全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(4): 440-444(2012)
收稿日期: 2012-04-08; 修回日期: 2012-05-18
基金项目: 国家粮食丰产科技工程(2011BAD16B08)
通讯作者: 吉万全, 教授, 博士生导师, 主要从事小麦遗传育种与分子生物学研究。
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췍研究简报
小麦种质 N9820 抗白粉病的特异基因表达谱分析
吴金华1, 马峙英1, 张西平2, 吉万全3*
( 1河北农业大学农学院, 保定 071001; 2 河北农业大学城乡建设学院, 保定 071001; 3 西北农林科技大学农学院, 杨凌 712100)
Expression of special genes resistant to powdery mildew (Blumeria graminis f. sp.
tritici) in wheat germplasm N9820 　 WU Jin-Hua1, MA Zhi-ying1, Zhang Xi-ping2, JI Wan-quan3
( 1College of Agronomy, Agricultural University of , Baoding 071001,China; 2 Institute of Urban and Rural Construction, Agri-
cultural University of Hebei, Baoding 071001, China; 3College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100,
China)
Abstract: Wheat germplasm N9820, developed by our research group, is a resistant material to powdery mil-
dew. In order to understand the resistant mechanism of wheat germplasm N9820 to powdery mildew infection,
a suppression subtraction hybridization (SSH) cDNA library was constructed with cDNA from N9820 leaf in-
oculated with Blumeria graminis as the tester and cDNA from N9820 healthy leaf as the driver. A total of 122
positive clones were randomly chosen from the SSH-cDNA library. After screening of repeated and redundant
sequences, 61 ESTs were acquired. Nucleic acid and protein homology search were performed using the
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program with the default settings at NCBI website ( http: / /
www. ncbi. nlm. nih. gov) . BlastX results in nr-protein database revealed that 35 ESTs were highly homolo-
gous with known proteins involved in signal transduction, metabolism, cell structure, energy metabolism,
transport, protein synthesis and processing, and disease resistance. BlastNr results showed that 47 ESTs had
high identities with known ESTs, and 14 ESTs matched none in the nr-database. Compared with BlastX and
BlastNr analysis, 19 ESTs were both in the nucleic acid and protein databases including 5 for energy metabo-
lism, 2 for transport, 3 for protein synthesis and processing, and 2 for disease resistance. The most frequent
sequence was ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit.
Key words: wheat; powdery mildew; suppression subtraction hybridization ( SSH); Expressed sequence
tags(EST)
文章编号: 0412-0914(2012)04-0440-05
　 　 小麦白粉病是由白粉菌(Blumeria graminis f.
sp. tritici)引起的世界性真菌病害之一,白粉病原
菌的生理小种多,毒性变异速度快,很容易造成品
种抗病性的丧失。 培育抗病新品种有两种基本措
施,一是发现与利用新的抗病基因;二是诱导防御
基因的适当表达。 抗病基因的产物决定抗病系统
能否打开或打开该系统的程度,而真正起抗病作用
的是防御基因[1]。
抑制性消减杂交(SSH)揭示不同条件下差异
基因的表达状况, 为相关候选基因的分离和克隆
提供理论基础。 Luo 等[2]构建了一个白粉菌接种
初期的抑制消减杂交文库,获得抗病相关 EST 65
　
　 4 期 　 　 吴金华,等:小麦种质 N9820 抗白粉病的特异基因表达谱分析
种。 Chen等[3]通过抑制性消减杂交及电子克隆技
术克隆了编码小麦抗坏血酸过氧化物酶的全长
cDNA。 本研究构建抗白粉病小麦在白粉菌接种
前后的抑制消减杂交文库,分析其在白粉菌诱导下
的基因表达谱,为系统揭示小麦抗白粉病的分子机
制,发现小麦抗白粉病的关键基因,寻找新的提高
小麦抗白粉病的有效途径奠定基础。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
小麦抗白粉病种质 N9820 幼苗在温室内培养
3 周后,采用涂抹法接种陕西关中地区白粉菌优势
小种关中 4 号,以不接种为对照。 接种后 72 h,分
别取对照和接种材料的叶片。
1. 2　 SSH-cDNA文库的构建
提取叶片总 RNA(BIOZOL,杭州博日),纯化
后采用 AMV 反转录酶(Promega,美国)合成 cD-
NA,以接种叶片的 cDNA为 tester,对照叶片的 cD-
NA 为 driver,依照 PCR Select cDNA Subtraction
Kit(Clontech,美国)的说明书进行抑制性消减杂交
(SSH)。
1. 3　 序列测定及生物信息学分析
