全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(5): 551-555(2012)
收稿日期: 2011-12-17; 修回日期: 2012- 07- 23
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项经费资助(200903040)
通讯作者: 廖金铃,教授,博士生导师,主要从事植物线虫学研究; E-mail: jlliao@scau. edu. cn。
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췍研究简报
孢囊线虫中国新纪录种—
朝鲜孢囊线虫(Heterodera koreana)
王宏洪, 卓 侃, 张洪玲, 廖金铃*
(华南农业大学资源环境学院植物线虫研究室, 广州 510642)
Heterodera koreana, a new record species from China　 WANG Hong-hong, ZHUO Kan,
ZHANG Hong-ling, LIAO Jin-ling　 (Laboratory of Plant Nematology, College of Natural Resource and Environment,
South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
Abstract: A cyst nematode,Heterodera koreana,collected near roots of bamboo (Phyllostachys pubescens)
from Nanchang, Jiangxi Province, were described. The cysts were characterized by a globose to subspherical
body in adults with a prominent neck and terminal cone, thick cuticle, terminal vulva, and deep vagina.
Fenestra, bullae, and underbridge were absent. The anus was on the immediate posterior side of the cone. The
second-stages juveniles (J2) were characterized by two annuli in labial region, relatively short stylet (17. 5 -
20. 5 μm), three incisures in the lateral field, conoid tail with pore-like phasmids and a hyaline region extends
about 63% of tail length. rDNA-ITS sequence, 28S rRNA D2D3 sequence and ITS-PCR-RFLP profiles for
the species were also given. H. koreana is a new record species from China.
Key words: Heterodera koreana; Phyllostachys pubescens; new record species; China
文章编号: 0412-0914(2012)05-0551-05
　 　 孢囊线虫属(Heterodera)线虫目前大约有 80
种,该线虫分布广泛,是对农作物危害最严重的植
物病原线虫之一[1],对我国的农业生产和粮食安
全造成极大的威胁。 如,寄生大豆的大豆孢囊线虫
(H. glycines),寄生小麦的禾谷孢囊线虫(H. ave-
nae, H. filipjevi) [1,2]及湖南省水稻上新发现的日
本孢囊线虫(H. elachista) [3]。 为明确孢囊线虫在
中国南方地区的种类及分布,2007 ~ 2011 年结合
形态学和分子生物学技术开展了孢囊线虫调查鉴
定,在江西省发现朝鲜孢囊线虫(H. koreana)。 该
线虫为首次在中国发现。
1　 材料与方法
1. 1　 线虫种群
该孢囊线虫种群采自江西省南昌市毛竹
(Phyllostachys pubescens)根际土壤,种群编号为
JX1。
1. 2　 线虫的分离和形态观察
采用贝曼氏漏斗法分离土壤中的 2 龄幼虫,利
用直接过筛法获得孢囊,线虫的杀死、固定及 2 龄
幼虫永久玻片和孢囊阴门锥的制作及形态鉴定参
见 Subbotin等[1]的方法。 形态测量值的计算采用
De Man公式,测量与统计采用的英文及缩略词参
　
植物病理学报 42 卷
见 Subbotin等[1]的报道。
1. 3　 线虫 DNA提取
采用微量 DNA提取法提取线虫 DNA,操作步
骤详见 Subbotin等[1]的方法。
1. 4　 rDNA-ITS和 28S rDNA D2D3 区扩增
采用线虫通用引物 TW81 和 AB28 对 rDNA-
ITS区进行扩增,同时采用引物 D2A 和 D3B 对
28S rDNA D2D3 区进行扩增[2]。 PCR 反应体系
为:DNA模板 10 ~ 20 ng,Ex Taq (5 U / μL)0. 125
μL,10 × PCR 缓冲液 2. 5 μL,dNTP (2. 5 mmol /
L)2 μL,引物(10 μmol / L)各 1 μL,加无菌水至 25
μL。 扩增条件为:94℃ 3 min;94℃ 1 min,55℃
1． 5 min,72℃ 2 min,共 35 个循环;最后 72℃ 10
min。 扩增产物在 1%琼脂糖凝胶中电泳分离,每
100 mL 琼脂糖凝胶加入 5 μL EB 替代物 Gold-
View。 电泳缓冲液为 0. 5 × TBE,以 5 V / cm 电压
电泳约 30 min。 用凝胶图像分析系统拍照。
1. 5　 RFLP分析
用 Alu Ⅰ( NEB )、 EcoR Ⅰ( NEB )、 Msp Ⅰ
( Fermentas )、 Mva Ⅰ ( Fermentas )、 Nde Ⅰ
( Fermentas)和PstⅠ(大连宝生物)6种限制性内
切酶对rDNA-ITS区的 PCR 产物进行酶切,酶切程
