全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(1): 88-92(2012)
收稿日期: 2011-05-11; 修回日期: 2011-10-15
基金项目: 国家烟草专卖局科技项目、 郑州烟草研究院科技项目(122009CZ0410)
通讯作者: 杨 军,副研究员,主要从事植物病毒方向研究; Tel:0371-67672319, E-mail:yangjuntr@sohu. com。
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췍研究简报
马铃薯 Y病毒贵州黔西烟草分离物 P1 基因序列分析
张俊祺1, 代昌明2, 杨 军1*, 宋纪真1, 罗朝鹏1, 王 燃1, 林福呈1
( 1中国烟草总公司郑州烟草研究院, 郑州 450001; 2贵州省烟草公司毕节地区公司, 毕节 551700)
Sequence analysis of P1 gene of PVY tobacco isolate from Qianxi,Guizhou　 ZHANG
Jun-qi1, DAI Chang-ming2, YANG Jun1, SONG Ji-zhen1, LUO Zhao-peng1, WANG Ran1, LIN Fu-cheng1
( 1Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC, Zhengzhou 450001, China; 2Bijie subsidiary of Guizhou Tobacco Company,
Bijie 551700, China)
Abstract: Potato virus Y (PVY) is the type member of the genus Potyvirus and infects several important so-
lanaceous crops, including tobacco. PVY is one of the most widespread and economically destructive viruses.
The P1 region of PVY had been used to determine the diversity, evolution and the homology based on the
geographic location of the virus. The P1 region of PVY tobacco isolate from Qianxi in Guizhou Province was
cloned and sequenced. Database searches and multiple sequence alignment showed subtle variation within the
same strain, while apparent variation between O strain and the other three strains, N, NTN and N∶O. Moreo-
ver, variation in P1 region of Qianxi isolate derived from the gene mutation rather than the recombination
among genomes. Phylogenic analysis revealed that the clustering only discriminated O strain from others. Con-
sequently, sequence analysis in P1 region is unable to afford strain determination.
Key words: PVY; sequence analysis; P1 gene; strain determination
文章编号: 0412-0914(2012)01-0088-05
　 　 马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y, PVY)是马铃
薯 Y病毒科(Potyviridae)马铃薯 Y 病毒属(Poty-
virus)的典型成员,其寄主广泛,主要侵染包括烟
草在内的多种茄科植物,是重要的世界性植物病毒
病害。 根据 PVY在烟草及其他寄主上显现的系统
症状,以马铃薯为初始宿主的 PVY 分离物一般被
划分为普通株系(Common strains, PVYO),烟草叶
脉坏 死 株 系 ( Tobacco veinal necrosis strains,
PVYN),点条斑株系(Potato stipple streak strains,
PVYC)。 此外,PVY 还包含由突变和重组形成的
新株系:马铃薯块茎坏死型(Potato tuber ringspot
necrosis strains, PVYNTN),N株系与 O株系的重组
体 PVYN-W(北美称为 PVYN∶O)等。 研究证实,基
因重组是 PVY株系形成的重要原因。 PVYN-W 株
系大多数在 Hc-Pro与 P3 交界处有 1 个重组点,该
株系某些病毒在 P1 编码区内还有一额外重组点;
PVYNTN株系的 3 或 4 个重组点位于 Hc-Pro 与 P3
交界处、NIa和 CP 编码区[1]。 这些株系的发生均
源于 N 和 O 株系初始基因组在不同区段的重组。
P1 编码区是 PVY基因组上 5′端第 1 个基因,其编
码的 P1 蛋白酶参与多聚蛋白的切割。 P1 基因编
