全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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+-../+#"""*$"!)+!"#$+"$+"&#
收稿日期$
!"#%*#!*"
&修改稿收到日期$
!"#$*"%*"$
基金项目$山东省良种工程项目"鲁农良种字
!"#"
(
##
号#&山东省良种工程项目"鲁农良种字
!"##
(
#)
号#
作者简介$燕丽萍"
#01"(
#!女!在读博士研究生!高级工程师!主要从事林木生物技术研究)
2*34-5
$
6
5
7
*
01!
!
#&%+893
"
通信作者$夏
!
阳!博士!研究员!主要从事林草遗传育种研究)
2*34-5
$
:-4
6
4/
;
")"&
!
#!&+893
耐盐绒毛白蜡特异性
$%&
分子标记的鉴定
燕丽萍#!!%!刘翠兰#!!李
!
丽#!!孙
!
超#!!毛秀红#!!
李双云#!!赵梁军%!夏
!
阳#!"
"
#
山东省林业科学研究院!济南
!)""#$
&
!
山东省林木遗传改良重点实验室!济南
!)""#$
&
%
中国农业大学观赏园艺与园林系!
北京
#""#0%
#
摘
!
要$该研究以耐盐型和盐敏感型绒毛白蜡及其
<
#
代为材料!采用混合品系分析法进行
=>?@
分析)结果显
示$在随机选取的
#)"
个
#"
碱基随机引物中!仅有引物
A!"
在耐盐基因池和盐敏感基因池间扩增出特异而可重复
的
)0!B
7
的多态性片段!命名为
A!"*)0!
)获得的
=>?@
标记
A!"*)0!
经克隆+测序+重新设计一对特异性引物转
化成更稳定的
AC>=
标记)通过
<
#
代个体验证!耐盐型个体均能扩增出此差异条带而盐敏感型个体中不能扩增
出此差异条带!证明该
AC>=
标记的特异引物可用于耐盐绒毛白蜡物种的快速分子鉴定)
关键词$绒毛白蜡&耐盐&
=>?@
标记&
AC>=
标记
中图分类号$
D10
文献标志码$
>
(!)*+#,#-.+#"*",$./+0"/)1.*+1($2-/345)*3#-/$$%&2"/)-3/.12.14)1
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7
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6
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R9ST3T/V
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7
4RV3T/V9UMR/43T/V45P9RV-8J5VJRT4/QG4/Q.84
7
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R-8J5VJR45I*
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7
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7
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7
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7
5-U
6
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7
995.UR93VKTRT.-.V4/V
7
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7
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!
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7
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6
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7
.
7
T8-U-8UR4
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3T/V
!
4/Q/43TQA!"*)0!+
AC>=34R]TR\4.QTST59
7
TQUR93VKT=>?@34R]TRA!"*)0!B
6
859/-/
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!
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JT/8-/
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4/QQT.-
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9/T
7
4-R
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7
R-3TR.4/QVKTAC>=34R]TR9/5
67
RT.T/VTQ-/VKT-/Q-S-QJ45.9UVKTRT.-.V4/V
7
54/V.+YKTUR4
;
3T/VT:*
-.VTQ-/VKTRT.-.V4/V
7
54/V.4/Q<
#
7
9
7
J54V-9/
!
-V\4.-/Q-84VTQVK4VVKTAC>=
7
R-3TR84/BTJ.TQU9RR4
7
-Q
-QT/V-U-84V-9/9U.45VV95TR4/8T!-)*+,%&#.
7
T8-T.+
7)
8
9"1!6
$
!"#$%&()*+,%&#
&
.45VV95TR4/V
&
=>?@34R]TR.
&
AC>=34R]TR.
!!
盐分是限制植物生长和产量的主要环境因素之
一!土壤盐渍化是一个世界性问题)植物耐盐新品种
选育!一直是国内外研究重点)绒毛白蜡"
!"#$%&(
)*+,%&#Y9RR+
#为木犀科"
M5T48T4T
#白蜡属"
!"#$%&(
G-//+
#落叶乔木!原产美国!生长快+树干通直+纹理
美观+抗盐碱!是唯一盐碱地造林大乔木树种#*%()但
大多数绒毛白蜡不能在含盐量超过
"+%_
以上的盐
碱地上正常生长和繁殖!山东省林业科学研究院选
育的-鲁蜡
%
号,品种!具有非常强的耐盐能力!能够
在含盐量
"+)_
"
"+&_
条件下正常生长发育)该
品种对沿海城市绿化和美化+位于盐碱地油田地区
的绿化+盐碱地土壤改良具有重要作用)
传统的白蜡属植物分类主要依靠果实形状和果
翅数目的不同!但该分类方法无法有效地在幼树早
期进行应用$()从形态学鉴定耐盐和盐敏感白蜡非
常困难!尤其是从耐盐和盐敏感白蜡杂交后代筛选
出耐盐个体!通常要进行生理测定和耐盐试验!耗
时+费力且许多表型特征不稳定!并可能破坏植株&
另外形态特征测量和生理指标测定结果时常出现误
差)近年来!发展较快的分子标记与表型鉴定相比!
