全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 42(5): 536-540(2012)
收稿日期: 2011-09-14; 修回日期: 2012-07-13
基金项目: 国家质检总局项目(2009IK253); 现代农业产业技术体系建设专项
通讯作者: 陈红运,研究员,主要从事植物病毒学研究; E-mail:gmopub@yahoo. cn;
古勤生,研究员,主要从事植物病毒学研究; E-mail:guqsh@126. com。
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췍研究简报
甜瓜黄斑病毒三亚分离物 S RNA的分子特征
陈红运1*, 陈 青1, 杨英华1,2, 吴会杰3, 林石明1, 古勤生3*
( 1 厦门出入境检验检疫局, 厦门 361026; 2江西农业大学, 南昌 330045; 3中国农业科学院郑州果树研究所, 郑州 450009)
Molecular characterization of S RNA of a Melon yellow spot virus isolate in Sanya
CHEN Hong-yun1, CHEN Qing1, YANG Ying-hua1,2, WU Hui-jie3, LIN Shi-ming1, GU Qin-sheng3
( 1Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361026, China; 2 JiangXi Agriculture University, Nanchang
330045, China; 3Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009, China)
Abstract: The complete nucleotide sequence of S RNA of MYSV Sanya isolate (MYSV-SY) contains 3 257
nts and has two ORFs separated by an A-U-rich IGR of 872 nts, and 5′- and 3′- noncoding regions consist of
68 nts and 67 nts, respectively. Phylogenetic analysis with other completely sequenced MYSV isolates showed
that MYSV-SY was most closely related to the isolate Phm from Physalis minima, with 97. 0% nt identity in
the genomic RNA sequence, and a distant relationship to isolates Tospo-melo (95. 3% ) and TW (94. 9% ) .
The ORF (nt 3190 -2351) on the viral complementary strand encoded N protein of 279 aa with a molecular
mass of 31. 0 kDa. The N protein shared 97. 5% -99. 6% identities with those of other MYSV isolates. The
other ORF (nt 69 -1478) on the viral strand encoded NSs protein of 469 aa with a predicted molecular mass
of 53. 1 kDa. The NSs protein shared relatively higher identities (95. 9% - 98. 1% ) with those of other iso-
lates. The comparison results of N and NSs proteins with the corresponding sequences of other isolates re-
vealed the closest relationship between MYSV-SY and the isolate Phm, in accordance with that of genomic
RNA sequence.
Key words: Melon yellow spot virus; Tospovirus; S RNA
文章编号: 0412-0914(2012)05-0536-05
甜瓜黄斑病毒 (Melon yellow spot virus,
MYSV)首次发生于日本,造成甜瓜和黄瓜的严重
损失,Kato等系统地研究了病毒的传播方式、寄主
范围、超微结构和基因组特征,认为 MYSV应为番
茄斑萎病毒属(Tospovirus)的 1 个新种[1,2]。 2006
年以来,台湾的西瓜[3] 和黄瓜[4] 上相继发现
MYSV。 2009 年春季,古勤生在海南三亚的保护
地甜瓜上发现一种新发生的病毒病,发病率 30%
~ 100% ,病株出现系统性黄化坏死斑点,为MYSV
