全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 37-43(2011)
收稿日期: 2010-03-02; 修回日期: 2010-11-20
基金项目: 农业部公益性行业科研专项(nyhyzx07-050-6); 浙江省科技厅资助项目(2008C22062); 浙江省自然科学基金杰出青年团队
资助项目(R307396)
通讯作者: 郑经武,教授,主要从事植物线虫学及线虫病害研究; E-mail: jwzheng@zju. edu. cn
第一作者: 张 燕(1982 - ),女,山东烟台人,博士研究生,主要从事植物线虫学方面的研究。
肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)浙江杭州
群体形态学和分子特性及寄主范围
张 燕, MATAFEO Angelika, 石红利, 郑经武*
(浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所, 杭州 310029)
摘要: 肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)是一种重要的蔬菜线虫,寄主范围和分布很广。 本文根据形态学特征和形
态测量将来自浙江省杭州市蔬菜上的肾状线虫群体鉴定为肾形肾状线虫,为浙江省首次报道。 该群体的形态学特征及形
态测量值与模式标本基本吻合,个别形态测量值(比值)有变异。 通过对该肾形肾状线虫群体的 rDNA中 ITS区和编码 28S
RNA基因中的 D2D3 区的 PCR扩增和序列测定,明确二序列长度分别为 808 bp和 786 bp;序列分析发现该群体 ITS序列
与肾形肾状线虫种内一些两性生殖群体的亲缘关系较近,同源性高达 99. 5% ~ 100% ,而与一孤雌生殖群体同源性为
92. 4% ;编码 28S RNA基因中的 D2D3 区与已报道群体的同源性达到 99. 4% ,相似度较高;本研究还发现杭州肾形肾状线
虫群体的寄主涉及 11 个科 16 个属的果蔬。
关键词: 肾形肾状线虫; 形态学; rDNA特征; 寄主范围
Morphological and molecular characterization and host range of Rotylenchulus reni-
formis population occurring in Hangzhou, Zhejiang, China　 ZHANG Yan, MATAFEO
Angelika, SHI Hong-li, ZHENG Jing-wu　 ( Institute of Biotechnology, College of Agriculture & Biotechnology, Zhe-
jiang University, Hangzhou 310029, China)
Abstract: Rotylenchulus reniformis is one of the most important vegetable nematodes, and has widely host
range and distribution. Based on the morphological and molecular characters, a Rotylenchulus population from
Hangzhou, Zhejiang, China, in vegetable crops was identified as R. reniformis. Most morphometrics of Hang-
zhou population of R. reniformis were identical with type specimens and some variations were detected. PCR
Amplification and sequencing of ITS and D2D3 region of 28S RNA gene found that the two sequence lengths
were 808 bp and 786 bp, respectively. Sequence alignment of ITS region of Hangzhou population and other
inter-populations of R. reniformis, showed that Hangzhou population had 99. 5% to 100% similarity with the
three amphimitic populations, whereas 92. 4% with that of one parthenogenic populations. The D2D3 region
sequence of 28S RNA gene of Hangzhou population had the similarity of 99. 4% to that of a R. reniformis
populaiton in GenBank. The host range of Hangzhou population of R. reniformis included fruit and vegetable
crops in 16 genera of 11 families. This is the first report of the R. reniformis in Zhejiang Province.
