
FE
水平和相
关信号转导基因的关系!探讨
FE
及其转导基因在
梨树缺铁胁迫下的作用
#
!
材料和方法
B+B
!
材
!
料
参考
M@/4808_
设计*!#+!将(砀山酥梨)组培生
根苗移植至
_D
培养基!其中不含铁元素!
]@
!^ 浓度
另设
)
个处理水平
]@)"
$添加
)"
"
7;9
%
B]@(6K(
LE
&
]@!"
$添加
!"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
]@#"
$添加
#"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
]@"
$不添加
]@(6KLE
处
理的苗木置于光照培养箱中!培养温度"白天%夜晚#
!$`
%
!"`
!光照时间每天
#$=
!光照度
!#""95
!
相对湿度
,"a
!培养
!A
后!
]@)"
叶片表现正常!
]@!"
叶片黄化不明显!
]@#"
叶边缘出现明显的失
绿!
]@"
叶片黄化严重!呈黄白色"图
#
#将不同处
理叶片用液氮处理后!置于
&" `
冰箱中保存
备用*!!+
B+C
!
方
!
法
B>C>B
!
$%
含量测定
!
应用酶联免疫检测法
6BCDE
"
60<
2
7@(B.0P@AC77>0;D;[N@04E//8
2
#测
定叶片中
FE
含量*!%+
B>C>C
!
总
:D%
提取与
7!C&8
基因克隆
!
总
JGE
提取使用
D48[D
O
.0M9804JGE_.0.Q.4
试剂盒"购
自
F@0/48[
公司#!
3KGE
合成使用
_(_BbJL8/@
)%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
不同铁离子含量培养基中叶片黄化症状程度
]@)"+)"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
]@!"+!"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
]@#"+#"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
]@"+"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&下同
].
Y
+#
!
B@8Z?.4=/
2
7
O
4;7;Z.[;0(A@Z.3.@03
2
84_D7@A.>784A.ZZ@[@04.[;03;03@04[84.;0/
]@)"+)"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
]@!"+!"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
]@#"+#"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
]@"+"
"
7;9
%
B]@(6KLE
&
L=@/87@8/N@9;?
3KGED
2
04=@/./Q.4
"购自大连宝生物工程有限公
司#通过
GHIC
查找
!"!#$
基因的同源序列!根
据同源序列的保守区域设计引物!进行
MHJ
扩增!
将扩增得到的特异片段回收!送到上海生工生物工
程公司进行测序!获得
!"!#$
基因的保守序列根
据保守序列按照
L8Q8J8
宝生物工程"大连#有限公
司的
%c(]>9 JEH6H;[@D@4?.4=M[.7@D3[.
O
4
L_
J48/@
和
$c(]>9JEH6Q.4?.4=L8
O
试剂盒设计引
物进行扩增
MHJ
扩增条件为
1) `
预变性
#"
7.0
&
1)`
变性
%"/
&
$!`
退火
)$/
!
,!`
延伸
#
7.0
!共进行
%$
个循环&
,!`
延伸
#"7.0

B>C>E
!
实时荧光定量
=F:
!
提取不同程度缺铁叶
片的总
JGE
!经反转录获得
7JGE
第一链根据
获得的
!"!#$
全长序列!以及从梨基因组数据库中
得到
FCK#
的
)
个等位基因为
!6%##
"登 录 号
MN[""*$,#+#
#,
!6%#%
"登录号
MN[")#1)!+#
#,
!6%#$
"登录号
MN["#1*1%+#
#和
!6%#*
"登录号
MN["!1,1$+
#
#!
K6BBE
蛋白
)
个等位基因
%&"#
"登录号
MN["%,1$+#
#,
%&"!
"登 录 号
MN[")"%#*+#
#,
%&")
"登录号
MN["")$#%+#
#和
%&"*
"登录号
MN["%,1*+#
#"
=44
O
$%%
O
@8[
Y
@0;7@+0
-
8>+@A>+30
$
"")
%
A@Z8>94+8/
O
/
Ad)e7d!
#!使用
M[@7.@[$+"
软
件设 计 荧 光 定 量
MHJ
引 物"表
#
#使用
EIC
DL6MWG6
荧 光 定 量
MHJ
仪 和
L8P8[8
公 司
DfIJ
#
-,27($&$89
:
L_
$
"
L9.JG8/@VM9>/
#试
剂进行荧光定量
MHJ
分析!采用
!"