利用 HQ&Q 质粒微量抽提试剂盒(优晶,安
徽)提取质粒 DNA,送上海生物工程有限公司测
序。 测序所得序列去除冗余和重复序列以及小于
100 bp的序列,提交 GenBank 数据库。 所得 EST,
对 NCBI的非冗余蛋白数据库和核酸数据库进行
Blast比对。
2　 结果与分析
2. 1　 SSH-cDNA文库的构建
提取的小麦叶片总 RNA 的 A260 / A280值介于
1. 8 ~ 2. 0,A260 / A230值大于 2. 0,表明提取的总
RNA质量良好,达到建库要求。
经 AMV反转录酶合成的双链 cDNA 呈弥散
状,大小分布在 200 ~ 2 000 bp之间,cDNA合成效
果较好。 运用 SSH 技术进行正向差减杂交构建
SSH-cDNA文库,文库中随机挑取阳性克隆进行
PCR扩增,片段大小介于 200 ~ 1 000 bp 之间,表
明构建的文库质量较好。
2. 2　 EST序列的比对分析
在经菌落 PCR 鉴定的克隆中,随机选取 122
个克隆进行测序,去除冗余序列和重复序列以及小
于 100 bp的序列后,将获得的 61 个非重复序列递
交 GenBank。 GenBank 序 列 号 为 EX567451-
EX567511,dbEST-Id为 50073415-50073475。
2. 2. 1 　 BlastX 比对 　 对所获 61 条 EST 在 NCBI
的非冗余蛋白数据库的 BlastX 比对结果表明,35
条 EST(占全部 EST 的 59% )与已知功能蛋白同
源性较高,主要涉及信号转导(占 5. 7% )、代谢
(2． 9% )、细胞结构 (占 2. 9% )、能量代谢 (占
20% )、转运(占 8. 6% )、蛋白质的合成与加工和储
藏(占 11. 4% )、抗病防御(17. 1% )、其它 31. 4%
(表 1)。
　 　 能量代谢蛋白所占比例最大,其中 1, 5-二磷
酸核酮糖羧化酶 /加氧酶是一个双功能酶,在叶绿
体基质中催化一对竞争性反应,即 CO2 的固定和
光呼吸碳的氧化。
抗病及防御蛋白中细胞色素 P450 是生物体内
的一类重要的多功能的血红素氧化还原酶类,在防
御生物免受外界不良环境影响方面起重要作用。
木聚糖酶抑制蛋白通过阻止病原微生物的木聚糖
酶水解作用而参与植物的防御反应。
核糖体蛋白主要参与蛋白质的合成。 它通过促
进核糖体 RNA折叠而使之处于最利于其执行翻译
功能的构象状态,从而提高蛋白质生物合成的效率
和准确度。 核糖体蛋白还参与细胞增殖、分化和凋
亡,在生物体的生长、发育中起着关键性的作用。
与信号转导相关的腺苷激酶是控制细胞中腺
苷浓度的一种关键酶,通过使腺苷磷酸化转换为
AMP 来降低组织中腺苷的水平。 Gigantea 是参与
植物光敏色素信号传导的一种核蛋白。 紫色酸性
磷酸酶能催化磷酸酯的水解而生成无机磷酸根,可
能在植物磷营养中起重要作用。
2. 2. 2　 BlastNr比对　 所得 61 条 EST 在 NCBI 核
酸数据库 Blastnr比对结果表明,47 条 EST 在数据
库中有较高的同源性,占 77. 0% ;14 条 EST 在数
据库中未找到同源序列(占 23. 0% )。 具有同源性
的序列中与已知功能蛋白同源性较高的 30 个(占
49． 2% ),其中能量代谢占 16. 7% 、转运 6. 7% 、蛋
白质合成加工 23. 3% 、抗病防御 13. 3% ,其他
40． 0% (表 2)。
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Table 1　 Result of BlastX sequence homology analysis to nr-protein database
Clone GenBank Acc No. E-value Identity Source Putative gene
Signal transduction
N181 EX567492 4e-19 91% Triticum aestivum Gigantea (TaGI1)
N110 EX567452 1e-38 92% Zea mays adenosine kinase
Metabolism
N300-2 EX567505 1e-21 75% Triticum aestivum purple acid phosphatase
Cell structure
N514-2 EX567457 7e-12 97% Oryza sativa SMC1 protein (structural maintenance of chromosomes)
Energy
N142-2 EX567460 2e-07 84% Arabidopsis thaliana photosystem II oxygen-evolving complex protein 3 - like
N354 EX567477 2e-06 92% Hordeum vulgare Photosystem I reaction center subunit IV,
N8-1 EX567479 2e-15 97% Melia azedarach ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit
N189 EX567480 7e-25 100% Triticum aestivum ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit
N390 EX567483 3e-05 100% Brachypodium distachyon chlorophyll a / b-binding protein
N11 EX567488 8e-20 100% Lasiocroton trelawniensis ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit
N484-2 EX567496 1e-15 97% Medicago truncatula photosystem I P700 apoprotein A2
Transporter
N507 EX567461 5e-44 77% Arabidopsis thaliana cationic amino acid transporter
N300-1 EX567508 3e-27 100% Hordeum vulgare vacuolar ATPase subunit B2
N192 EX567506 6e-15 100% Medicago truncatula Cell wall-associated hydrolase
Protein synthesis, destination and storage
N510-2 EX567463 8e-69 100% Acyrthosiphon pisum putative ribosomal protein Ubq / L40e
N508 EX567465 3e-16 78% Tribolium castaneum similar to 40S ribosomal protein S6
N522-2 EX567466 4e-21 89% Arabidopsis thaliana ATP binding
N26 EX567490 2e-19 95% Arabidopsis thaliana 40S ribosomal protein S15A
Disease and defense
