全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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$
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.
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
%#!&!#&$
#&教育部新世纪优秀人才支持计划"
2345+##+"*&"
#&江苏省杰出青年基金"
67!"#%""!&
#&江苏
高校优势学科建设项目
作者简介$吴雪君"
#((")
#!女!在读硕士研究生!主要从事蔬菜分子生物学研究
4+89/:
$
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!
1
.
9;-<=;->1
"
通信作者$熊爱生!博士!教授!博士生导师!主要从事蔬菜遗传育种与分子生物学研究
4+89/:
$
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A
9/0B<
A!
1
.
9;-<=;->1
鸭儿芹羟基肉桂酸转移酶基因的
克隆及其对不同温度的响应
吴雪君!谭国飞!徐志胜!王
!
枫!熊爱生"
"南京农业大学 园艺学院!作物遗传与种质创新国家重点实验室!农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室!南京
!#""($
#
摘
!
要$以贵州省野生鸭儿芹为研究对象!用
C5+D3C
克隆获得与木质素合成有关的羟基肉桂酸转移酶基因
"
!
"
#!$
#!并分析
!
"
#!$
基因对不同温度的响应!探索人工栽培鸭儿芹的适宜温度结果表明$"
#
#
!
"
#!$
基因
开放阅读框长度为
#!("E
F
!编码
,!(
个氨基酸&蛋白质分子质量为
,&-$GH
!等电点为
*-*&
&进化树分析表明!
3
.
I35
与茄科植物的
I35
亲缘关系最近"
!
#荧光定量
D3C
分析显示!
!
"
#!$
基因在贵州鸭儿芹根(叶柄(叶
及花不同组织中的表达具有组织特异性!且在根中
!
"
#!$
基因的表达量最高!而在叶中表达量最低!花与叶中该
基因表达量相近"
%
#对鸭儿芹生长过程中主要面临的
,
种不同温度"
#"J
(
#J
(
%"J
和
%J
#分别处理
"
(
"-
$
(
#
(
!
(
,
(

(
#!
(
!,B
!荧光定量
D3C
检测显示!
"
#!$
基因的表达量"以
"B
处理作为对照!表达量为
#
#在高温"
%"
J
和
%J
#处理下于
"-$B
时最高!其中
%"J
处理的
!
"
#!$
基因表达量高于
%J
处理&在低温"
#"J
和
#J
#
下鸭儿芹
!
"
#!$
基因表达量于
#!B
时最高!其中
#"J
处理
"-$B
时
!
"
#!$
基因较对照表现为下调&高温"
%"J
和
%J
#下
!
"
#!$
基因表达量峰值比低温"
#"J
和
#J
#下表达量峰值高!而且峰值出现的时间也较早该实
验意义在于初步研究发现低温栽培鸭儿芹能抑制
!
"
#!$
基因的表达!为人工栽培鸭儿芹温度调控提供了参考
关键词$鸭儿芹&
!
"
#!$
基因&克隆&木质素&荧光定量
D3C
&温度处理
中图分类号$
K&$
&
K&(
文献标志码$
L
$%"&(#"))!*+
,
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4
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7
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7
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7
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,
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23
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3
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A
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A
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291
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A
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A
1/1
&
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V<8
F
V;Y<0VY<00
!!
木质素是陆生植物中重要的聚合物!仅次于纤
维素木质素主要有
%
种单体类型$对
+
羟基苯基木
质素"
D+B
W
=Y@]
WF
B<1
W
::/
A
1/1
!
I+
木质素#(愈创木
基木质素"
A
;9/9>
W
::/
A
1/1
!
O+
木质素#和紫丁香基木
质素"
0
W
Y/1
AW
::/
A
1/1
!
U+
木质素#)#*木质素属于酚
类高分子化合物!存在于木质部中!不仅有利于植物
运输水分!而且能增加细胞壁厚度!增强植物机械支
持力)!+%*羟基肉桂酰转移酶"
B
W
=Y@]
W
>/1198@
W
:+
3@L
#作为细胞色素
D,$"
家族的成员之一!同时具
有莽草酸羟基肉桂酰转移酶"
0B/G/89VW
=Y@]
W
+
>/1198@
W
:+VY910P#和奎宁酸羟基肉桂酰转移酶
"
;/19VW
=Y@]
W
>/1198@
W
:+VY910P#活性!该
酶在木质素的生物合成进程中研究较晚),+$*莽草
酸%奎宁酸羟基肉桂酰转移酶"
0B/G/89V<
%
;/19V<
B
W
=Y@]
W
>/1198@
W
:+VY910P!
I35
#是催化对
+
香
豆酰辅酶
L
生成咖啡酰辅酶
L
的关键酶!在苯丙烷
3%
羟基化的上(下游起着重要的双重调节作用)*+&*
莽草酸%奎宁酸羟基肉桂酰转移酶也是
I+
木质素和
O
%
U+
木质素合成时进行相互转化的调控物质在
高等植物中!
D,$"
家族成员在一些物质的生物合成
中发挥重要的作用!例如苯丙烷类(生物碱(萜类(生
氰糖苷类(激素等)&+*编码
I35
的基因与很多其
他
D,$"
基因家族成员一样!表达受外界环境诱导!
如$辐射(机械损伤(高温低温和化学诱导剂等)(+#"*
鸭儿芹"
!%
&
()(*+,-*
"
*