Key words: Rotylenchulus reniformis; morphology; rDNA character; host range
中图分类号: S432. 45　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)01-0037-07
　 　 肾形线虫隶属垫刃目,纽带科,肾状线虫亚科, 肾状属(Rotylenchulus Linford and Oliveira, 1940),
　
植物病理学报 41 卷
为非迁移性根内半寄生线虫,主要发生在热带和亚
热带地区。 肾状属目前有 10 个种,肾形肾状线虫
(Rotylenchulus reniformis)是该属的模式种,也是
危害最重,分布和寄主范围最广的肾形线虫[1]。
在浙江省蔬菜线虫病害调查中,发现杭州一些
大棚蔬菜上有大量肾形线虫,经形态及分子鉴定为
肾形肾状线虫。 本文记述和报道来自浙江杭州肾
形肾状线虫的形态学、rDNA 以及寄主植物方面的
特征。
1　 材料与方法
1. 1　 供试线虫及其来源
从浙江省杭州市蔬菜所温室大棚果蔬根部采
集植物根系并取适量土壤,装入塑料袋封口,做好
标签。 果蔬有南瓜、辣椒、苋菜、草莓,还有一些
杂草。
1. 2　 土样中线虫的分离
线虫分离一般采用 Brown 等[2]改进的过筛
法:将约 500 g 土样置于 5 L 水桶中,捏碎土块并
用急水流冲成土壤悬浮液,静置约 30 s 后将上清
液通过 60 目的分离筛将悬浮液注入第二个水桶
中,再静置约 30 s,将土壤悬浮液再经过 300 目的
分样筛,收集筛上的残留物,然后结合浅盘法或漏
斗法进行分离。
1. 3　 线虫的形态学鉴定
在体视显微镜下挑取一定量的线虫,制成临时
玻片(以水作附载剂,通过热杀死线虫后加盖玻片
制成)和永久玻片(线虫通过 60 ~ 65℃温热杀死,
4%福尔马林溶液固定一周后,按 Seinhorst[3]改进
的方法脱水,最后转移至甘油中制成),在光学显
微镜下拍照并测量,按 de Man 公式计测主要形态
测量值及比值。 主要测量数据包括:L =体长;a =
体长 /最大体宽;b =体长 /食道腺与肠重叠处到头
端的距离;c =体长 /尾长;c’ =尾长 /肛门处体宽;
V =阴门距头端距离 × 100 /体长;stylet = 口针长
度;tail =尾长;h =尾后部的透明区长;DGO =背食
道腺开口至口针基部球的距离。
1. 4　 线虫的 rDNA 中有关区域的 PCR 扩增及
克隆
1. 4. 1　 DNA提取　 取一个洁净的载玻片,在表面
滴 20 μL ddH2O。 于体视显微镜下挑取 4 ~ 5 条肾
形肾状线虫放入载玻片的水滴中,用解剖针或手术
刀将线虫切为 2 ~ 3 段,用移液枪吸取 10 μL 含线
虫片段的悬浮液(尽量将切开的线虫体段全部吸
入),加入到内盛 10 μL ddH2O和 8 μL WLB溶液
(500 mmol / L KCl、100 mmol / L Tris-HCl pH 8. 0、
15 mmol / L MgCl2、 1. 0 mmol / L DTT、 4. 5%
Tween 20)的灭菌的 0. 5 mL eppendorf 管中,并加
入 2 μL蛋白酶 K溶液(600 μg / mL),于 - 70℃下
放置 10 min 以上,转入 PCR 仪,65℃下温育 1 h,
接着 95℃ 10 min。 最后于 12 000 rpm 下离心
2 min,取其上清即可用于 PCR 扩增或于 - 20℃下
保存备用。
1. 4. 2　 PCR 扩增　 PCR 扩增采用 25 μL 反应体
系。 包括 2. 5 μL 10 × PCR-buffer(不含 MgCl2)、
2. 5 μL MgCl2 ( 25 mmol / L )、 0. 5 μL DNTP
(10 mmol / L)、1. 5 μL 上游引物 (75 μmol / L)、
1. 5 μL 下游引物 (75 μmol / L)、2 μL 线虫粗提
DNA、1U Taq 聚合酶、14. 3 μL ddH2O。 本试验主
要扩增肾形肾状线虫 ITS 和 28S RNA 基因中的
D2D3 区,反应试剂均来自 TaKaRa公司。
ITS区 PCR 反应引物为 F194 (5′-CGT AAC
AAG GTA GCT GTA G-3′) [4]和本实验室设计引
物 Z1(5′-TCC TCC GCT TAC TGA TAT G-3′)。
扩增程序为:94℃预变性 4 min,然后进行 9 个循
环,每循环 94℃变性 30 s,54℃退火 1 min,72℃延
伸 1 min 20 s;接着进行第二个循环,每循环 94℃
变性 15 s,54℃退火 1 min,72℃延伸 1 min,共 28
个循环,最后 72℃延伸 10 min,于 4℃保存。
28S RNA基因中的 D2D3 区 PCR反应正向引