码区的变异程度高于外壳蛋白和其他非结构基因
序列。 研究发现一些 PVY 株系 P1 区域存在两种
重组模式,对 P1 基因的变异和聚类分析将有可能
对 PVY株系的分类起辅助作用。
本研究通过对烟草马铃薯 Y 病毒黔西分离物
　
　 1 期 　 　 张俊祺,等:马铃薯 Y病毒贵州黔西烟草分离物 P1 基因序列分析
P1 基因区域克隆、序列测定及多重 PVY 分离物序
列比对分析,旨在发现 P1 区域的变异规律及其与
株系划分之间的关系,进一步探讨通过 P1 基因区
域序列分析来确定 PVY所属株系的可能性。
1　 材料与方法
1. 1　 样品采集
带病烟叶采自贵州省烟叶主产区黔西,病征呈
叶脉有褐色坏死斑、叶色黄化、典型花叶及坏死等
不同类型症状的代表烟叶。 经病毒诊断试剂盒
(PathoScreenRTMV、PVY、CMV、TEV)确定烟叶样
品感染病毒种类,分类保存于 -80℃冰箱待用。
1. 2　 仪器与试剂
大肠杆菌菌株 (DH5α) 由本实验室提供,
RNeasy Plant Mini 试剂盒购自 QIAGEN 公司,
TaKaRa RNA LA PCRTM (AMV)试剂盒、DL2000
DNA分子量标准、rTaq、pMDTM 18-T Simple 载体、
胶回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司,
病毒诊断试剂盒(PathoScreenRTMV、PVY、CMV、
TEV)购自 Agdia 公司。 其余试剂均为国产分析
纯。
1. 3　 基因克隆
本试验使用 RNeasy Plant Mini 试剂盒提取感
病烟草总 RNA,具体步骤参照相应产品说明书。
选择基因组中相对保守区域设计引物。 上游引物
PF: 5′-AAATTAAAACAACTCAATACAAC-3′,对
应基因组第 1 ~ 23 bp;下游引物 PR: 5′-GCCCT-
TCGCTGGATCAATTTCC-3′,对应基因组第 1 709
~ 1 730 bp。 以发病烟叶总 RNA 为模板,使用
TaKaRa RNA LA PCR试剂盒进行 RT-PCR。
1. 4　 数据分析
同源性比对使用 BLAST 程序( http: / / blast.
ncbi. nlm. nih. gov / Blast. cgi)和 BioEdit软件;序列
排列使用 DNAMAN 软件, 进化树分析使用
MEGA5 软件。
2　 结果与分析
2. 1　 PVY黔西分离物序列结构分析
利用 BLAST 程序对 GenBank 数据库中相似
核苷酸序列进行检索,选择与贵州黔西分离物相似
度 97%以上的序列进行分析。 通过比对各序列 P1
蛋白在 PVY 基因组编码的多聚蛋白中的切割位
点,确定贵州黔西分离物序列包含的 P1 基因全长
825 nt(该序列 GenBank Accession JF911803),编
码的 P1 蛋白由 275 个氨基酸构成。 核苷酸序列和
推导的氨基酸序列见图 1。
2. 2　 同源性分析
由于 PVY种内株系较多,P1 基因区域的序列
比较将为 PVY 黔西分离物株系划分提供有益帮
助。 本试验从 GenBank 中选择了 20 个分离物的
基因组全长进行比对。 结果显示,黔西分离物的核
酸序列与各序列的相似度在 72. 2% ~ 92. 7%之
间,最高为中国分离物 HM590405,属于 N 株系。
氨基酸同源率在 71. 2% ~ 92. 3% 之间,最高为
HM590405、EF016294 和 EF026076。 黔西分离物
与 N株系、NTN、N∶O株系的序列相似度均高于与
O株系的相似度,故只能明确黔西分离物不属于 O
株系,尚不能确定其属于何种株系。 使用 BioEdit
统计发现,同一 PVY株系内的 P1 基因序列相对较
保守,不同株系间则有较大变异,特别是 O 株系和
其他株系之间。
2. 3　 序列重组可能性分析
PVY N株系群组中新株系的出现大部分源于
N与 O株系之间的重组。 据报道,部分 N∶O 株系
的分离物在 P1 编码区内存在 1 或 2 个重组点,且
P1 3′端与 O株系同源性较高[2]。 故进一步选择多
条 N、O株系序列与黔西分离物 P1 区域进行比对,
图 1 列举 N、O株系各 1 条与黔西分离物的序列分
析。 结果显示,黔西分离物与 N 株系的核苷酸序
列基本一致,且不存在阅读框架的改变,差异位点
分散分布;与 O株系的核酸序列同源性较低,差异
位点分散分布,在 P1 编码区 3′端没有较高同源
性。 故黔西分离物 P1 基因区域并非 N 和 O 株系
的重组体。
2. 4　 进化树分析
对 PVY P1 基因区域进行了进化树分析,核苷
酸和氨基酸进化树分析得到的树形结构相似(图
2)。 黔西分离物属于由部分 N 或 NTN 和全部
N∶O株系构成的支系。 O株系中 U09509 和 OZ形
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植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 Multiple sequence alignment of P1 region and amino acid sequences of Qianxi isolate
Alignment was initiated at startcodon and terminated at 3′ end of P1. HM590405 and EF026074 are belonged to strains
N and O respectively. Amino acid sequence is presented in the last line.