),-.* I900G
#!为伞
形科"
L
F
/9><9<
#鸭儿芹属"
!%
&
)()(*+,-*
#的药食两
用植物!嫩苗叶及叶柄可供蔬食!是一种较为重要的
蔬菜)##*!已成为日本十大蔬菜之一主产河北(安
徽(江苏(浙江(贵州(福建(江西(广东(广西(湖北(
湖南等地!喜生于林下阴湿处全草及果可入药!有
祛风止咳(活血化瘀(消炎止痒之功效!治感冒咳嗽(
肺炎(肺囊肿(淋病(疝气(风火牙痛等目前!生产
上栽培种多为引自日本的白茎"柄#鸭儿芹)#!*野
生鸭儿芹在进行夏季栽培时!往往会受到高温的影
响!导致食用器官木质化!严重影响鸭儿芹的品质!
低温虽然能延迟木质素的产生!但影响鸭儿芹
产量)#%*
本研究以贵州鸭儿芹为研究对象!克隆与木质
素合成相关的
!
"
#!$
基因!并对其组织特异性及
生长过程中主要面临的
,
种不同温度进行不同时间
段处理!通过实时荧光定量
D3C
检测该基因的表达
情况!为中国鸭儿芹人工栽培温度调控提供参考
#
!
材料和方法
@-@
!
植物材料及处理
实验材料为本实验室保存的贵州省野生鸭儿芹
"(!#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
种子!种子催芽后!种植于南京农业大学作物遗传与
种质创新国家重点实验室人工气候室取
!
月龄鸭
儿芹植株!剪取其生长健康的第
,
片叶片用于叶片
总
C2L
提取!反转录成
>H2L
!用于克隆
!
"
#!$
基因并对
!
月龄植株分别进行
#"J
(
#J
(
%"J
和
%J
处理
"
(
"-$
(
#
(
!
(
,
(

(
#!
和
!,B
!提取第
,
片成熟真叶叶片组织和叶柄组织的
C2L
!反转成
>H2L
!用于实时定量
D3C

@-A
!
方
!
法
@BAB@
!
鸭儿芹
1
4
516
基因克隆
!
利用
C2L0/8+
F
:<5@V9:C2L7/V
"北京
5/91
A
<1
公司#试剂盒!按
照其说明书的步骤提取鸭儿芹总
C2L
$利用
DY/8<
U>Y/
F
VC5Y<9
A
<1V7/V
"大连
5979C9
公司#试剂盒!
按照说明书将提取的总
C2L
反转录成
>H2L

