全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$("+(!)
&修改稿收到日期$
!"#$(##(##
基金项目$国家自然科学基金"
&#"+)""&
#
作者简介$刘翔宇"
#010
#!女!在读硕士研究生!主要从事电场生物效应的分子机理研究
2(34-5
$
566
777
)#%
!
#+%*893
"
通信作者$杨体强!教授!主要从事电场和低能离子束对植物影响的研究
2(34-5
$
7
4/
:
;
-3=*>?=*8/
电场处理柠条种子对干旱条件下
幼叶基因表达的影响
刘翔宇#!杨体强#"!胡燕飞#!王
!
郑!!哈斯阿古拉!!刘
!
瑶#!王文星#!赵清春#
"
#
内蒙古大学 物理科学与技术学院!呼和浩特
"#""!#
&
!
内蒙古大学 生命科学学院!呼和浩特
"#""!#
#
摘
!
要$以沙生植物柠条锦鸡儿为材料!设计自然对照"
@A
#(干旱处理对照"
B@A
#(电场处理"电场强度
!CD
%
83
!
电场频率
#&CEF
!处理时间
&3-/
#种子后在干旱条件下进行种子发芽"
2G
#!并采用
%
个锚定引物和
!+
个随机引
物形成
)1
组引物!利用
HHIG(J@I
技术!分析电场处理柠条种子在干旱胁迫条件下生长的幼苗幼叶基因表达水
平的变化!从基因转录水平探讨电场对柠条锦鸡儿抗旱性的影响机理结果显示$"
#
#干旱胁迫组相对于自然对照
组增加条带
!1!
条!缺失条带
#)0
条&电场处理组相对于自然对照组增加条带
%"%
条!缺失条带
!""
条&电场处理组
相对于干旱胁迫组增加条带
!%+
条!缺失条带
!&)
条"
!
#回收差异片段获得电场处理诱导的
%
个差异表达序列
"
2BG(#
(
2BG(!
(
2BG(%
#!经
K54.;/
比对!
2BG(#
与大豆
LM@#""%"&10&
"
LM@#""%"&10&
#一致性为
)+N
!
2BG(!
与
鹰嘴豆
OHJ(P(
乙酰氨基葡糖肽
P(
乙酰葡糖胺基转移酶
B2@(5-C>
"
LM@#"#&"+#1!
#选择性剪切体
Q!
一致性为
11N
!
2BG(%
与百脉根克隆
R@DS(TLL
,
(&U#!
一致性为
11N
"
%
#经
K54.;6
比对!
2BG(#
与
#(
脱氧
(H(
木酮糖
(&(
磷
酸还原异构酶"
%0"44
#
$&
"
#0&
氨基酸序列一致性达到
&!N
!
2BG(!
"
%"1V
W
#与氧连
P(
乙酰葡萄糖胺转移酶"
)$$
44
#
)"+
"
)$$
氨基酸序列一致性高达
0)N
!
2BG(%
与酰基辅酶
X
结合蛋白"
0"44
#氨基酸序列一致性高达
0)N
研
究结果为进一步从基因表达的角度分析电场的生物效应及其提高抗逆性的分子机理!为电场处理植物种子的农业
技术应用提供理论依据
关键词$电场&柠条种子&干旱胁迫&
HHIG(J@I
技术
中图分类号$
Y)10
文献标志码$
X
$%
&
())#"*+#,,((*-(",.(*()#*/0(1$($
2
$/$3&(45-/43- 1"2*
3
4(56()
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3
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#
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E^XMY-/
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#
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7
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2BG
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7
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7
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7
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W
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W
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7
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7
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7
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7
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9
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$
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&
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:
_;.;`>..
&
HHIG(J@I
!!
自
!"
世纪
+"
年代!
U=``
*
#
+与
B-?4b4
7
*
!
+先后
研究电场对植物细胞膜透性和种子发芽率的影响
后!人们用电场对多种植物的种子进行处理!研究电
场对种子的萌发(生理生化反应(幼苗生长发育(产
量与质量等表观特性的影响*%(#"+
!"
世纪
0"
年代!
研究人员在电场处理种子生物效应研究中!又发现
了高压电场对种子抗逆性"抗旱(抗冻等#的影
响*##(#$+已有的研究结果证明!用恰当的电场处理
种子!可提高种子活力!增强抗逆性!促进幼苗生长!
