全 文 ：第 22卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002 年　7月
Vol.22　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2002
毒源烟草试管保存技术的研究
郭志平
(黑龙江省克山师专生物系 , 克山　161601)
摘　要　经三年连续试验 ,用试管保存含马铃薯 X病毒(PVX)、马铃薯 Y病毒(PVY)、烟草花叶病
毒(TMV)的毒源烟草 ,结果证明毒源烟草可在试管中正常生长发育 。负染法和免疫电镜捕获法检
测结果证明 ,试管毒源烟草不同生育期 ,体内的病毒含量不同;试管毒源烟草在管外土壤中栽培可
正常生长发育 ,并表现出相应的症状 ,接种指示植物试验证明其侵染力与温室内保存的毒源效果
相同 。
关键词　试管保存;毒源烟草;PVX 、PVY 、TMV病毒
RESEARCH OF TUBE STORAGE TECHNIQUE AND ITS EFFECTS
OF TABACCO CONTAINED VIRUSES
GUO Zhi-ping
(Biology Department , Keshan Teachers College , Keshan 161601)
Abstract　Through three-yesr s experiment of storing tabacco contained PVX.PVY.TMV viruses , a conclu-
sion is arrived at that the tabacco can grow normally iy tube.It is suggested by counter-dry-transfer process
and immunological electron microscope capture that the viruses content vary at the tabacco s various grouth
stage in tube , and that tabacco can grow normally outside the tube , showing relevant symptoms.The experiment
of inoculation indicates that its infectivity is equal to that of viruses stored inside.
Key words　tube storage;tabacco contained viruses;PVX.PVY.TMV viruses
　　马铃薯病毒毒源是马铃薯抗病毒育种和病毒检
测中抗血清制备及马铃薯病毒学研究中必备的材
料。我国在马铃薯病毒研究中 ,经多年努力 ,收集 、
分离并保存了一批马铃薯病毒毒源 ,同时从国外引
进了一些重要毒源 ,这些毒源是极珍贵的材料[ 1] 。
如何保存利用好这些毒源是一项重要课题。传统的
毒源保存方法是在温室内将病毒接种到指示植物上
定期转接进行保存 ,工作量大且效果不够理想 。由
于多种病毒毒源植物在裸露的条件下保存在同一温
室内 ,易造成混杂;同时需一定的温室面积 ,适宜的
温 、湿条件 ,尤其寒区冬季的取暖 ,耗费人力 、财力
大;另外毒源植物在棚室内 ,易感染杂菌死亡 ,导致
病毒丢失;此法保存的毒源亦不便携带利用。因此
迫切需要选择一种更佳的保存方法 。我们在传统保
存马铃薯病毒毒源的基础上 ,进行了试管保存毒源
烟草的研究 。1998 ～ 2001年 ,经过三年的连续试验 ,
获得初步成果 。
1　材料与方法
1.1　材料
毒源植物:普通烟草(Nicotiana tabacum),马铃
薯X病毒(PVX),马铃薯 Y 病毒(PVY)和烟草花叶
作者简介:郭志平(1965—),男 ,副教授。主要从事马铃薯栽培和马铃薯病毒方面的研究。
收稿日期:2001-05-21
病毒(TMV)。毒源种类及来源见表 1。
1.2　毒源烟草茎尖的切取及试管培养
在无菌的条件下切取毒源烟草茎尖 0.6 ～ 1cm ,
茎尖不可小于 0.5cm ,以免脱去保存的病毒 。将茎
尖放入底口扎紧纱布的三角瓶或试管内(底部打
破),用自来水连续冲洗 4 小时 ,然后放入盛有 0.