以毛白杨
#!$
基因"登录号
?Z
+
""*%*,%"-
#
#
)
#,
*和拟南芥
#!$
基因"登录号
2Z
+
#!,!&"-%
#
)
#$
*
为参考序列!将两条参考序列进行比对根据比对结
果!用
DY<8/软件在两条参考基因序列较一致
区域!开放阅读框"
@
F
<1Y<9=/1
A
PY98<
!
TCR
#外设计
上游引物
3
.
I35R
"
$`+L5L35553533L335L35+
553L33+%`
#和 下 游 引 物
3
.
I35C
"
$`+O5O3O5+
O53553LLL5O53L5L3+%`
#
D3C
克隆反应条
件为
(,J
预变性
,8/1
!然后
(,J
变性
%"0
!
$,J
退火
*"0
!
&!J
延伸
#-$8/1
进行
%$
个循环!最后
&!J
延伸
#"8/1
用
#-!a
的琼脂糖凝胶电泳分
离
D3C
产物回收后的
D3C
产物连接到
F
ZH#(+
5
载体上!并转化到大肠杆菌
HI$
"
随后进行质
粒的酶切与鉴定!委托南京金斯瑞生物科技有限公
司进行
H2L
测序
@-A-A
!
序列分析
!
将克隆得到的
!
"
#!$
基因!利
用
6/@?Z!-*
软件对其可阅读框长度进行预测!并
翻译成对应的氨基酸序列利用
236S
网站的
O<1691G
数据库中的
6XLU5
程序!进行
!
"
#!$
基因和氨基酸序列的同源性分析&采用
H2LZL2
软件对
!
"
#!$
基因和氨基酸序列进行多重比对(
蛋白相对分子质量(等电点和酸碱氨基酸统计等分
析&用
Z4OL$
软件绘制进化树并进行编辑成
图)#**&用
4]DLU
W
的
UMSUU+ZTH4X MTC7+
UDL34
"
BVV
F
$%%
0^/00+8@=<:-<]
F
90
W
-@Y
A
#程序预
测
3
.
I35
蛋白三维结构
@BABC
!
实时定量
DEF
反应和基因表达分析
!
实时
定量
D3C
采用
Ub6CDY<8/]01$*
2
试剂盒"
5979+
C9
公司#!按照操作说明进行相对定量使用参照基
因的
#
!
5
法!表达差异等于
!
)
#
!
5
!
#
!
5
c!
5
目标基因)
!
5*.(-,
相对定量是基于处理和对照之间目标基因对
参考基因表达量的比较采用
/K
5Z
$0@PV^9Y<
和
/K
5Z
$C<9:+V/8W
0V<8
完成荧光定量
D3C
根
据克隆到的
!
"
#!$
基因序列!设计荧光定量检测引
物!上游引物
3
.
I356HR
"
$`+3O53OOLL535O5O+
OLL3O35LL+%`
#和下游引物
3
.
I356HC
"
$`+335+
333LO33L5LOOL5LOLL3O+%`
#用鸭儿芹
*.(-,
基
因作为内参基因!其引物为
9>V/1R
"
$`+35O3LLLOL+
O3LO3535535O5OOL+%`
#和
9>V/1C
"
$`+5O5L+
LO55O5353O5OOL55335O3+%`
#
)
#%
*
!目标基因
与
*.(-,
基因一起扩增基因表达情况及分析采用
Z/>Y@0@PV4]><:!""&
和
S6ZUDLUU!"-"
进行)#%*
!
!
结果与分析
AB@
!
鸭儿芹
1
4
516
基因的克隆
以鸭儿芹
>H2L
为模板进行克隆!得到一条约
#,""E
F
的扩增产物"图
#
#!将克隆得到的第
#
$
%
泳道目的基因条带的产物进行测序测序结果显
示!
%
个泳道获得的
!
"
#!$
基因序列结果一样!长
度均为
#,#"E
F
通过预测!其开放阅读框为
#!("
E
F
!可编码
,!(
个氨基酸"图
!
#进一步分析显示!
其中酸性氨基酸为
&!
个!碱性氨基酸为
$,
个!蛋白
分子质量为
,&-$GH
!等电点为
*-*&
通过对其蛋
白质亲水%蛋白质疏水性预测可知!该蛋白质亲水性
区域多于疏水性区域!该蛋白质可能属于亲水性蛋
白质
ABA
!
鸭儿芹与其他植物
E
G
6E;
氨基酸序列比较
将获得的
!
"
#!$
翻译成对应的氨基酸序列!与
胡萝卜"
3*4.45.*%)(*
!
O<1691G
登录号
7C$$(!%*
#(
拟 南 芥 "
6%*7-8)

5-5(9*:-*,*
!
O<1691G
登 录 号
L6I",$($-#
#和番茄"
;):*,4<:
&
.)