具有不受环境条件和植物生长发育阶段影响+鉴定
准确+多态性高+标记位点多且分布在整个基因组等
优点!已成为植物遗传资源研究和辅助育种的重要
手段!广泛应用于性状标记+基因作图和种质鉴定等
方面)*#$()目前!在白蜡中已开发了核
@F>
微卫
星+叶绿体微卫星+
2AY*AAY
等分子标记!主要应用
于种群遗传分析#)*#(!尚无对绒毛白蜡植物耐盐性
状进行分子标记快速鉴定的相关报道)本研究利用
=>?@
技术从中寻找具有特异性的条带!对这些条
带进行克隆和序列分析!进一步设计特异引物!进行
特异性
?C=
扩增!最终筛选出耐盐物种特异的
@F>
分子标记!并将其转化成稳定+可靠的
AC>=
标记!为白蜡耐盐种质的快速鉴定和白蜡耐盐育种
提供准确的分子标记)
#
!
材料和方法
:+:
!
试验材料
耐盐绒毛白蜡品种-鲁蜡
%
号,+-鲁蜡
$
号,和
)
株盐敏感绒毛白蜡由山东省林业科学研究院东营
分院刘德玺提供)-鲁蜡
%
号,与-鲁蜡
$
号,杂交
<
#
代种子由本课题组提供)
:+;
!
研究方法
:<;<:
!
基因组
=>&
提取
!
采用
CY>[
法提取基
因组
@F>
#1
(
!并略做改进!提取缓冲液中加入
!_
#
*
巯基乙醇和
!_ ?` ?
)紫外分光光度法测定
@F>
的浓度和纯度!稀释至
%"/
;
%
$
G
)
:+;+;
!
基因池构建
!
根据混合品系分析法"
[J5]TQ
G-/T.>/45
6
.-.
#的原理!将
!
株耐盐绒毛白蜡品种
-鲁蜡
%
号,+-鲁蜡
$
号,和
)
株盐敏感绒毛白蜡分
为
!
组!分别取等量
@F>
混成耐盐基因池和盐敏
感基因池)
:<;!
&@=
分析
!
=>?@
引物为
A
系列
A#
"
A#)"
"上海生物工程公司#)优化的
=>?@
扩增条
件为$
?C=
反应体系为
#"a
反应缓冲液
!+)
$
G
!
)
3395
%
GL
;
C5
!
#+1
$
G
!
#"3395
%
GQFY?.#+)
$
G
!
%"/
;
%
$
G
引物
?!
$
G
!模板
@F>
"
!"/
;
#
!
$
G
!
!I
%
$
G.#
/
@F>
聚合酶
"+!)
$
G
!
QQP
!
M
#$+0)
$
G
总体积
!)
$
G
)
?C=
反应程序为
0)b
预
变性
)3-/
!
0$b
变性
%".
!
%&b
退火
#3-/
!
!b
延伸
!3-/
!循环
$$
次!
!b
延伸
#"3-/
)取
1
$
G
扩增产物用
#+"_
的琼脂糖凝胶电泳!
ZT/TZT/-J.
全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相)
:<;
&@=
片段的回收+克隆和测序
!
?C=
扩
增出的特异标记
@F>
片断经
#+"_
琼脂糖凝胶电
泳后!用博大泰克生产的玻璃奶试剂盒回收+纯化!
将其连接到
7
L@#1*Y T`8V9R
"
Y4X4=4
#!用热激法
转化到大肠杆菌
@P)c
感受态细胞"本实验室制备
保存#!进行重组质粒筛选)用碱法提取质粒
@F>
!
通过
?C=
检测鉴定后委托上海生工公司测序)
:<;
&@=C$%&
标记的转换
!
根据
=>?@
标
记序列测序结果!通过
?R-3TR
软件设计特异引物序
列)引物合成由上海生物工程公司完成)
AC>=*
?C=
反应体系为$总体积为
!)