侵染的典型症状,结合分子检测结果判定病原为
MYSV。
与其他 Tospovirus病毒相同,MYSV的粒体中
包裹 3 条线形、单链基因组 RNA,命名为 L RNA、
M RNA 和 S RNA,其中 L RNA 为负义,M RNA
和 S RNA 为双义,各个基因组片段具共有末端序
列,3′端和 5′端区域互补而形成锅柄状结构。 S
RNA含有 2 个开放阅读框架(open reading frame,
ORF),这 2 个 ORF 被 1 个富含 A-U 的基因间区
5 期 陈红运,等:甜瓜黄斑病毒三亚分离物 S RNA的分子特征
( intergenic region, IGR)隔开,5′端较大的 ORF 编
码非结构蛋白(nonstructural protein, NSs),3′端较
小的 ORF 编码核衣壳蛋白( nucleocapsid protein,
N)。 目前,台湾西瓜分离物 TW、日本甜瓜分离物
Tospo-melo和泰国小酸浆分离物 Phm(曾暂定名
Physalis severe mottle virus, PSMV)的 S RNA 已
经测序。 本研究以 MYSV 三亚分离物为材料,测
定并分析其 S RNA基因组序列。
1 材料与方法
1. 1 材料
甜瓜病株采自海南省三亚市,命名为三亚分离
物(MYSV-SY,以下简称 SY)。 Trizol购自 Invitro-
gen公司;Transcriptor First Strand cDNA 合成试剂
盒与 5′ / 3′RACE试剂盒购自 Roche公司;LA Taq、
dNTPs、 pMD18-T载体、 DNA 胶回收试剂盒购自
TaKaRa公司;其他生化试剂为常规分析纯试剂。
1. 2 引物设计与合成
根据 GenBank 数据库中 MYSV 基因组序列
(GenBank 登录号:AB038343,FJ386391),设计 4
对引物,详见表 1。
1. 3 RT-PCR扩增
应用 Trizol试剂提取感病叶片总 RNA 。取
6 μL总 RNA和 1 μL引物 3244R (20 μmol / L),使
用 Transcriptor First Strand cDNA 合成试剂盒进行
反转录。 取 1 μL cDNA进行 PCR扩增,PCR产物
克隆于 pMD 18-T载体,转化 E. coli DH5α 感受态
细胞后经蓝白斑筛选阳性克隆。 测序工作由宝生
物工程(大连)有限公司完成。
1. 4 序列分析
核苷酸及氨基酸序列同源性分析软件为 DNA-
MAN(5. 2. 2 版,Lynnon Biosoft)。 应用软件 PAUP
(版本 4. 0b10),构建 N基因的 NJ系统发育树。
2 结果
2. 1 RT-PCR扩增结果
RT-PCR扩增得到 4 条 DNA 片段,大小与预
期一致(表 1)。 由于片段 1 和 2 以及片段 2 和 3
的重叠程度低,难以保证测序结果的准确性,因此
以初步的测序结果为基础,重新设计 2 对引物,其
中 MYSV-1F 和 MYSV-2R 扩增 350 bp 的片段用
于校正片段 1 和 2 连接处的序列,MYSV-3F 和
MYSV-4R扩增 800 bp的片段用于校正片段 3 和 4
连接处的序列。 根据片段 1 的测序结果,设计 2 条
引物 SP1-387 和 SP2-165,结合使用 RACE 试剂盒
中的引物 Oligo dT-anchor和 PCR anchor扩增到约
200 bp 的条带,测序结果表明其为完整的 5′非编
码区(Noncoding region, NCR)。
Table 1 The sequence and location of primers
Primer Sequence (5′ - 3′) Fragment Location / nt Length / bp
69F atggctaacgcataccttactg 1 69 -90 1 000
1088R aggctcgctcacaacgaaat 1069 -1088
1071F ttcgttgtgagcgagcctaa 2 1071 -1090 700
1792R agtatctaggtcattatttgcctcct 1767 -1792
1769F gaggcaaataatgacctagatactctg 3 1769 -1795 1 000
2794R ttccattggttgctgcgtat 2776 -2795
2338F ttaaacttcaatggacttagatc 4 2338 -2360 1 000
3244R agagcaatcgaggtatcaaaaaattcaac 3216 -3244
MYSV -1F atgaacagaccaccttgatc - - 350
MYSV -2R gagtcctcattgtatgatac -
MYSV -3F gagtcttatctgtatatgat - - 800
MYSV -4R atagagcattctgttccatc -
SP1 -387 caatgttgccgacatcgtg - - -
SP2 -165 caccattgaatacagcataacagtc - -
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植物病理学报 42 卷
2. 2 S RNA全序列分析
序列经过拼接及校正后显示,SY的 S RNA全