提高产量与质量电场处理种子所产生的作用!与
已有各种良种培育如农艺(生物(化学以及其它物理
方法相比!为农业生产提供了一种简便(快速(低能
耗和无污染(并实现稳产和高产的新技术但是!电
场处理种子的生物效应并没有得到广泛有效地开发
利用!其中一个很重要原因是电场生物效应机理尚
不十分清楚!缺乏理论指导在电场生物效应的机
理研究中!人们从酶活性变化!核酸(蛋白质代谢!酶
谱谱带!酶蛋白分子构象以及自由基*#&(!#+等不同角
度进行了分析本实验测定了电场处理柠条锦鸡儿
种子对干旱胁迫条件下幼叶基因表达的影响!从基
因转录水平分析电场对柠条锦鸡儿抗旱影响的机
理!为电场处理植物种子的农业技术提供理论基础
#
!
材料和方法
A*A
!
实验材料
以柠条锦鸡儿"
!"#"
$
"%"&#()*%(&**
#种子为
材料"以下简称柠条种子#!柠条种子
!"#!
年采自鄂
尔多斯草原
A*B
!
实验方法
A*B*A
!
电场处理(种子萌发和幼苗培养
!
电场处理
条件由场强(频率(处理时间
%
个变量组成电场由
!
块直径
+"83
的圆形金属平板电极产生种子单
层置于接地电极板上!调节两极板电场频率和电压
设置处理条件可调频高压电源由大连理工大学静
电与特种电源研究所制作在电场强度
#
"
$CD
%
83
!电场频率
1
"
#)CEF
!处理时间
&
"
#&3-/
范围
内
#!"
个不同电场处理条件中!筛选出显著提高种
子萌发和幼苗生长抗旱性的电场处理条件!即电场
强度
!CD
%
83
!电场频率
#&CEF
!处理时间
&3-/

本实验用筛选所得电场条件处理柠条种子!测定柠
条幼苗幼叶基因转录水平的变化实验设
!
个对照
组和电场处理组"
2G
#其中一个为自然对照组
"
@A
#!另一个为干旱胁迫对照组"
B@A
#
B@A
和
2G
种子萌发时用
J2[(+"""
模拟干旱胁迫
@A
用
%"3L
去离子水(
B@A
和
2G
用
%"3L
#+NJ2[(+"""
溶液浸泡
#"_
后进行萌发
#""
:
石英砂均匀铺在直径
#&83
培养皿内作为种子发芽
床!
@A
加入
!"3L
水!
B@A
和
2G
加入
!"3L
#+NJ2[(+"""
溶液种子萌发与生长在人工气候
室中"温度为
!&c
!湿度为
&"N
#进行种子萌发
后第
%
天移到相同尺寸塑料花盆中!花盆中盛有相
等质量的蛭石和水分各组幼苗生长的环境相同
生长期不再补充水分!幼苗生长
)?
时!取幼叶提取
总
IPX

ACBCB
!
柠条幼叶总
DE>
提取
!
柠条幼叶总
IPX
提取采用天根生化科技有限公司
IPX
W
54/;
W
5=.
植
+!$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
物
IPX
提取试剂盒进行提取的总
IPX
经
HP4.>
#
消化后!利用微量紫外分光光度计"
PH(
#"""
型!
P4/9H`9
W
#进行紫外比色确定其产量及纯
度!用
#N
非变性琼脂糖凝胶电泳"
2K
染色#检测其
完整性
ACBCF
!
-+E>
第一链合成
!
8HPX
第一链合成采
用天根生化科技有限公司
GSXPB8`-
W
;8HPX
第一
链合成试剂盒完成利用
G_>`39@
7
85>`
"
D>`;-GU
0+(b>5
!
XKS
#进行
J@I
反应
J@I
反应体积为
!"
$
L
!包含
$
$
:
总
IPX
!
$
L#"
$
395
,
L
#锚定引
物*生工生物工程"上海#+!编号为
K"%!)
(
K"%!1
(
K"%!0
"表
#
#!
!
$
L!*&3395
,
L
#
?PGJ
!
$
$
L
T-`.;B;`4/?V=;;>`
"
&d
#!