N27 EX567495 2e-23 100% Triticum aestivum xylanase inhibitor protein I(xipI)
N500 EX567481 1e-26 87% Hordeum vulgare subtilisin-chymotrypsin inhibitor 2
N78 EX567468 3e-25 98% Pyrus communis putative senescence-associated protein
N439-1 EX567469 5e-17 95% Pisum sativum putative senescence-associated protein
N3 EX567491 6e-13 89% Trichosanthes dioica putative senescence-associated protein
N520 EX567462 3e-70 70% Brachypodium distachyon cytochrome P450
Table 2　 Result for homological alignment with function genes in nr-nuclear database
Clone GenBank Accn No. E-value Identity Source Putative gene
Energy
N142-2 EX567460 5e-69 87% Triticum aestivum Putative oxygen-evolving complex precursor
N8-1 EX567479 3e-53 99% Triticum aestivum Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit
N189 EX567480 1e-77 100% Triticum aestivum Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit
N11 EX567488 4e-62 100% Triticum aestivum Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase large subunit
N484-2 EX567496 3e-45 99% Triticum aestivum chloroplast
Transporter
N300-1 EX567508 1e-79 96% Arabidopsis thaliana probable H + -transporting ATPase
N192 EX567506 4e-46 99% Arabidopsis thaliana putative beta-fructofuranosidase
Protein synthesis, destination and storage
N510-2 EX567463 0 94% Acyrthosiphon pisum ribosomal protein L40 (Rpl40)
N38 EX567484 1e-08 95% Hordeum vulgare Putative translation elongation factor 1 beta
N439-1 EX567469 5e-51 96% Triticum aestivum 28S ribosomal RNA
N3 EX567491 6e-61 97% Triticum aestivum 28S ribosomal RNA
N505 EX567502 5e-99 99% Uncultured bacterium 16S ribosomal
N508 EX567465 2e-136 95% Acyrthosiphon pisum ribosomal protein S6 (Rps6)
N522-2 EX567466 2e-51 89% Brachypodium distachyon small nuclear ribonucleoprotein 200kDa(SNRNP200)
Disease / defence
N27 EX567495 1e-68 98% Triticum aestivum Xylanase inhibitor protein I (xipI)
N188 EX567507 6e-61 97% Triticum aestivum Metallothionein-like protein (wali1)
N59 EX567454 2e-24 96% Triticum aestivum Metallothionein-like protein (wali1)
N500 EX567481 2e-79 88% Hordeum vulgare subtilisin-chymotrypsin inhibitor
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 the number o EST with the identical function
2. 2. 3　 BlastX比对与 BlastNr比对结果的关系　 共
有 19个 EST在 2个不同数据库中具有一致的功能,
其中能量代谢的 5个、转运的 2 个、蛋白质合成与加
工的 3个、抗病及防御的 2个、其他 7个(图 1)。
3　 讨论
本研究所构建的抑制性消减杂交文库中参与
能量代谢的基因所占比例最高,其次是抗病防御基
因。 Luo等[2]在所构建的白粉菌混合文库中,出现
频率最高的是过氧化物酶,其次是类甜蛋白。 Wu
等[4]在以 N9436 为材料所构建的 SSH-cDNA文库
中,抗病与防御基因所占比例最高。 这表明小麦与
白粉菌互作中在体内积累许多抗病防御相关基因,
诱导其全面防卫反应,有效抑制病原生长、繁殖和
扩散。
能量代谢相关基因中二磷酸核酮糖大亚基大
量表达。 这与 Wu 等[4]所构建的文库中二磷酸核
酮糖羧化酶 /加氧酶大量表达结果一致。 Yu 等[5]
研究表明,二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶在小麦经
条锈菌诱导构建的文库中也大量表达。 这说明在
植物 -病菌互作中能量代谢占主导地位。 无论在
基因水平还是蛋白质水平,1,5-二磷酸核酮糖羧化
酶 /加氧酶大亚基在植物光合作用中 CO2 的同化
过程中以及细胞内各种蛋白质化学反应或氨基酸
修饰过程中都起着非常重要的作用,可能涉及到氧
胁迫反应。
本研究 13 条 EST没有找到与其同源的 EST,
推测这 13 条 EST 可能代表了新的基因或变异度
较高的 cDNA 的非编码区序列,但尚待进一步研
究确证。
4　 结论
采用抑制性消减杂交技术构建了白粉菌接种
初期小麦抗性种质 N9820 的 SSH-cDNA 文库,通
过对文库中部分 EST 进行测序,并与已知功能蛋
白进行同源性分析,得到 8 个与白粉病抗病相关
EST。
参考文献
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Chinese)[ J] . Acta Phytopathol. Sin. (植物病理学
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责任编辑:曾晓葳
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