长 3 257 nt,富含 A-U 的 IGR 将 NSs 和 N 分开。
SY各组分核苷酸数目与 Phm完全相同(表 2),二
者核苷酸序列同源性达 97. 0% 。 从表 2 看出,SY
基因组与另外 2 个分离物 TW 和 Tospo-melo 仅在
IGR的长度上有差异。 SY 与 TW 及 Tospo-melo
的全基因组核苷酸序列同源性分别为 94. 9%和
95. 3% 。
2. 3 NCR和 IGR序列分析
SY的 NCR 与其他分离物长度相同,5′ NCR
为 68 nt,3′ NCR 为 67 nt。 5′ NCR 的第 1 个碱基
为 G,其他分离物为 A。 各分离物的 3′ NCR 较保
守,SY与 Phm 仅 1 个差异位点,与 TW 和 Tospo-
melo有 2 个差异位点。 SY 的 5′ NCR 和 3′ NCR
有 60 nt互补形成锅柄状结构,其中有 2 个连续 8
nt的区域 GAGCAATC 及 GGTATCAA 与 3′ NCR
对应区域 CTCGTTAG 及 CCATAGTT 互补。 SY
的 5′ NCR 和 3′ NCR 互补的碱基数目少于 Phm
(68 nt互补,连续互补的区域长达 20 nt),也少于
TW及 Tospo-melo(66 nt互补,有 2 个连续 9 nt的
互补区域)。
SY与 Phm的 IGR核苷酸数目相同(872 nt)。
已测序的分离物中, IGR 长度变化较大 (表 2),
B07T长达 910 nt,Tospo-melo 仅为 847 nt。 SY 与
Phm的 IGR核苷酸序列同源性最高(94. 7% ),与
B07T同源性最低(84. 9% ),与其他 3 个分离物的
同源性为 85. 1% ~ 90. 2% 。
2. 4 编码区序列分析
SY病毒链 RNA编码 NSs(69 - 1478 nt),该
蛋白由 469 aa 组成,大小 53. 1 kDa。 核苷酸水平
上,SY与 Phm同源性高达 97. 8% ,与 SUT 同源性
最低(95. 7% )。 氨基酸水平上,SY与 Phm同源性
最高(98. 1% ),与其他分离物的同源性为 95. 9%
~ 97. 2% 。
SY互补链 RNA 编码 N,起始密码子 AUG 位
于 3 190 nt,终止密码子 UAA位于 2 351 nt。 N蛋
白含有 279 aa,大小 31. 0 kDa。 核苷酸水平上,SY
与 Phm同源性为 98. 3% ,与 B07T、C95S及 Kochi-
Haruno的同源性最低(96. 3% ),与其他分离物同
源性为 96. 5% ~ 97. 7% 。 氨基酸水平上,SY 与
Phm同源性最高(99. 6% ),与 SM12 同源性最低
(97. 5% ),与其他分离物的同源性为 98. 6% ~
99． 3% 。
Table 2 List of MYSV-SY and other isolates
Isolate
GenBank
Acc. No.
Host Source
Genome
(nt)
5′NCR
(nt)
NSs
(nt)
IGR
(nt)
N
(nt)
3′NCR
(nt)
SY GQ397254 Melon China 3257 68 1410 872 840 67
Phm (PSMV) AF067151 Physalis minima Thailand 3257 68 1410 872 840 67
TW FJ386391 Watermelon Taiwan, China 3244 68 1410 859 840 67
Tospo-melo AB038343 Melon Japan 3232 68 1410 847 840 67
B07T AB453910 Balsam pear Japan - - 1410 910 840 -
C95S AB453911 Cucumber Japan - - 1410 908 840 -
Kochi-Haruno AB076250 Cucumber Japan - - - - 840 -
SM12 HM590470 Cucumber India - - - - 840 -
WG17 AM087021 Wax gourd Thailand - - - - 840 -
JTC AY673635 Cucumber Thailand - - - - 840 -
Luffa13 AM087020 Luffa Thailand - - - - 840 -
SUT FR714507 Melon Thailand - - 1410 - 840 -
M7 AY574574 Melon Thailand - - - - 840 -
Ph122 AM113769 Physalis heterophylla Thailand - - - - 840 -
W3-Kalasin AY673636 Watermelon Thailand - - - - 840 -
WS1 FJ947154 Watermelon Thailand - - - - 840 -
W6422 AM113767 Watermelon Thailand - - - - 840 -
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5 期 陈红运,等:甜瓜黄斑病毒三亚分离物 S RNA的分子特征
2. 5 聚类分析
