全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 333鄄336(2011)
收稿日期: 2010鄄05鄄20; 修回日期: 2011鄄02鄄05
基金项目: 教育部科学技术研究重点项目(210111); 重庆市自然科学基金资助项目(CSTC, 2009BB1310)
通讯作者: 易 龙,副教授,主要从事植物病害生物防治研究; Tel: 0797鄄8393068, E鄄mail: yilongswu@163. com。
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研究简报
防治烟草根黑腐病拮抗芽孢菌株的筛选
易 龙1,2*, 肖崇刚2, 马冠华2
( 1赣南师范学院化学与生命科学学院, 江西 赣州 341000; 2西南大学植物生态病理研究所, 重庆 400716)
Screening of antagonistic Bacillus spp. against Thielaviopsis basicola 摇 YI Long1,2,
XIAO Chong鄄gang2, MA Guan鄄hua2 摇 ( 1College of Chemistry and Life Science, Gannan Normal University, Ganzhou
Jiangxi 341000, China; 2 Institute of Plant Ecology & Pathology, Southwest University, Chongqing 400716, China)
Abstract: Among 265 bacterial isolates obtained from tobacco rhizosphere collected from Chongqing, 5 ba鄄
cillus strains were showed high antagonistic effect against Thielaviopsis basicola, the pathogen of tobacco
black root rot. The inhibition zone diameters were ranged from 7. 0 - 10. 5 mm by pairing culture on PDA
plates. Strain R27 effectively reduced the incidence of tobacco black root rot, and the control efficacy reached
80. 2% in greenhouse experiment. The culture filtrate of strain R27 could inhibit hyphal growth and reduce
spore germination of T. basicola. According to the characteristics of morphology, physiology and biochemis鄄
try, and analysis of its 16S rDNA sequence, strain R27 was identified as Bacillus subtilis.
Key words: Tobacco black root rot; Bacillus subtilis; biocontrol; inhibition effect
文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0333鄄04
摇 摇 由基生根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)引
起的烟草根黑腐病是烟草生产上重要根部真菌病
害,近年在我国烟草种植区有加重危害的趋势,目
前防治措施主要依赖化学药剂,给卷烟卫生带来一
系列问题[1]。 探索该病生物防治途径,克服农药
残留和病原菌抗药性十分重要。 芽孢杆菌是土壤
和植物微生态区系的优势生物种群,具有优良生防
特性[2],采用芽孢杆菌作为烟草根黑腐病生防因
子尚未见报道。 本研究从烟草根际土壤中分离筛
选对烟草根黑腐病病菌有较强拮抗作用的芽孢菌
株,研究其抑菌活性、控病作用及其分类学地位。
1摇 材料与方法
1. 1摇 供试材料
烤烟品种 K326,温室培育至 6 ~ 8 片真叶备
用。 烟草根黑腐病病菌由西南大学植物生态病理
研究所提供。 对照药剂为 70%甲基托布津可湿性
粉剂(日本曹达株式会社)、50%多菌灵(四川国光
农化有限公司)可湿性粉剂。
1. 2摇 试验方法
1. 2. 1摇 拮抗芽孢菌株的筛选 摇 参考 Fang[3]的方
法,从重庆酉阳、武隆、彭水烟区烟株 60 份根际土
样中筛选拮抗烟草根黑腐病病菌的芽孢菌株,测定
抑菌带宽度,每菌株 3 次重复,并挑取受抑制的病
菌菌丝于 Motic Imagi 2000 型显微镜 16 伊 40 倍下
镜检、拍照。
1. 2. 2摇 拮抗菌株的控病效果测试摇 收集在牛肉膏
蛋白胨液体培养基(NB)中 28 ~ 30益,180 r / min
振荡培养 72 h的拮抗菌发酵液,取 5 mL灌根处理
备用烟苗,每处理 15 株,重复 4 次,24 h 后于烟株