"
B
反应体系$
DfIJ
L_
-,27($&$89
:
#"
"
B
!正,反向引物"
#"
"
7;9
0
B
&#
#各
"+
"
B
!荧光染料
"+)
"
B
!
3KGE
模
板
#
"
B
!
AAV
!
W,+"
"
B
反应程序为
1$`
预变性
%"/
!
1$`
变性
$/
!
*"`
退火
%"/
!共
)"
个循环!每
个样品
)
次重复以
!"-%;
基因作为内参!使用
!
&
##
<4法求待测样品相对表达量
表
B
!
所用引物序列
L8N9@#
!
L=@/@
:
>@03@/;Z4=@
O
[.7@[/
>/@A.04=@@5
O
@[.7@04
引物名称
M[.7@[
087@
引物序列
M[.7@[/@
:
>@03@
"
$c
$
%c
#
引物用途
M[.7@[
8
OO
9.384.;0
HD(D LFFFEEFEELFFLFELFLL
HD(E LLHLHEHLHEEFFFLFFLH
%c(W>4@[ LEHHFLHFLLHHEHLEFLFELLL
%c(.00@[ HFHFFELHHLHHEHLEFLFELLLHEHLELEFF
%c(FE;>4@[ HHHEEEFFLLLHLELHEFLL
%c(FE.00@[ LFLLLHEFFHLHEELHEHLE
FE!;5
$c(W>4@[ HELFFHLEHELFHLFEHEFHHLE
$c(.00@[ HFHFFELHHEHEFHHLEHLFELFELHEFLHFELF
$c(FE;>4@[ LFFFHELFFLFFFLEFLFE
$c(FE.00@[ FEELHFHLHLFLLHELHHE
FEMKV(M] FLFHHHEHLFLLFELFLLLHH
FEMKV(MJ HHLLHLFEHLHHLHHLLFELEFH
FE(!E FFEEELEEHFHEFEEFEF
FE(!D EELHFHLHLFLLHELHH
FCK##(#**] EFHFFEELLHHLLFEHHFFEE
FCK##(#**J HEHHFHLHLHLHEFFELHEEHE
FCK#%(#,*] LLHHFFLLFEHFFFFLLLLHL
FCK#%(#,*J FEEFHLLHHFHHFLFFEEEEE
FCK#$(###] ELHELHFFFFFEHFELLHFEL
FCK#$(###J LHELHHLFFLHEEHFHEFLHE
FCK#*(!#"] LHFEFHHEFEEHFLFFLLFEE
JL(MHJ
FCK#*(!#"J LFHELLHEFEEHHELFFHEFH
K6BBE#(#%*] EEHLFHELFFEEFFLFFFLFE
K6BBE#(#%*J EHHELHLFFLFLLFHHLFHLL
K6BBE!(##%] ELFFHFLLLHELHEHHEHHEH
K6BBE!(##%J EEEFHLFHFLLFLLFEFHHEH
K6BBE)(#!] EHEFHELEHEFEHHHFLHHEL
K6BBE)(#!J LFLEHHHHEEHELHFHHEFEE
K6BBE*(#1,] FLLLLHHLFHFEFFHFEHEEL
K6BBE*(#1,J LHELHHEEEHHHFHHLHFELL
$%!
!
期
!!!!!!!!!!!
丁
!
伟!等$缺铁胁迫对梨叶片中
FE
信号转导相关基因的影响
B+C+G
!
数据分析
!
利用
DMDD#,+"
软件对叶片中
FE
含量,基因相对表达量差异进行分析
!
!
结果与分析
C>B
!
不同程度缺铁叶片中
$%
含量
各处理苗木培养
!A
后!
]@)"
叶片表现正常!
]@!"
叶片黄化不明显!其
FE
含量分别为
,+!1
0
Y
%
Y
和
+#%0
Y
%
Y
!两者差异不显著
]@#"
仅叶缘
出现明显黄化!
FE
含量显著高于
]@)"
与
]@!"
处
理&而未添加
]@(6KLE
的叶片黄化严重!
FE
含量
也显著高于
]@#"
处理由此可见!叶片内源
FE
水
平受到缺铁胁迫的影响!随着植株缺铁程度加重!叶
片
FE
含量增加"图
!