""OU(ULS
逆转录酶!
剩余体积用
IP4.>(\`>>
超纯水补齐于
$!c
反应
&"3-/

用表达量稳定的肌动蛋白"
%
(48;-/
#内参引物
8HPX
进行
J@I
扩增以检验
8HPX
质量
J@I
反
应体积为$
#*&
$
L8HPX
样品!
#!*&
$
LJ`>3-6
8"
9
GU
"
G4A4I4
#!
#
$
L#"
$
395
,
L
#内参引物!
#"
$
LIP4.>(\`>>
超纯水
J@I
反应参数为
0$c
预
变性
3-/
!
0$c
变性
%".
!
+"c
退火
%".
!
)!c
延伸
#3-/
!
"
个循环反应后!
)!c
补平
#"3-/
用
#N
琼脂糖凝胶电泳检测
8HPX
第一链合成情况
ACBCG
!
++D!
采用上述
%
个锚定引物和
!+
个随机引物*生工生物工程"上海#+!编号为
K"%"#
"
K"%!+
"表
#
#!形成
)1
组引物!分别以
@A
(
B@A
(
和
2G
(逆转录产物为底物进行
%d)1
个
J@I
反应
J@I
反应体积为
!&
$
L
$
#*&
$
L8HPX
样品!
#!*&
$
LJ`>3-68"
9
!
#"
$
395
,
L
#锚定引物和随机引
物各
"*&
$
L
!
#"
$
LIP4.>(\`>>
超纯水
J@I
反应
参数为
0$c
预变性
&3-/
!
0$c
变性
%".
!
$!c
退
火
#3-/
!
)!c
延伸
#3-/
!
$"
个循环反应后!
)!c
补平
#"3-/
扩增产物于
!"c
保存
A*B*K
!
变性聚丙烯酰胺电泳(银染及产物回收
!
用
+N
尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差显产物
取
!
$
LJ@I
产物加甲酰胺上样缓冲液
$
$
L
!
0"c
变性
&3-/
!恒定电压
!""D
!电泳
#_
将凝胶浸泡
在
X
:
PM
%
溶液"
!
:
%
LX
:
PM
%
!
#"N
无水乙醇#中!
于水平摇床"
E^]Z(##"!
!上海智城分析仪器制造
有限公司#上振荡染色
#"3-/
!然后蒸馏水漂洗
!
次!于显色液"
!"
:
%
LP4ME
!
"*!N
甲醛#中显色
直到银染
HPX
条带和背景有适宜对比度时"约
#"
3-/
#!蒸馏水中漂洗数次中止显色
使用生工生物工程"上海#
OPSY(#"
柱式
JX[2
表
A
!
引物序列
G4V5>#
!
J`-3>`.>
<
=>/8>.
引物
J`-3>`
序列
B>
<
=>/8>.
"
&e
#
%e
#
K"%"# GX@XX@[X[[
K"%"! G[[XGG[[G@
K"%"% @GGG@GX@@@
K"%"$ GGGG[[@G@@
K"%"& [[XX@@XGG@
K"%"+ XXX@G@@[G@
K"%") G@[XGX@X[[
K"%"1 G[[GXXX[[[
K"%"0 G@[[G@XGX[
K"%#" [[GX@XGG[[
K"%## GX@@GXX[@[
K"%#! @G[@GG[XG[
K"%#% [GGGG@[@X[
K"%#$ [XG@XX[G@@
K"%#& [XG@@X[GX@
K"%#+ [XG@X@[GX@
K"%#) [XG@G[X@X@
K"%#1 [XG@G@X[X@
K"%#0 [XG@XGX[@@
K"%!" [XG@XXG@[@
K"%!# [XG@GXX@@[
!
K"%!! [XG@[@XGG[
K"%!% [XG@G[X@G[
K"%!$ [XG@XG[[G@
K"%!& [XG@XGX[@[
K"%!+ [XG@GXX[[@
K"%!) XX[@GGGGGGGGGGGX
K"%!1 XX[@GGGGGGGGGGG[
K"%!0 XX[@GGGGGGGGGGG@
胶
HPX
回收试剂盒回收差异片段以回收的差异
条带为模板进行二次
J@I
扩增
A*B*L
!
差异表达序列分析
!