序按说明书进行。 酶切产物在 2%琼脂糖凝胶中
电泳分离,每 100 mL琼脂糖凝胶加入 5 μL EB替
代物 GoldView。 电泳缓冲液为 0. 5 × TBE,以 5
V / cm电压电泳约 30 min。 用凝胶图像分析系统
照相。
1. 6　 序列分析
将 rDNA-ITS区和 28S rDNA D2D3 区的 PCR
产物切胶回收,连接到 pMD-18T载体,最后转化克
隆送交上海英骏生物技术有限公司,用 3730 全自
动测序仪测定序列。 序列结果在 NCBI( http: / /
www. ncbi. nlm. nih. gov)上进行核酸同源性检索。
序列相似性分析采用 DNA Star软件进行。
2　 结果
2. 1　 形态鉴定结果
通过形态学观察和测量,采自江西省南昌市毛
竹上的孢囊线虫群体 JX1 为朝鲜孢囊线虫 Hetero-
dera koreana (Vovals, Lamberti & Choo, 1992 )
Mundo-Ocampo, Troccoli, Subbotin, Del Cid,
Baldwin & Inserra, 2008。 对该种群描述如下:
形态测量值及与文献记述的比较见表 1。
Table 1　 Morphometric comparison of cysts and second-stage juveniles (J2) of Heterodera
koreana isolate JX1 from Jiangxi, China with original descriptions
Population characters Population from Jiangxi, China Population from South Korean peninsula[5]
J2 (n) 20 20
Body length / μm 512. 7 ± 29. 2 (447. 5 - 552. 5) 446. 0 ± 28. 0 (390. 0 - 509. 0)
Body width / μm 17. 2 ± 0. 5 (16. 0 - 18. 0) 16. 0 ± 1. 0 (14. 0 - 17. 0)
Stylet length / μm 19. 0 ± 0. 9 (17. 5 - 20. 5) 18. 0 ± 1. 5 (16. 0 - 20. 0)
Esophagus length / μm 158. 0 ± 13. 4 (142. 0 - 190. 0) 173. 0 ± 16. 7 (138. 0 - 201. 0)
Anterior end to median bulb valve / μm 72. 0 ± 6. 8 (60. 0 - 80. 0) 72. 0 ± 7. 2 (65. 0 - 98. 0)
Excretory pore from anterior end / μm 111. 0 ± 6. 7 (96. 5 - 118. 0) 95. 0 ± 4. 3 (88. 0 - 103. 0)
Tail length / μm 76. 8 ± 8. 9 (62. 0 - 88. 0) 66. 0 ± 4. 4 (59. 0 - 74. 0)
Tail hyaline region / μm 49. 1 ± 5. 2 (39. 0 - 56. 3) 40. 0 ± 2. 5 (35. 0 - 46. 0)
Phasmid from tail terminus / μm 70. 0 ± 8. 8 (57. 5 - 78. 0) 56. 0 ± 3. 9 (50. 0 - 62. 0)
a 29. 9 ± 1. 6 (26. 0 - 32. 2) 28. 0 ± 1. 7 (25. 0 - 32. 0)
b′ 3. 3 ± 0. 3 (2. 7 - 3. 8) 2. 5 ± 0. 2 (2. 3 - 3. 4)
c 6. 7 ± 0. 7 (6. 2 - 8. 1) 6. 7 ± 0. 3 (6. 1 - 7. 3)
c′ 6. 6 ± 0. 7 (5. 2 - 7. 3) -
Cysts (n) 5 20
Body length / μm 748 ±75 (700 -860) 840 ±149 (630 -1174)
Body width / μm 680 ±63 (620 -760) 520 ±90 (400 -653)
L / W ratio 1. 10 ±0. 05 (1. 03 -1. 15) 1. 5 ± 0. 4 (1. 0 - 2. 9)
Vulva slit length / μm 48. 8 ±5. 1 (41. 3 - 55. 0) 49. 0 ± 4. 3 (42. 0 - 56. 0)
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　 5 期 　 　 王宏洪,等:孢囊线虫中国新纪录种———朝鲜孢囊线虫(Heterodera koreana)
　 　 孢囊(图 1,G-J):球形或近球形,有明显的颈
部和末端锥。 颈部轴向或侧向生。 角质层厚,颜色
浅至暗棕色,体壁角质层有不规则“之”字形区域。
锥部区域厚,无膜孔和泡囊,下桥不可见。 阴门陷
入末端锥;肛门紧接阴门锥的后方;阴道深,在阴门
唇之间,五至六束肌肉连接阴道和阴门锥前后壁。
2 龄幼虫(图 1,A-F):虫体线形,两端渐变细。
唇区半圆形,几乎不缢缩,唇环数2个。口针基部
Fig. 1　 Light micrographs of second-stage juveniles (J2) and
cyst of Heterodera koreana isolate JX1
A: Entire J2 body; B: Anterior region; C: Lateral field; D: Hemizonid (black arrow) and excretory pore (white arrow);
E: Primordium; F: Tail (black arrows show anus; white arrow shows phasmid pore); G: Entire cyst; H: Cyst neck region;
I-J: Cone terminus structure at different planes. Scale bars: A =100 μm; B, D, F =20 μm;
C, E =10 μm; G =200 μm; H-J =50 μm.