物 D2A(5′-ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT
TG -3′),反向引物 D3B(5′-TCG GAA GGA ACC
AGC TAC TA -3′) [5]。
扩增程序:94℃预变性 3 min,然后进行 36 个
循环,每循环 94℃变性 30 s,54℃退火 40 s,72℃延
伸 1 min,最后 72℃延伸 8 min。
1. 4. 3 　 PCR 产物纯化、克隆、测序 　 选用上海
Sangon公司的 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒
进行回收、纯化。 纯化的 PCR 产物克隆到 PUCm-
T载体并转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞,经蓝白
斑筛选获得 DNA克隆,送上海生工测序。 测序结
果运用 DNAStar和 Meg4 软件对所获得的 ITS 区
83
　
　 1 期 　 　 张 燕,等:肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)浙江杭州群体形态学和分子特性及寄主范围
序列以及 GenBank 上下载的相应序列进行比对,
并用 NJ法构建部分肾形肾状线虫种内群体的 ITS
系统进化树。
1. 5　 寄主范围的初步研究
从田间不同植物根围采集土壤样本,采用改进
的过筛法分离并鉴定有无肾形肾状线虫,同时对有
关的植物进行室内定量接种验证,每种植物催芽的
种子分别播种到装有灭菌土直径为 12 cm 花盆中,
同时接种 1 000 条线虫,20 d后取根染色观察侵染
及繁殖状况。
2　 结果
2. 1　 肾形肾状线虫(R. reniformis)杭州群体主
要形态测量值
未成熟雌虫 ( n = 20 ) ∶ L = 411. 3 ± 10. 7
(396. 4 ~ 428. 8) μm; stylet = 16. 8 ± 0. 4 (16. 3 ~
17. 2) μm; V = 71. 6 ± 1. 6 (68. 5 ~ 73. 6)% ;
DGO =16. 2 ±1. 7 (15. 4 ~ 20. 0) μm; a = 23. 7 ±
1. 9 (22. 5 ~ 27. 8); b = 3. 6 ± 0. 2 (3. 2 ~ 3. 8); c
=15. 0 ±2. 0 (13. 0 ~ 17. 0); c’ = 2. 7 ± 0. 5 (1. 9
~ 3. 6); 尾长 =27. 7 ±3. 6 (22. 8 ~ 33. 2) μm; 透
明尾长度 =5. 0 ±0. 8 (4. 0 ~ 6. 6) μm。
雄虫( n = 20) ∶ L = 432. 4 ± 24. 5 (404. 7 ~
459. 2) μm; stylet = 13. 0 ± 0. 9 (11. 9 ~ 14. 5)
μm; a =23. 9 ±3. 1 (19. 3 ~ 27. 3); b = 4. 3 ± 0. 2
(4. 0 ~4. 5); c =17. 8 ±1. 6 (16. 1 ~19. 5); c’ =2. 3 ±
0. 3 (2. 0 ~ 2. 8); 尾长 =24. 4 ±1. 6 (22. 5 ~ 26. 6)
μm; 交合刺长 =22. 6 ±2. 1(19. 3 ~ 24. 8) μm。
2. 2　 肾形肾状线虫杭州群体主要形态学特征(图1)
成熟雌虫:虫体腹弯,膨大呈肾形;颈区弯曲不
规则;阴门突起;受精囊圆形到不规则形,通常有精
子;肛门后除外,体呈半球形,具有细长 (6. 1 ~
8. 1) μm的尾突;卵产于胶质的卵囊内。
年轻雌虫:蠕虫性,热杀死后虫体呈“C”形;侧
区有 4 条侧线,无网格;唇区隆起、圆锥形,与体壁
连续,无缢缩;头架和口针强壮,口针长(16. 3 ~
17. 2) μm,背食道腺开口位于口针基部球后(15. 4
~ 20. 0) μm,食道腺长侧覆盖肠;双生殖腺、对伸、
转折;尾长圆锥形,长为(22. 8 ~ 33. 2) μm;有明显
的透明尾端,长为(4. 0 ~ 6. 6) μm。
雄虫:蠕虫性,口针和食道退化,口针长(11. 9
~ 14. 5) μm; 尾形似年轻雌虫,长圆锥形,尾长
(22. 5 ~ 26. 6) μm;交合伞不明显,不完全伸到尾
端,交合刺长(19. 3 ~ 24. 8) μm。
本文报道的肾形肾状线虫与肾形肾状线虫的
模式标本及不同地理群体的主要形态测量值基本
吻合,个别形态测量值(比值)有变异,见表 1。
Table 1　 Morphometrics comparasion of Rotylenchulus reniformis Hangzhou
population with type specimen and the other reported populations
Measurements
Type specimen
(Linford &
Oliveira, 1940) [6]
Hawaii,U. S.