利用
W
UH
#0
(GD>8;9`
载体"
G4A4I4K-9;>8_/959
:7
#连接(克隆二次扩增
J@I
产物!随后转入感受态细胞
HE&
&
"天根生化科
技有限公司#筛选重组克隆进行测序*测序由生工
生物工程"上海#完成+
用
HPX34/+*"
软件"
L
7
//9/K-9.9\;
#人工去
除克隆测序结果中的载体序列采用
KLXBG
对
2BG
差异序列进行比对
ACBCM
!
D验证差异基因
!
利用
J`-3>`
J`>3->` &*"
软件设计引物分别重新提取自然对
照组(胁迫对照组和电场处理组的
IPX
!重复
%
次
并合成
8HPX
第一链以合成的
8HPX
和回收的
差异片段为模板!加入对应的上下游引物!通过
IG(
J@I
扩增进行鉴定用回收的差异片段扩增得到
)!$!
#!
期
!!!!!!!!!!!
刘翔宇!等$电场处理柠条种子对干旱条件下幼叶基因表达的影响
的产物为标准条带进行假阳性鉴定
!
!
结果与分析
BCA
!
++D结果分析以及差异条带
D验证
柠条幼叶总
IPX
琼脂糖凝胶电泳结果"图
#
#
显示!
IPX
分子
!1B
(
#1B
的条带清晰!完整性较
好实验中测得各组
IPX
的
MH
!+"
%
!1"
和
MH
!+"
%
!%"
均在
!*"
左右!适用于差异显示分析
从
%
(48;-/
琼脂糖凝胶电泳结果"图
!
#可知!在
#""
"
!""V
W
之间出现清晰的单一条带!条带位置
与预期大小"
#1"V
W
#相符!表明逆转录合成的
8H(
PX
第一链完整性较好
分别以
@A
组(
B@A
组和
2G
组的逆转录产物
为 底物!采用
%
种锚定引物与部分随机引物形成
)1
图
#
!
不同处理柠条幼叶总
IPX
电泳图
@A*
自然条件下的种子发芽幼苗&
B@A*
干旱处理下的种子萌发
幼苗&
2G*
电场处理"电场强度
!CD
%
83
!电场频率
#&CEF
!处理
时间
&3-/
#后的种子在干旱处理下萌发的幼苗&下同
T-
:
*#
!
25>8;`9
W
_9`>.-.9\!+&#()*%(&**
7
9=/
:
5>4a>.;9;45IPX
@A*P4;=`>89/;`95
&
B@A*H`9=
:
_;.;`>..89/;`95
&
2G*25>8;`-8
\->5?;`>4;3>/;
"
.;`>/
:
;_!CD
%
83
!
\`>
<
=>/8
7
#&CEF
!
;-3>&3-/
#&
G_>.43>4.V>59b*
对引物组合进行
HHIG(J@I
结果"图
$
#显示!大
多数高分辨力的差异片段在
!"""CV
以下"图
$
中
!"""CV
以下条带进行了标记#每一组引物的
@A
(
B@A
和
2G
差异结果显示!既有新出现的条带!
也有消失的条带
B@A
与
@A
间的差异条带数为
$+#
条!其中增加
!1!
条!缺失
#)0
条&
2G
与
@A
间
差异条带为
&"%
条!其中增加
%"%
条!缺失
!""
条&
2G
与
B@A
间差异条带数为
$0%
条!其中增加
!%+
条!缺失
!&)
条
IG(J@I
鉴定得到
%
个差异表达的条带"图
%
#从图
%
!
4
可知!只有
2G
出现清晰的单一条带!
条带位置与回收的差异片段位置相符!表明
2BG(#
是电场处理诱导表达的从图
%
!
V
可看出!
@A
(
B@A
和
2G
均出现清晰单一条带!条带位置与回收
的差异条带位置相符!但可看出
B@A
的表达量明显
少于
@A
和
2G
!说明
2BG(!
在自然条件下是正常
表达的!干旱胁迫抑制了
2BG(!
的表达!使
2BG(!
表达量下降!而电场处理使
2BG(!
的表达恢复正
常从图
%
!
8
可看出!只有
B@A
在回收条带的相应
图
!
!
8HPX
第一链
!