基于 SY等 17 个分离物的 N基因核苷酸序列
构建的系统树见图 1。 从图 1 看出,SY 等 17 个分
离物大致可分为 5 个分支:SY 和泰国分离物 Phm
为 1 个分支;日本分离物 B07T、C95S、Kochi-Haru-
no和泰国分离物 Luffa13 处于 1 个分支;泰国分离
物 M7,日本分离物 Tospo-melo 和台湾分离物 TW
为 1 个分支;泰国的 7 个分离物(Ph122、W3-Kala-
sin、W6422、SUT、WS1、 JTC 和 WG17)为 1 个分
支,其中 Ph122、W3-Kalasin 和 W6422 的关系更近
一些;印度分离物 SM12 单独 1 个分支。
3 讨论
葫芦科作物是 MYSV 的主要寄主,已经明确
的包括甜瓜、西瓜、黄瓜、苦瓜和丝瓜。 2007 年 7
月至 2009 年 12 月,Peng 等在台湾中南部调查
MYSV的发生情况,发现 10 480 份甜瓜样品中有
18. 2%感染 MYSV,1 811 份西瓜样品中有 9. 2%
感染 MYSV,该病毒已经严重威胁台湾的西瓜和
甜瓜生产[5]。 MYSV 已经在我国大陆扩散,除海
南三亚外,广西的甜瓜和广东的西瓜上也检测到该
病毒。 从全球范围看,MYSV 发生地包括泰国、日
本、印度、中国大陆及台湾,处于东亚和东南亚地
区。 MYSV的扩散速度虽然比同属的番茄斑萎病
毒慢得多,但其造成的危害却十分严重,且由棕榈
蓟马(Thrips palmi)以持久增殖型方式传播[1],生
产上应予以足够重视。
本研究测定了 MYSV三亚甜瓜分离物 S RNA
的核苷酸序列,无论是核苷酸数目还是序列同源性,
SY与泰国小酸浆分离物 Phm关系最近。 台湾西瓜
分离物 TW 和日本甜瓜分离物 Tospo-melo 的 S
RNA核苷酸序列同源性高达 98. 3% ,核苷酸数目也
较为接近,且在系统发育树上处于 1 个分支,表明二
者具有很近的亲缘关系。 相对于寄主种类而言,不
同分离物的亲缘关系与地域之间存在一定的相关
性,泰国的 7 个分离物(寄主包括酸浆、西瓜、甜瓜、
黄瓜、冬瓜)处于 1个分支,日本的 3个分离物(寄主
为苦瓜和黄瓜)处于 1个分支,印度分离物 SM12 单
独 1个分支;分离物与地域之间还有一定程度的交
叉,泰国分离物 Luffa13和日本分离物(B07T,C95S,
Kochi-Haruno)处于 1 个分支,泰国分离物 Phm 和
SY处于 1 个分支,泰国分离物 M7 和日本分离物
Tospo-melo及台湾分离物 TW处于 1 个分支,表明
泰国分离物具有丰富的多态性。
Fig. 1 Phylogenetic tree based on nucleotide sequence of N gene of MYSV isolates
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植物病理学报 42 卷
参考文献
[1] Kato K, Hanada K, Kameya-Iwaki M. Transmissions
mode, host range and electron microscopy of a patho-
gen causing a new disease of melon (Cucumis melo)
in Japan [ J] . Ann. Phytopathol. Soc. Jpn. , 1999,
65: 624 -627.
[2] Kato K, Hanada K, Kameya-Iwaki M. Melon yellow
spot virus: a distinct species of the genus Tospovirus
isolated from melon [ J] . Phytopathology, 2000, 90
(4): 422 -426.
[3] Chen T C, Lu Y Y, Cheng Y H, et al. Melon yellow
spot virus in watermelon a first record from Taiwan
[J] . Plant Pathology, 2008, 57: 765.
[4] Chao C H, Chen T C, Kang Y C, et al. Characteriza-
tion of Melon yellow spot virus infecting cucumber
(Cucumis sativus L. ) in Taiwan [J] . Plant Pathology
Bulletin, 2010, 19(1): 41 -52.
[5] Peng J C, Yeh S D, Huang L H, et al. Emerging
threat of thrips-borne Melon yellow spot virus on melon
and watermelon in Taiwan [ J] . European Journal of
Plant Pathology, 2011, 130(2): 205 -214.
责任编辑:
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于金枝
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