$
G
!
!a.#
/
?C=
L4.VTRL-:
"天根生化科技有限公司#
#!+)
$
G
!
#"
$
395
%
G
#
#
$
G
!
=A!"*)0!
"
#"
$
395
%
G
#
$
G
!模板
@F>
"
!"/
;
#
!
$
G
!
QQP
!
M1+)
$
G
)
?C=
反应条件为$
0$b
预变性
$3-/
!
0$b
变性
%"
.
!
))b
退火
$).
!
!b#+)3-/
!循环
%"
次!
!b
延伸
#"3-/
)扩增产物用
#_
的琼脂糖凝胶电泳
检测)
:<;
$%&
标记在
E
:
代种子苗中的验证
!
挑选
饱满无病虫害-鲁蜡
%
号,与-鲁蜡
$
号,杂交
<
#
代
种子
$""
粒!消毒获得无菌种子苗)挑选生长一致
的
%
叶
#
心种子苗连同根一起转接
LAd)
;
%
G
琼
脂
d%"
;
%
G
蔗糖
d!""3395
%
GF4C5
养基中"
7
P
值
)+1
#!每瓶培养基中
&
株种子苗!共
%"
瓶!培养
$"Q
!调查记载单株的耐盐性和盐敏感性!进行
AC>=
标记验证)
!
!
结果与分析
;<:
!
绒毛白蜡耐盐相关的
&@=
标记
用
#)"
个随机引物!分别对耐盐和盐敏感基因
池进行
=>?@
扩增!发现只有
A!"
"序列为
ZZ>C*
CCYY>C
#引物的扩增产物在耐盐基因池和盐敏感
!&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
基因池中表现多态性!经
%
次重复扩增!在两基因池
间表现稳定+一致的差异)
A!"
在耐盐基因池扩增
出约
)0!B
7
特异条带"图
#
#!而在盐敏感基因池缺
失这条带)基于试验结果!初步认为
A!"
扩增的片
段可能是耐盐绒毛白蜡特有的)
;<;
!
&@=
标记的克隆和测序
将
?C=
扩增出的特异片段
A!"*)0!
纯化+克隆
后!挑选
!
个克隆进行测序)结果表明!
!
个克隆
@F>
序列完全一致)来自引物
A!"
的标记片段长
度为
)0!B
7
!在该序列的两端均能找到相应的随机
引物或其对应的互补结合序列"序列两端的下划线
部分#!进一步证实了克隆片段的正确性"图
!
#)
;!
&@=
标记
$;FCBG;
的
$%&
标记转换及验证
将
=>?@
标记
A!"*)0!
进行
AC>=
转化时!根据
测序结果!在原有的
A!"
随机引物的基础上延伸了
1
"
##
个碱基!合成
AC>=
标记特异引物"图
!
箭头划
线#
)e*ZZ>CCCYY>CC>>>YZ>C>>Y*
%e
#和
=A!"*)0!
"
)e*ZZ>CCCYY>CCZYZC>>C*%e
#)
用该引物在耐盐-鲁蜡
%
号,+-鲁蜡
$
号,和盐敏感绒
毛白蜡的
)
个单株中分别进行扩增)结果"图
%
#
表明!在耐盐绒毛白蜡中扩增出
)0!B
7
特异条带!而
图
#
!
引物
A!"
在耐盐%盐敏感基因池的扩增结果
L+@G!"""
&
A+
盐敏感基因池&
Y+
耐盐基因池
<-
;
+#
!
?C=
7
R9QJ8V.-/V95TR4/V
%
.J.8T
7
V-B5TBJ5]TQ@F>
L+@G!"""
&
A+AJ.8T
7
V-B5TBJ5]TQ@F>
&
Y+Y95TR4/VBJ5]TQ@F>
在盐敏感绒毛白蜡单株中未扩增出特异条带!
A!"*
)0!
标记片段仍表现出原有的多态性!表明可用于
分子辅助育种的鉴定与选择!本研究并获得国家发
明专利#0()
;
$%&
标记的验证
<
#
代种子苗在耐盐培养基上生长
$"Q
!挑选
#"
株 叶片全绿+生长良好的耐盐株系!取
#"
株发育迟
图
!
!
=>?@
标记片段
A!"*)0!
序列
划线部分为
A!"
引物结合位点&箭头方向为
=A!"*)0!
反向引物
<-
;
+!
!