(48;-/
基因电泳结果
T-
:
*!
!
25>8;`9
W
_9`>.-.9\8HPX\-`.;8_4-/
!
(48;-/
:
>/>
图
%
!
IG(J@I
结果
U*HL!"""
&
"*
回收得到的差异片段&
X*2BG(#
&
K*2BG(!
&
@*2BG(%
&
#*@A
&
!*B@A
&
%*2G
T-
:
*%
!
IG(J@I >`.=5;.
U*HL!"""
&
"*H-\\>`>/;-45\`4
:
3>/;.`>89a>`>?
&
X*2BG(#
&
K*2BG(!
&
@*2BG(%
&
#*@A
&
!*B@A
&
%*2G
1!$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
部分差异条带结果
U*HL!"""
&
#*@A
&
!*B@A
&
%*2G
&
4
"W
*
不同引物对扩增结果&白色箭头为增加条带!黑色箭头为缺失条带
T-
:
*$
!
J4`;-45`>.=5;.9\;_>?-\\>`>/;-45V4/?.
U*HL!"""
&
#*@A
&
!*B@A
&
%*2G
&
4
W
*H-\\>`>/;-45?-.
W
54
7
>`.=5;.9\>48_
W
-`3>`
W
4-`
&
G_>b_-;>4` 9`b.` >
W
>`.>/;
4
WW
>4`>?V4/?.4/?;_>V548C4` 9`b.` >
W
>`.>/;?-.4
WW
>4`>?V4/?.
表
B
!
差异表达序列的
N:5)/*
比对结果
G4V5>!
!
G_>`>.=5;.9\893
W
4`-/
:
?-\\>`>/;-45>6
W
>`..>?.>
<
=>/8>.b-;_K54.;/
序列
B>
<
=>/8>
长度
L>/
:
;_
%
V
W
同源序列
E93959
:
=>.>
<
=>/8>
一致性
S?>/;-;
7
%
N
2BG(# &%$
大豆
LM@#""%"&10&
"
LM@#""%"&10&
#
,-
.
/*%01"2=/8_4`48;>`-F>?LM@#""%"&10&
"
LM@#""%"&10&
#
)+
2BG(! %"1
鹰嘴豆
OHJ(P(
乙酰氨基葡糖肽
P(
乙酰葡糖胺基转移酶
B2@(5-C>
"
LM@#"#&"+#1!
#!选择性剪切体
Q!
!
!*/0#"#*03*%41
W
9`V4V5>
OHJ(P(48>;
7
5
:
5=89.43-/>
)))
W
>
W
;-?> P(48>;
7
5
:
5=89.43-/
7
5;`4/.(
\>`4.>B2@(5-C>
"
LM@#"#&"+#1!
#!
;`4/.8`-
W
;a4`-4/;Q!
11
2BG(% $)!
百脉根克隆
R@DS(TLL
,
(&U#!
534(
6
"
7
%*/4(859/>R@DS(TLL
,
(&U#!
11
位置出现单一清晰条带!自然条件
2BG(%
是不表达
的!干旱胁迫诱导
2BG(%
表达!而电场处理后!
2BG(
%
不再表达了!表明
2BG(%
是干旱胁迫诱导表达的
B*B
!
差异条带生物信息学分析
由于
[>/K4/C
中没有柠条的基因组信息!利用
K54.;/
对
2BG
序列进行同源比对"表
!
#!发现
2BG(
#
与大豆
LM@#""%"&10&
"
LM@#""%"&10&
#一致性
为
)+N
!
2BG(!
与鹰嘴豆
OHJ(P(
乙酰氨基葡糖肽
P(
乙酰葡糖胺基转移酶
B2@(5-C>
"
LM@#"#&"+#1!
#
选择性剪切体
Q!
一致性为
11N
&
2BG(%
与百脉根
克隆
R@DS(TLL
,
(&U#!
一致性为
11N

利用
K54.;6
对
2BG
序列比对!结果"表
%
#表明
0!$!
#!
期
!!!!!!!!!!!
刘翔宇!等$电场处理柠条种子对干旱条件下幼叶基因表达的影响
表
F
!
差异表达序列
N:5)/%
比对结果
G4V5>%
!