1%升汞液(或75%乙醇)的培养皿中消毒 2分钟 ,取
出后用无菌水冲洗 2 ～ 3分钟 ,然后在超净工作台上
(或无菌箱内)将已消毒的茎尖扦插入盛有MS 培养
基的试管中 ,塞紧绵塞 ,标号后上架培养 。
当毒源植物茎尖长至 10 ～ 12cm时 ,无菌条件下
单节切段(带大叶),更新试管进一步培养。无论茎
尖培养还是更新试管培养均用 MS 培养基+激素 ,
在温度20℃～ 25℃,光照 2000lx 下培养。
表 1　毒源烟草保存的毒源种类 、来源
Table 1　Type and Origin of tabacco viruses
毒源种类Variety 毒源来源 Origin
PVX 克山 、加拿大
PVY0 克山 、加拿大 、瑞士
PVYc 瑞士
TMV0 克山
1.3　病毒检测及接种
利用免疫电镜捕获法及负染电镜法检测毒源烟
草病毒含量 、纯度 , 样品制备及检测均按常规
法[ 2 ～ 4] ;利用常规摩擦法 ,接种指示植物测定毒源烟
草体内病毒的致病力 。
2　结果与分析
2.1　试管毒源烟草的生长发育
经三年的连续试验 ,先后切取毒源烟草大茎尖
进行扦插 346管 ,单节切段(带大叶)更新培养 986
管。试验结果证明 ,无论是茎尖试管扦插培养还是
单节(带大叶)更新培养 ,毒源烟草均能在试管内正
常生长发育。茎尖扦插成活率为 86.8%,其生长发
育情况见表 2。同时试验还证明单节切段更新试管
培养较茎尖初进试管培养茎 、叶生长发育快 ,生根速
度快 ,8 ～ 10d即生根 ,成活率高 ,可达 98%以上。
2.2　毒源烟草体内病毒含量及变化
2.2.1　试管毒源烟草体内病毒含量
在对试管毒源连续进行分离 、筛选的基础上 ,利
用负染电镜法和免疫电镜捕获法对毒源烟草中三种
病毒的含量 、纯度进行了鉴定 ,观察的结果是同源抗
血清捕获的病毒粒子多 ,而异源抗血清和正常抗血
清及未加血清只负染色也具吸附力 ,也可根据观察
到的病毒粒子形态 、大小 、多少 ,确定病毒含量及纯
度。对毒源烟草12份样品的鉴定结果证明 ,不同病
毒及同一病毒不同试管 ,病毒纯度及含量不同(见表
3), 其中 PVX—7 、PVY0 —1 、PVY0 —4 、 PVY0 —5 、
TMV
0 —2 、TMV0 —9 、TMV0 —11病毒含量高且纯 , 而
PVX—2 、PVX—4 、 PVX—9 、TMV0 —14 毒源不纯 ,
PVY
0 —6无病毒。
表 2　毒源烟草茎尖试管培养生长发育情况
Table 2　Culture of tabacco stemtip in tube
时间
Time
株高(cm)
Height
叶片数(片)
Leaves
根长(cm)
Length
of root
根数(条)
Num-
ber of
roots
成 活率(%)
Surviv-
al
per-
centage
进管 20d 2.24 2.2 — 4.8 —
进管 35d 9.13 4.3 0.18 11.3 86.8
　　注:“ —“表示未进行测量 、统计
Note:“ -” Indicates that the measurement and statistics are not carried
out.
　　不同试管毒源烟草的病毒含量 、纯度不同的主
要原因是毒源烟草大茎尖进管时病毒含量不同(进
管前未检测);另外试管毒源烟草在切段更新试管培
养过程中器皿等消毒不净也可导致病毒混杂不纯;
无毒的原因是毒源烟草进管时本身不带病毒 。通过
此次鉴定筛选出 PVX 、PVY0 、TMV0 共 7管纯毒源 ,
即 PVX—7 、PVY0 —1 、PVY0 —4 、 PVY0 —5 、TMV 0 —2 、
TMV
0 —9 、TMV0 —11 ,为进一步研究利用奠定了基
础。
2.2.2　试管毒源烟草培养过程体内病毒含量的变
化
通过对试管毒源烟草管内连续培养 ,利用免疫
电镜法鉴定其体内 PVX 、PVY0 、TMV0 三种病毒含量
变化的结果证明:试管毒源烟草生长42天时病毒含
量较高 ,至 115天时病毒含量降至极低水平 ,已很难
检测到。试管毒源烟草不同生育期体内病毒含量不
同 ,这与烟草生长发育过程中体内的生理变化有关;
本试验按照常规检测方法仅对毒源烟草生育 42天 、
115天时体内病毒的含量进行了初步的检测 、分析 ,
对于整个生育期病毒量的连续变化情况 ,有待今后
进一步研究。
2.3　试管毒源烟草管外土壤栽培的生长发育及侵
染力
2.3.1　试管毒源烟草管外土壤栽培生长发育情况
334 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　22 卷
表 3　毒源烟草不同试管中病毒含量(电镜鉴定结果)
Table 3　Virus content of virus origin tabacum in different tubes(Identified by electronic microscope)
试管毒源
Virus origin
不同血清免疫电镜捕获法鉴定结果 Identified by electronic microscope catching serum
正常血清 PVX PVY0 TMV
负染色法鉴定结度
Negachroia microsope
纯度Purity
PVX-2 PVX±,TMV+++ PVX±, TMV+++ PVY±,TMV+++ TMV+++ PVX±, TMV++ ×
PVX-4 - PVX+ - TMV+- - ×
PVX —9 PVX+,TMV± PVX++ PVX± TMV+ PVX+, TMV± ×