#
C>C
!
7!C&8
基因的克隆
对
FE
氧化酶基因
!"!#$
进行克隆!首先得到
保守序列!该扩增片段大小为
$,*N
O
&将此序列在
GHIC
上进行
IBEDL0
比对!结果它与西洋梨"登录
号
R]))##*
#的
!"!#$
最接近!一致性达到
11a

%c(JEH6
扩增片段大小为
$%*N
O
!比对结果与苹果
"登录号
]R$,#$!#
#的
!"!#$
基因一致性最大!达
到
1,a
&
$c(JEH6
扩增片段大小为
$$N
O
!与苹果
"登录号
]R$,#$!#
#的
!"!#$
基因一致性达到
11a
"图
%
#
将
!
个片段拼接得到编码区全长
#"#)N
O
的
基因!在
GHIC
上比对!发现与西洋梨的
!"!#$
"登
录号
R]))##*
#基因一致性达到
11a
依据上述特
征判断!本研究获得了(砀山酥梨)
!"!#$
"登录号
QR""1,*
#基因完整
3KGE
全长序列!共含
%%,
个
氨基酸序列
C>E
!
不同程度缺铁叶片中
7!C&8
基因差异表达分析
]@!"
处理的
!"!#$
基因相对表达量显著高于
]@)"
&
]@#"
和未添加
]@(6KLE
的
!"!#$
基因相对
图
!
!
不同缺铁处理叶片中内源
FE
含量
不同小写字母表示不同处理间差异显著"
-
%
"+"$
#&下同
].
Y
+!
!
L=@@0A;
Y
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基因表达量增
加&中度或重度缺铁时!
!"!#$
基因表达量并未呈
现出显著差异"图
)
#由此可见!缺铁胁迫并不一
定能促进活性
FE
向无活性
FE
转化
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不同程度缺铁叶片中
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受体
$+等位基
因表达分析
在不同程度缺铁叶片间!
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和
!6%#%
的
相对表达量均达到显著差异&而
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和
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基因在
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和
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高于
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处理"图
$
#
相关分析结果显示!
FE
含量与
FE
受体蛋白
FCK#
的
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,
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和
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不同程度缺铁叶片中
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表达
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在
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在
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与
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与
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与
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讨
!
论
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缺铁胁迫条件下
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的作用及与
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基因
的关系
梨树缺铁症状首先出现在幼叶上!轻者叶片边
缘失绿黄化!重者整个叶片黄化!直至叶片全部变为
黄白色,出现褐色锈斑且叶缘枯焦!引起叶片脱落!
致使枝条枯死!甚至植株死亡*!)+
U=;>
等*!$+发现
FE
可以延缓叶片中叶绿素降解,缓解失绿&
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等*!*+研究认为
FE
可以延缓蛋白质和
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的分
解!延迟叶片衰老
!"!#$
基因是调控
FE
分解的关键酶!它可以
促进活性
FE
转化为无活性
FE
但是本试验发
现!叶片内源
FE
水平随着植株缺铁程度加重而增
加!而
!"!#$
基因表达量并未随之上升表明缺铁
胁迫条件下!叶片中
FE
的总量是增加!可能是缺铁
诱导了内源
FE
合成在缺铁胁迫下!通过外源
FE
的应用是否能增加梨抗缺铁能力有待进一步研究
E>C
!
缺铁胁迫叶片中
$%
信号转导
本试验结果显示!
FCK#
作为
FE
的受体!在重
度缺铁处理叶片中!其
)
个等位基因表达量均显著
上调!与内源
FE
含量显著上升相一致!使
FE
与
FCK#
结合成二聚体的数量增加形成的
FE(FCK#
二聚体!再同
K6BBE
蛋白连接!成为
FE(FCK#(
K6BBE
三聚体!然后激活泛素
!*D
蛋白酶降解
K6BBE
蛋白!解除
K6BBE
蛋白对生长的抑制作
用!进而产生-赤霉素效应.
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等*!,+研究表明!
K6BBE
蛋白反向调控
FE
信号途径但是!本试验中
%&"
基因表达水平
并没有随着内源
FE
含量增加而降低缺铁胁迫同
时诱导了梨叶片内源
FE
合成和
K6BBE
蛋白基因
的表达!其中的调控机制尚有待进一步深入研究
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