G_>`>.=5;.9\893
W
4`-/
:
?-\\>`>/;-45>6
W
>`..>?.>
<
=>/8>.b-;_K54.;6
序列
B>
<
=>/8>
长度
L>/
:
;_
%
V
W
同源序列
E93959
:
=>.>
<
=>/8>
一致性
S?>/;-;
7
%
N
2BG(# &%$
#(
脱氧
(H(
木酮糖
(&(
磷酸还原异构酶"
%0"44
#
#(?>96
7
(H(6
7
5=59.>&(
W
_9.
W
_4;>` >?=8;9-.93>`4.>
"
%0"44
#
&!
2BG(! %"1
氧连
P(
乙酰葡萄糖胺转移酶"
)$$44
#
M(5-/C>?[58P48;`4/.\>`4.>5-C>
W
9`;>-/
"
)$$44
#
0)
2BG(% $)!
酰基辅酶
X
结合蛋白"
0"44
#
!
48
7
5(@9X(V-/?-/
:W
9`;>-/
"
0"44
#
0)
2BG(#
与
#(
脱氧
(H(
木酮糖
(&(
磷酸还原异构酶"
%0"
44
#
#$&
"
#0&
比较!
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!相同残基数为
#1
个"
S(
?>/;-;->.f#1
%
&#
#!相同和相似残基数总和为
!)
个
"
J9.-;-a>.f!)
%
&#
#!氨基酸序列一致性达到
&!N
&
2BG(!
与氧连
P(
乙酰葡萄糖胺转移酶"
)$$44
#
)"+
"
)$$
比较!
2f#>(#1
!相同残基数为
%+
个"
S?>/;-(
;->.f%+
%
%0
#!相同和相似残基数总和为
%1
个"
J9.(
-;-a>.f%1
%
%0
#!氨基酸序列一致性高达
0)N
&
2BG(
%
与酰基辅酶
X
结合蛋白"
0"44
#比较!
2f$>(&!
!
相同残基数为
1"
个"
S?>/;-;->.f1"
%
0"
#!相同和相
似残基数总和为
11
个"
J9.-;-a>.f11
%
0"
#!氨基酸
序列一致性也高达
0)N

%
!
讨
!
论
研究表明*!!+!电场处理柠条种子增强了种子萌
发期和幼苗期的抗旱性本研究结果表明!电场处
理的柠条种子在干旱胁迫条件下生长的幼苗基因转
录发生了变化
已有研究表明!电场对
XGJ
合成产生影响*!%+
XGJ
作为生命活动过程中的初级能源!参与生命现
象中很多生理生化过程!包括转录和翻译电场作
用过程是一个能量输入过程!电场能诱导细胞内
XGJ
的形成*!$+!
XGJ
的增加有可能使植物开启某
些抗逆基因的概率提高
2BG(#
可能是电场处理诱导激活了耐干旱性相
关基因的表达!其产物可能与降低干旱胁迫对柠条
造成伤害有关
2BG(!
被干旱胁迫抑制!在
B@A
组
表达量减少!电场处理使
2BG(!
表达恢复正常!可
能是电场处理修复了干旱胁迫造成的损伤
2BG(%
可能转录的产物为酰基辅酶
X
结合蛋白"
X@KJ
#
X@KJ
是一个参与植物逆境反应的蛋白家族该家
族的蛋白结构保守!一个酰基辅酶
X
结合结构域
"
X@K
#!能与长链的酰基辅酶
X
结合!在酰基辅酶
X
代谢中发挥作用大分子
X@KJ
影响植物的生
长发育!在植物抗生物胁迫和非生物胁迫的反应中
起着重要作用
B@A
组表达
2BG(%
而
2G
组未表
达!说明电场处理减轻了干旱胁迫程度!从而降低了
干旱胁迫的损伤
[>/K4/C
中无
2BG(#
(
2BG(!
(
2BG(%
及其同源
序列的功能信息本实验分离到的
2BG
序列较小!
不一定能代表差异表达基因的全部信息因此还需
进一步获得差异表达序列的全长
8HPX
并对基因
片段的功能进行鉴定!以期分析电场处理柠条种子
对其抗旱性影响的分子机理生物功能是由基因的
表达实现的!分析电场对基因表达的影响!可能是阐
明电场处理种子生物效应原发机制的有效途径
参考文献!
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