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　 1 期 　 　 张俊祺,等:马铃薯 Y病毒贵州黔西烟草分离物 P1 基因序列分析
Fig. 2　 Amino acid phylogenic relationships of P1 among 21 isolates
mentioned above including Qianxi isolate
The tree was constructed usingneighboring-joining method, with 1000 iterations and Poisson model.
Qianxi isolate was highlighted with solid square, strains names were presented at right side.
成的支系,与其他支系距离较远。 尽管 NTN、N∶O
株系由 N和 O株系重组产生,但各重组株系的 P1
区域与 N株系距离较近,故而大部分区域重组来
源于 N株系。 同一株系内 P1 并未完全构成同一
进化支系,显示 P1 区域的株系内聚类并不紧密,
这从侧面反映了 P1 区域的进化树分析尚不能作
为株系划分的依据。
3　 讨论
本试验对 PVY贵州黔西烟草分离物 P1 基因
区域进行了序列分析,发现 P1 序列只在 O 株系与
其他 3 个株系间变异较大。 基因变异的来源包括
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植物病理学报 42 卷
基因重组和突变。 Hu 等[3]发现在 P1 的编码区
内,有两处发生重组的实例。 重组后的 P1 基因均
由 5′端的 O 株系序列和 3′端的 N 株系序列构成。
本试验的重组可能性分析表明,该分离物变异源于
碱基位点突变,并非基因重组。
传统 PVY株系划分依据病毒的发病症状,P1
基因编码的丝氨酸蛋白酶参与多聚蛋白的切割,与
病毒症状的形成无直接联系。 本试验对 P1 基因
的进化树分析发现各株系不能形成紧密的枝簇,只
能区分 O 株系和起源于 N 株系的 PVY 分离物。
Nie等[2]曾尝试用多对引物扩增 PVY 的 P1 区域
以确定病毒株系,但只能在所选择的部分 PVY 分
离物中适用,原因是 P1 区域保守性较低,无法确
定引物的设计原则能否适用于其他分离物。 故仅
通过分析 P1 区域不能确定 PVY株系。
鉴于 PVY P1 基因区域内存在 2 种重组模式,
基因突变频率相对较高,对 P1 区域的分析仍然具
有意义。 如对重组位点的二级结构和 AU 碱基比
例进行分析,发现这两种因素对重组的发生有一定
影响, 或许是一种普遍重组位点的特征[4]。
Lorenzen等[5]运用多重 PCR 对 PVY 进行株系鉴
定也是基于各个重组位点两侧的序列差异,而 P1
区域重组位点的存在使得其对株系划分仍具有重
要的参考价值。
参考文献
[1] 　 Lorenzen J, Nolte P, Martin D, et al. NE-11 repre-
sents a new strain variant class of Potato virus Y[ J] .
Archives of Virology, 2008, 153(3): 517 -525.
[2] 　 Nie X, Singh R P. Specific differentiation of recombi-
nant PVYN∶ O and PVYNTN isolates by multiplex RT-
PCR[J] . Journal of Virological Methods, 2003, 113
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[3] 　 Hu X, Karasev A V, Brown C J, et al. Sequence
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Journal of General Virology, 2009, 90(12): 3033 -
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simultaneous differentiation of Potato virus Y strains in-
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plex PCR assay[ J] . Journal of Virological Methods,
2010, 165(1): 15 -20.
[5] 　 Lorenzen J H, Piche L M, Gudmestad N C, et al. A
multiplex PCR assay to characterize Potato virus Y iso-
lates and identify strain mixtures[ J] . Plant Disease,
2006, 90(7): 935 -940.
责任编辑:曾晓葳
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