摇
植物病理学报 41 卷
茎基部灌根接种浓度为 2 伊 105 个 / mL 烟草根黑
腐病病菌孢子悬浮液,24 ~ 26益下培育 15 d 后调
查发病率、病情指数,SPSS12. 0 软件统计分析。 设
70%甲基托布津、50%多菌灵 1 000 倍液以及清水
和 NB液体培养基处理为对照。
1. 2. 3摇 拮抗菌株无菌发酵液对根黑腐病病菌的抑
制作用摇 将具有较好防效的菌株按上述方法制备
发酵液,经 15 000 r / min离心 20 min,取上清液,用
0. 22 滋m孔径微孔滤膜过滤为无菌滤液。
(1)对病菌菌丝生长的抑制作用 摇 采用菌落
直径法[3],将 5 mm病菌菌块置于无菌滤液终浓度
为 15% 、10% 、6% 、3%的 PDA平板中央,设 3 次重
复,26益培养 3、6 和 9 d 后测量各处理菌落增长直
径,计算抑菌率。 以未接菌的液体培养基过滤液按
比例制成的平板为对照。
(2)对病菌孢子萌发的抑制作用 摇 将浓度为
2 伊 105 个 / mL 病菌孢子悬浮液同浓度为 100% 、
50% 、25%的无菌发酵液按 1颐 1(V颐 V)混和,使无
菌发酵液终浓度为 50% 、25% 、12. 5% ,26益下培
养 6、12 和 24 h后镜检孢子萌发数,每处理重复 3
次,每次镜检 150 ~ 200 个孢子,计算孢子萌发抑制
率。 设未接菌的液体培养基过滤液以相同比例处
理的作对照。
1. 2. 4摇 菌株的分类鉴定摇 菌株形态特征、培养性
状、生理生化指标根据 《伯杰氏系统细菌学手
册》 [4]测定。 以通用引物[5]扩增菌株 16S rDNA,
产物送交上海生工测序,序列在 GenBank 数据库
中进行 BLAST比对,构建系统进化树聚类分析。
2摇 结果与分析
2. 1摇 拮抗芽孢菌株的筛选
筛选获得 265 个分离物,初测菌株 R12、R27、
R95、R192 和 R203 对烟草根黑腐病病菌有较好的
拮抗作用,抑菌带宽度为 7. 0 ~ 10. 5 mm。 其中
R27 的抑制效果最好,抑菌带宽度达 10. 5 mm
(图 1),镜检发现病菌菌丝受其抑制呈畸形,菌丝
顶端膨大呈泡状,失去进一步生长的能力(图 2)。
Fig. 1 摇 Inhibition of strain R27 against
Thielaviopsis basicola on PDA me鄄
dium
2. 2摇 温室控病试验
接种 15 d后,经菌株 R27 处理的烟苗病情指
数与对照相比,在 P = 0. 05 水平上达到显著,温室
盆栽防效达 80. 2% (表 1),与对照药剂多菌灵、甲
基托布津处理效果无明显差异。
Fig. 2摇 Morphology of hypha of Thielaviopsis basicola inhibited by R27
A: Normal hypha; B: Abnormal hypha.
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摇
摇 3 期 易 龙,等:防治烟草根黑腐病拮抗芽孢菌株的筛选
2. 3 摇 拮抗菌株无菌滤液对烟草根黑腐病病菌的
抑制作用
2. 3. 1摇 对病菌菌丝生长的抑制作用摇 R27 无菌滤
液在试验浓度范围对病菌菌丝生长均具有抑制作
用(表 2),6. 0%以上的浓度对病菌菌丝生长有明
显的抑制效果。
2. 3. 2摇 对病菌孢子萌发的抑制作用摇 R27 无菌滤
液在 25%以上浓度对病菌孢子萌发有较好的抑制
效果(表 3);其浓度为 12. 5%时,病菌孢子虽能大
量萌发,但萌发的芽管前端膨大、扭曲,不能进一步
发育为菌丝体。
Table 1摇 The effect of antagonistic strains to control tobacco black root rot disease
Treatment Disease incidence / % Disease index Control effect / %
Water (CK) 98. 4 依 1. 0 a 65. 6 依 1. 9 a -
Liquid medium 98. 5 依 0. 8 a 65. 9 依 1. 3 a 0
R12 40. 8 依 2. 8 d 18. 9 依 1. 9 d 71. 2 依 3. 0
R27 30. 0 依 1. 4 e 13. 0 依 1. 7 e 80. 2 依 2. 6
R95 49. 1 依 3. 0 c 30. 9 依 1. 7 c 52. 8 依 3. 5
R192 40. 7 依 1. 1 d 20. 4 依 1. 4 d 68. 9 依 2. 7
R203 64. 8 依 2. 4 b 52. 1 依 2. 1 b 20. 4 依 4. 3
Carbendazol 30. 2 依 1. 5 e 12. 7 依 1. 9 e 80. 6 依 3. 2
Thiophanatemethyl 25. 7 依 1. 3 f 10. 4 依 0. 9 e 84. 1 依 1. 7
Note: Values followed by different small letters in the same column are significantly different at 0. 05 level by DMRT.