355
　
植物病理学报 42 卷
球圆。 半月体清晰,位于排泄孔前 1 至 2 个体环
处,长 1 至 2 个体环。 食道腺发育良好。 生殖原基
卵圆形,长(12. 0 ~ 16. 0)μm,宽(8. 0 ~ 10. 0)μm,
至尾末端距离为(172. 5 ~ 244. 0) μm。 角质层环
纹清晰可见,宽(1. 7 ~ 2. 0) μm。 侧区具 3 条侧
线,占体宽的 22% ~ 25% 。 尾部环纹不规则,尾末
端窄圆,透明尾长占尾长的 57% ~ 71% 。 侧尾腺
孔小,位于肛门后 4 ~ 5 个体环处。
雄虫:未发现。
2. 2　 rDNA-ITS-RFLP图谱
对线虫 JX1 种群的 rDNA-ITS 扩增后,采用 6
种限制性内切酶对该产物进行酶切,获得的 rDNA-
ITS-RFLP(图 2,A)与 Mundo-Ocampo 等[4]报道的
朝鲜孢囊线虫的 RFLP 图谱(图 2,B)一致。
2. 3　 rDNA-ITS和 28S rDNA D2D3 区序列分析
对扩增获得的线虫 JX1 种群 rDNA-ITS 区和
28S rDNA D2D3 区序列进行测序,结果表明 rD-
NA-ITS 序列为 1 006 bp ( GenBank 登录号:
JN971093),28S rDNA D2D3 序列为 786 bp(Gen-
Bank 登 录 号: JN971092 )。 在 NCBI 上 进 行
BLAST 比对,结果表明线虫 JX1 种群 rDNA-ITS
区序列与朝鲜孢囊线虫 CA110 种群的 rDNA-ITS
区 序 列 ( GenBank 登 录 号: EU284042 和
EU284043)同源性最高,相似性高达 99． 7% 和
99． 3% ;而 28S rDNA D2D3 区序列与朝鲜孢囊线
虫 CA110 种群 28S rDNA D2D3 区的序列(Gen-
Bank登录号:EU284032)同源性最高,相似性为
99. 7% 。
3　 讨论
运用比较形态学和分子生物学相结合的方法,
在中国江西省南昌市毛竹 ( Phyllostachys pu-
bescens)根围发现了一种孢囊线虫属(Heterodera)
线虫———朝鲜孢囊线虫(H. koreana)。 该种孢囊
线虫最早由 Vovals 等于 1992 年在朝鲜半岛南部
的毛竹上发现,该孢囊线虫阴门锥无膜孔,将其归
入无膜孔孢囊线虫属(Afenestrata),命名为朝鲜无
膜孔孢囊线虫(A. koreana) [5]。 Inserra 等于 1997
年在美国佛罗里达州中部一苗圃的人面竹(P. au-
rea)根围的土样中也检测到该种线虫[1]。 Mundo-
Ocampo等于 2008 年结合形态学和分子系统发育
分析,确认无膜孔孢囊线虫属和孢囊线虫属为同属
异名,因此朝鲜无膜孔孢囊线虫被转移到孢囊线虫
属,即目前的朝鲜孢囊线虫[4]。 在泰国亦报道了
该线虫[1]。
本研究采集到的朝鲜孢囊线虫的形态学特征、
形态测量值及 rDNA-ITS-RFLP 图谱与以往报
道[4,5]一致,且 rDNA-ITS和 28S rDNA D2D3 序列
与已报道的朝鲜孢囊线虫的相关序列的相似性亦
高达 99%以上,故确定该线虫为朝鲜孢囊线虫。
该线虫是中国的新纪录种。 其对毛竹和人面竹的
寄生性研究已有报道,2 龄幼虫可穿刺寄主根表皮
导致中柱鞘细胞膨大并使细胞壁溶解形成合胞
Fig. 2　 rDNA-ITS-RFLP patterns of Heterodera koreana isolate JX1
from Jiangxi, China and comparison with literature description
A: H. koreana from Jiangxi, China; B: H. koreana from Florida, USA[4] ;
Lane M: DNA Marker (100 bp ladder); Lane U: Uncleaved rDNA-ITS-PCR product;
Lane 1 -6: Restriction fragments obtained with AluⅠ、 EcoRⅠ、 MspⅠ、 MvaⅠ、 NdeⅠ and PstⅠ.
455
　
　 5 期 　 　 王宏洪,等:孢囊线虫中国新纪录种———朝鲜孢囊线虫(Heterodera koreana)
体[1]。 朝鲜孢囊线虫对我国竹子是否造成危害有
待进一步调查研究。
参考文献
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nae), a parasite of bamboo in Korea [ J] . Journal of
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责任编辑:
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于金枝
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