PVX-7 PVX+ PVX++ PVX+ PVX±, TMV- PVX+ √
PVY0-1 PVY++ PVY++,PVX- PVY+++ PVY+, TMV- PVT++ √
PVY0-4 PVY+ PVY+,PVX- PVY++ PVY+, TMV- PVY+ √
PVY0-5 PVY++ PVY++,PVX- PVY+++ PVY++, TMV- PVY++ √
PVY0-6 PVY- PVY-,PVX- PVY- PVY-, TMV- PVY- -
TMV0-2 TMV++ TMV+, PVX- TMV+,PVY- TMV+++ TMV++ √
TMV0-9 TMV+++ TMV++, PVX- TMV++,PVY- TMV+++ TMV+++ √
TMV0 -11 TMV++ TMV+, PVX- TMV+,PVY- TMV+++ TMV+++ √
TMV0 -14 TMV++, PVX± TMV++, PVX+ TMV++,PVY± TMV+++ TMV++ ×
　　病毒含量:+++很多;++多 , +较多 , ±病毒粒子 5个以下 , -无毒 ,纯度:√纯 , ×不纯 , -无毒
Virus content:+++Most virulent , ++Much more , +More , ±Below 5 , -Nonvirulent;Purity:√Pure , × Impure , -Nonvirulent
　　当试管毒源烟草发育成小植株后 ,从试管中取
出 ,洗去培养基 ,移植到温室内的花盆中 ,在温度 15
～ 20℃,光照 2000lx的条件下进行培养 ,观察记录其
生长发育情况。试验结果证明试管毒源烟草小植株
在管外土壤中可正常生长发育 ,并表现出被相关病
毒侵染的典型症状(见表 4)。说明试管毒源烟草可
以移植管外土壤中栽培。同时试验还表现出致病力
强的 TMV0 对毒源烟草小植株生长发育影响较大 ,
烟草生长缓慢 ,表现重花叶症状;而同等条件下致病
力弱的 PVYC 对毒源烟草的生长发育影响较小 ,烟
草小植株生长相对较快 ,表现轻花叶症状。
表 4　试管毒源烟草管外土壤栽培生长发育情况
Table 4　Culture of tabacco containing viruses in soil outside tube
毒源
Virus origin
管外栽培日数
Days grown
outside tube
株高(cm)
Height
叶片长(cm)
Length of leaf
叶宽(cm)
Width of
leaf
叶数(片)
Number of leaf
(piece)
症状
Symptom
PVY0-1 14 2.1 5.8 2.0 4 轻花叶Light mott le-leaf
30 2.9 8.5 2.6 5 轻花叶Light mott le-leaf
PVY0-4 , 5＊ 75 9.0 14 5.6 10 明脉Clear skeleton
95 9.5 15.5 6.5 11 明脉Clear skeleton
TMV 0-2 ,9＊＊ 75 4.5 8.0 3.5 10 浓绿隐花叶Dark green cryptoleaf
95 4.7 8.5 4.5 11 浓绿隐花叶
Dark green cryptoleaf
　　注:＊表中数值为 4 、5号管的平均值;＊＊表中数值为 2 、9号管的平均值.
Notes:＊Indicates an average data in Tube 4 , 5;＊＊Indicates an average data in Tube 2 , 9
2.3.2　试管毒源烟草茎 、叶汁液接种指示植物的侵
染表现
取花盆内栽植的试管毒源烟草茎叶汁液接种到
指示植物上 ,观察记录指示植物的症状。试验结果
证明毒源烟草内的病毒对指示植物具有侵染力 ,指
示植物表现出相应的症状[ 5 , 6] 。如:将具 TMV 的毒
源烟草汁液接种到无毒的普通烟草上 ,在室温 20 ～
25℃的条件下 ,10天后产生浓绿疱斑的典型花叶症
状 ;将具 PVX的毒源烟草汁液接种到千日红叶片
上 ,室温 20 ～ 25℃的条件下 , 5 ～ 7天后千日红被接
3353期　　　　　　　　　　　　郭志平:毒源烟草试管保存技术的研究
种的叶片上出现红色边缘的局部坏死斑 。试管毒源
烟草保存的毒源接种指示植物表现的病症 ,与温室
内毒源植物保存的毒源接种指示植物表现的病症相
同 ,说明试管毒源烟草的毒源与管外毒源植物保存
的毒源有相同的侵染力。
3　结论
多年来在利用马铃薯 、烟草 、洋酸浆 、番茄 、千日
红等指示植物在温室内土壤栽培保存马铃薯病毒的
基础上 ,我们开展了试管保存马铃薯病毒的研究 。
经1998 ～ 2001三年连续试验证明 ,试管毒源植物茎
尖及单节带大叶的切段均可在试管中生长发育;免
疫电镜捕获法和负染电镜法检测结果证明 ,试管毒
源烟草不同生育期体内病毒含量不同;管外土壤栽
培试验证明 ,试管毒源烟草管外栽培可生长发育 ,并
表现出相应的病毒症状;接种指示植物侵染试验证
明 ,试管毒源植物与管外栽培的毒源植物具相同的
侵染力。
试管保存毒源烟草技术克服了传统温室保存易
混杂 、利用不便的不足 ,同时大大降低了费用 ,进一
步研究其它毒源植物的试管保存 、利用 ,对深入开展
马铃薯病毒研究及直接利用有重要意义 。
参　考　文　献
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336 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　22 卷