Neotype specimen
(Dasgupta et al. ,
1968) [7]
Hawaii,U. S.
Topotype specimen
(Dasgupta et al. ,
1968) [7]Hawaii,
U. S. (n =26)
Pop. from Fujian
(Zhang &
Zhang, 2005) [8]
(n =20)
Pop. from
Hangzhou
(n =20)
L (μm) 376 (321 -432) 400 340 -420 430 (300 -660) 396. 4 - 428. 8
Stylet (μm) 18. 8 (16 -20) 16 16 -18 19 (18 -20) 16. 3 - 17. 2
V (% ) 72 72 68 -73 70 (63 -77) 68. 5 - 73. 6
Tail (μm) - 24 19 -26 - 22. 8 - 33. 2
h (μm) - 6 4 -8 5 -7 4. 0 - 6. 6
DGO (μm) - - - 13 (10 -15) 15. 4 - 20. 0
a 19. 3 24 22 -27 24 (21 -33) 22. 5 - 27. 8
b 3. 1 3. 8 3. 6 - 4. 3 3. 3 (2. 4 - 4. 3) 3. 2 - 3. 8
c 15 16 14 -17 15 (11 -18) 13. 0 - 17. 0
c’ - 2. 9 2. 6 - 3. 4 2. 5 (1. 8 - 3. 4) 1. 9 - 3. 6
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植物病理学报 41 卷
Fig. 1　 Photographs of Rotylenchulus reniformis population from Hangzhou, Zhejiang, China
A - C, G, H: Female; D - F: Male. A: Immature female; B: Anterior portion of immature female;
C: Tail of immature female; D: Male; E: Anterior portion of male; F: Tail of male; G, H: Mature female.
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　 1 期 　 　 张 燕,等:肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)浙江杭州群体形态学和分子特性及寄主范围
2. 3　 rDNA特征
对肾形肾状线虫杭州群体 rDNA 中的 ITS 区
和编码 28S RNA基因中的 D2D3 区 PCR 扩增、测
序获得肾形肾状线虫 ITS片段为 808 bp,编码 28S
RNA基因中的 D2D3 序列长度为 786 bp。 ITS 区
和编码 28S RNA基因中的 D2D3 序列分别登录在
GenBank中,登录号分别为 GU003939和 GU120091。
肾形肾状线虫杭州群体 ITS 区测序结果与
NCBI中所提交的肾形肾状线虫其他地方群体 ITS
序列 比 对, 得 到 匹 配 结 果 见 图 2。 其 中,
AY335191、AY335192 和 FJ374686 为两性生殖群
体 ITS序列,而 AY335190 为孤雌生殖的群体 ITS
序列。 杭州群体与 AY335191 和 AY335192 序列
相似性达到 100% ,与 FJ374686 序列相似性也高达
99. 5% ,然而,AY335190 序列内部存在基因变异
位点,与两性生殖群体相差较大,单独成一支。 这
说明,对于不同地理群体两性生殖的肾形肾状线虫
ITS区并不十分稳定,存在一定的碱基变异位点,
而孤雌生殖方式与两性生殖方式的 ITS差异较大。
本文所比对的序列中,两性生殖方式的 ITS相似性
很高,如针对肾形肾状线虫设计特异性引物,则需
对大量序列进行比对,筛选最佳区段进行设计。
NCBI中有关肾形肾状线虫编码 28S RNA 基因中
的 D2D3 区序列信息很少,仅有 DQ328713 一条
28S RNA 基因中的 D2D3 区序列,与该序列进行
相似性比较见图 3,相似度为 99. 4% 。 D2D3区相
Fig. 2 　 Phylogenetic tree constructed from
the elision alignment of ITS rDNA
sequence of five Rotylenchulus
reniformis populations (NJ method)
GU003939 is the sequence No. of R. reniformis of Hang-
zhou, China in NCBI.