Table 2摇 Inhibition of culture filtrate of strain R27 to hyphal growth of Thielaviopsis basicola
Final
concentration
/ %
3 d
Increased diameter
/ mm
Inhibition rate
/ %
6 d
Increased diameter
/ mm
Inhibition rate
/ %
9 d
Increased diameter
/ mm
Inhibition rate
/ %
CK 27. 8 依 0. 4 - 51. 5 依 0. 4 - 67. 9 依 0. 3 -
3. 0 22. 1 依 0. 2 20. 6 依 0. 5 a 36. 9 依 0. 4 28. 4 依 0. 6 a 50. 3 依 0. 2 26. 0 依 0. 4 a
6. 0 6. 7 依 0. 4 75. 9 依 1. 1 b 11. 9 依 0. 5 77. 0 依 1. 1 b 16. 4 依 0. 7 75. 8 依 1. 2 b
10. 0 3. 7 依 0. 5 86. 7 依 1. 9 c 6. 4 依 0. 6 87. 6 依 1. 0 c 8. 5 依 0. 6 87. 5 依 0. 8 c
15. 0 2. 7 依 0. 2 90. 4 依 0. 7 d 4. 9 依 0. 4 90. 5 依 0. 7 d 6. 5 依 0. 4 90. 4 依 0. 7 d
Note: Values followed by different small letters in the same column are significantly different at 0. 05 level by DMRT.
Table 3摇 Inhibition of culture filtrate of strain R27 to spore germination of Thielaviopsis basicola
Final
concentration
/ %
6 h
Germination rate
/ %
Inhibition rate
/ %
12 h
Germination rate
/ %
Inhibition rate
/ %
24 h
Germination rate
/ %
Inhibition rate
/ %
CK 49. 1 依 1. 3 - 74. 3 依 0. 7 - 88. 0 依 0. 7 -
12. 5 24. 0 依 0. 9 51. 2 依 1. 2 a 58. 4 依 0. 7 21. 4 依 1. 7 a 72. 4 依 0. 8 17. 7 依 1. 1 a
25. 0 7. 8 依 0. 4 84. 1 依 0. 8 b 12. 5 依 1. 3 83. 0 依 1. 8 b 17. 9 依 0. 4 79. 7 依 0. 5 b
50. 0 3. 4 依 0. 6 93. 1 依 1. 5 c 8. 2 依 1. 0 88. 9 依 1. 3 c 11. 2 依 0. 4 87. 2 依 0. 4 c
Note: Values followed by different small letters in the same column are significantly different at 0. 05 level by DMRT.
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摇
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2. 4摇 菌株 R27 的分类学地位
菌株 R27 在 NA 培养基上菌落边缘不整齐,
干燥,乳白色,无光泽;单细胞,杆状,单生或双生,
大小为(0. 8 ~ 1. 2) 滋m 伊 (1. 9 ~ 4. 9) 滋m;革兰氏
染色阳性,芽孢卵圆形,中生,周生鞭毛。 石蕊牛奶
胨化、产碱;淀粉水解、接触酶、V鄄P 反应、明胶液
化、硝酸盐还原反应均为阳性;厌氧生长、酪氨酸、
马尿酸盐、丙酸盐的利用均为阴性;可在含 7%
NaCl和 pH 5. 7 的 NA培养基上生长。
测定获得菌株 R27 的 16S rDNA 序列 1 420
bp(GenBank登录号 HM164681),在 NCBI 数据库
经 BLAST比对,与其同源性较高的菌株均属芽孢
杆菌属,其中与 Bacillus subtilis(EU373428)的序列
相似性达 99. 8% 。 系统进化树聚类分析表明,菌
株 R27 与 B. subtilis 聚类在同一支,相似性最高。
根据菌株形态、培养性状和生理生化特性,结合其
16S rDNA序列分析结果,将其归为 B. subtilis。
3摇 讨论
烟草根黑腐病是危害烟草生产的重要土传病
害,其病原菌是一种土壤习居菌,通过菌丝侵入寄
主植物导致发病,本试验筛选获得的芽孢菌株 R27
能很好地抑制烟草根黑腐病菌菌丝的生长及其致
病性,其无菌滤液的各种处理终浓度下对病菌孢子
萌发均有一定的抑制作用,进一步提取浓缩有效成
分,在较低的浓度下可能会对烟草根黑腐病病菌有
较好的抑制效果。
试验菌株 R27 来自重庆烟区烟株根际土壤,
对烟田生态环境更为适应,并且在控病测试中,经
拮抗菌菌液处理的烟苗发病率和病情指数与对照
相比明显降低,温室盆栽防效达 80. 2% ,接近目前
在生产上使用的多菌灵和甲基托布津药剂的防治
效果,说明其具有较好的生防潜能,有望成为烟草
根黑腐病的生防菌株。
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责任编辑:于金枝
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