YKT.T
^
JT/8T9U=>?@34R]TRA!"*)0!
A!"
7
R-3TR.B-/Q-/
;
.-VT.4RT5-/TQ
&
>RR9\.RT
7
RT.T/V
U9R\4RQ
7
R-3TR
"
4/QRTSTR.T
7
R-3TR
"
=A!"*)0!
#
图
%
!
AC>=
在单株中的
?C=
扩增结果
L+@G!"""
&
G%+
鲁蜡
%
号&
G$+
鲁蜡
$
号&
#
"
)+
盐敏感绒毛白蜡
<-
;
+%
!
YKT?C=
7
R9QJ8V.43
7
5-U-TQ
\-VKAC>=
7
R-3TR-/
7
4RT/V.
L+@G!"""
&
G%+GJ54%
&
G$+GJ54$
&
#
"
)+AJ.8T
7
V-B5T
7
54/V.
图
$
!
标记片段
A!"*)0!
在部分样品上的
AC>=*?C=
扩增结果
L+@G!"""
&
#
"
#"+
耐盐样品&
##
"
!"+
盐敏感样品
<-
;
+$
!
=T.J5V.9UAC>=*?C=U9R34R]TRUR4
;
3T/VA!"*)0!-/.93T.43
7
5T.
L+@G!"""
&
#
"
#"+Y95TR4/V.43
7
5T.
&
##
"
!"+AJ.8T
7
V-B5T.43
7
5T.
%&
$
期
!!!!!!!!!!!!!
燕丽萍!等$耐盐绒毛白蜡特异性
AC>=
分子标记的鉴定
缓+叶片发黄的盐敏感植株)分别以提取的
@F>
为模板进行
AC>=
分析)从图
$
中可见!对耐盐株
系分别以
AC>=
特异性引物进行扩增!结果分别扩
增出了特异性谱带&而在盐敏感株系的扩增产物中
都没有扩增出任何产物)进一步证实了
AC>=
标
记检测的可靠性!该标记可用于耐盐绒毛白蜡分子
标记的辅助选择育种)
%
!
讨
!
论
=>?@
作为一种分子标记!其扩增条带稳定性
较差一直是影响其广泛使用的制约因素)张建珍
等!"(鉴定了稻蝗属"
0$
1
#>JQ-T/V*ATRS-5T
#特异的
=>?@
条带!基于该条带序列设计的特异引物可用
于稻蝗属物种的快速分子鉴定!克服了
=>?@
重复
性差的问题)
L-]K4-59S4
等!#(在用
=>?@
对
!
个
形态上极为相似的姊妹种进行分析时!发现种特异
性的分子标记!经序列测定和特异引物设计!得到一
个
AC>=
分子标记可用于这两个形态上相似物种
的快速准确鉴定)
EJ
等!!(将白菜抗霜霉病
=>?@
标记
X#$*#"%"
转化为简单易行的
AC>=
标记)
AC>=
标记是
?4R4/
等!%(提出的!首次在
=>?@
标
记基础上进行转化并应用)虽然
=>?@
标记和
AC>=
标记均可以有效地检测出育种材料中的目的
@F>
!但是
=>?@
标记对反应条件的灵敏性使得其
结果远没有
AC>=
标记的结果快速+准确+可靠)
AC>=
标记非常稳定!在应用上具有快速+简便+成
本低的特点!解决了
=>?@
标记的不稳定和
>
标记之一)
本实验采用
=>?@
标记
*
混合品系分析法来检
测绒毛白蜡耐盐株系和盐敏感株系的多态性!发现
随机引物
A!"
可在绒毛白蜡耐盐株系扩增出一条稳
定的条带)经对耐盐绒毛白蜡株系的
A!"
扩增片段
克隆测序!进一步基于序列设计特异引物!进行特异
?C=
检验!结果表明$耐盐绒毛白蜡扩增出稳定的
目的条带!而盐敏感绒毛白蜡无任何扩增条带)说
明笔者鉴定的
AC>=
分子标记是耐盐绒毛白蜡物
种特异的!可用于绒毛白蜡物种的快速鉴定!即可有
效鉴定材料的耐盐性!为绒毛白蜡分子标记辅助选
择育种体系奠定了基础)因此!本研究通过
AC>=
标记可对个体进行苗期鉴定!大大提高了育种效率!
缩短了育种进程)
参考文献!
#
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"吴永波#!
NI2WP
"薛建辉#
+H3
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"南京林业大学学报#!
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张恩慧
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赵继新
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