Fig. 3　 Identity percent of part of 28S region
of the rDNA between Rotylenchulus
reniformis Hangzhou population and
the other sequence loaded in NCBI
GU120091 is the sequence No. of R. reniformis of Hang-
zhou, China in NCBI.
对保守,本试验获得的编码 28S RNA 基因中的
D2D3 区序列,对该线虫进一步的分子研究提供了
帮助,这也预示对该线虫不同地理群体 28S区的稳
定性需要进一步研究。
2. 4　 肾形肾状线虫杭州群体寄主范围
本实验室在浙江省的多次采样调查中,仅在杭
州的蔬菜上发现该线虫。 在杭州不同地区的多种
蔬菜植物根部取样分离,结合室内接种试验,初步
得到肾形肾状线虫杭州群体的寄主涉及 11 个科
16 个属的常见果蔬,结果见表 2。
3　 讨论
本研究从形态及分子两方面进一步确定该杭
州群体为肾形肾状线虫。 这是在浙江省的首次
报道。
　 　 肾形肾状线虫杭州群体形态测量值与模式标
本和其他地理群体相比,个别特征存在差异。 如与
模式标本相比,杭州群体尾长偏大;与国内福建甘
薯上发生的肾形线虫相比,体长范围相对集中,福
建甘薯上的肾形肾状线虫体长范围相对较大,且最
大和最小值相差较大,杭州群体口针长度偏小,
DGO偏大,其他测量值都与福建群体相近。 不同
地理群体线虫形态测量值有差异,与所处地理位置
的温湿度、寄主、土壤条件有很大关系。 同时,生物
进化也会存在群体个体变异。 因此,出现了不同地
理群体形态测量值的差异。
14
　
植物病理学报 41 卷
Table 2　 Host range of Rotylenchulus reniformis Hangzhou population
No. Host Family Genus
1 Pumpkin (Cucurbita moschata) Cucurbitaceae Cucurbita
2 Pepper (Capsicum annuum) Solanaceae Capsicum
3 Amaranth (Amaranthus mangostanus) Amaranthaceae Amaranthus
4 Bottle gourd (Lagenaria siceraria) Cucurbitaceae Lagenaria
5 Garden eggplant (Solanum melongena) Solanaceae Solanum
6 Strawberry (Fragaria ananassa) Rosaceae Fragaria
7 Cucumber (Cucumis sativus) Cucurbitaceae Cucumis
8 Tomato (Lycopersicon esculentum) Solanaceae Lycopersicon
9 Romana salat (Lactuca satica L. var. romana) Compositae Lactuca
10 Garden pea (Pisum sativum) Fabaceae Pisum
11 Cabbage (Brassica oleracea var. capitata) Cruciferae Brassica
12 Rape (Brassica campestris) Cruciferae Brassica
13 Carrot (Daucus carota) Apiaceae Daucus
14 Corn (Zea mays) Poaceae Zea
15 Sweet potato ( Ipomoea batatas) Convolvulaceae Ipomoea
16 Garden lettuce (Lactuca satica) Compositae Lactuca
17 Peanut (Arachis hypogaea) Fabaceae Arachis
　 　 肾形肾状线虫寄主范围广泛,据统计,可侵染
300 多种植物[1],包括农作物、蔬菜、果树、花卉、观
赏植物等经济作物。 通过在杭州的调查发现,感染
肾形肾状线虫的温室大棚,肾形肾状线虫基本都已
传播蔓延,所种植物多数被侵染,可能是人为农田
操作中携带病土或带虫植株蔓延所致。
　 　 肾形肾状线虫危害严重,美国每年由于肾形肾
状线虫危害棉田造成经济损失达 1. 3 亿美元,而用
于防治线虫的费用惊人[9]。 肾形肾状线虫病害主
要发生在热带和亚热带地区,寄主范围广。 中国跨
越热带、亚热带和温带,植被丰富,为植物寄生线虫
的生存和繁殖提供了良好的栖息环境,肾形肾状线
虫在我国的传播蔓延也显得更加容易。 近年来,上
海、广东、广西、海南、安徽、四川、福建、贵州、江西、
湖北 10 省、市、自治区先后发生肾形肾状线虫病害
且危害严重[10 ~ 14]。 因此,需做好该线虫的防范和
检疫工作,以防进一步蔓延传播,避免给农业生产
造成严重经济损失。
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责任编辑:于金枝
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