+%5-.4<
!
O<1+
691G
登录号
?D
+
"",!%$(#-#
#
I35
氨基酸序列进
图
#
!
鸭儿芹
!
"
#!$
基因的克隆
Z-HX!"""
&
#
$
%-D3C
扩增产物
R/
A
-#
!
D3C98
F
:/P/>9V/@1@P!
"
#!$
A
<1<
PY@8!/
"
*

),-.*I900G
Z-HX!"""
&
#)%-DY@=;>V0@PD3C
#(!#
&
期
!!!!!!!!!!
吴雪君!等$鸭儿芹羟基肉桂酸转移酶基因的克隆及其对不同温度的响应
行比较四者
#!$
基因开放阅读框长度不同!编码
氨基酸长度也不相同"图
%
#其中伞形科鸭儿芹和胡
萝卜
#!$
基因均编码
,!(
个氨基酸!拟南芥
#!$
基
因编码
,%%
个氨基酸!番茄
#!$
基因编码
,%$
个氨
基酸四者氨基酸序列一致性高达
(-&&a
!其中鸭
儿芹
I35
氨基酸与胡萝卜的一致性为
(*-"*a
!而鸭
儿芹
I35
氨基酸与番茄一致性为
&(-$&a
!与拟南芥
图
!
!
鸭儿芹
!
"
#!$
基因序列及编码氨基酸序列
"
表示终止密码子
R/
A
-!
!
2;>:<@V/=<9>/=91==<=;><=98/1@9>/=0<
;<1><0@P
!
"
#!$PY@8!/
"
*

),-.*I900G
"
Y<
F
Y<0<1V0VB<0V@
F
>@=@1
一致性为
&$-,(a
说明同属于伞形科的胡萝卜与
鸭儿芹
I35
氨基酸进化关系较近鸭儿芹
3
.
I35
蛋白三级结构预测与分析利用
UMSUU+ZTH4X
!以中
粒咖啡
I35
"
DH6SH
$
,
A
!8-#
#为模型对推导的氨基
酸序列同源建模!预测了该蛋白的三级结构结果
"图
,
#显示!鸭儿芹
3
.
I35
蛋白结构序列与中粒咖啡
I35
有
$-%#a
的一致性
ABC
!
E
G
6E;
的进化分析
为了进一步研究
3
.
I35
进化的关系!将鸭儿芹
3
.
I35
氨基酸序列与其它
!$
种植物的
I35
氨基
酸序列构建进化树"图
$
#结果表明$同为伞形科的
胡萝卜与鸭儿芹进化关系较近!不同科植物中的
3
.
I35
氨基酸进化较保守!如豆科的大豆(蝶豆(红
车轴草(鹰嘴豆和银合欢在同一分支上!茄科的番茄(
图
,
!
利用
UMSUU+ZTH4X
对鸭儿芹
3
.
I35
蛋白质三级结构预测
R/
A
-,
!
5W
0VY;>V;Y<
F
Y<=/>V/@1@PVB<3
.
I35
PY@8!/
"
*

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W
UMSUU+ZTH4X
图
%
!
不同植物和鸭儿芹
3
.
I35
氨基酸序列比对
R/
A
-%
!
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18<1V@P98/1@9>/=0<
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北
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植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
马铃薯(绒毛烟草和普通烟草在同一个分支上
ABH
!
1
4
516
基因在不同组织中的表达分析
分别取鸭儿芹植株的根(叶柄(叶(花组织!通过
荧光定量
D3C
检测
!
"
#!$
基因在不同组织的表
达情况结果表明!
!
"
#!$
基因在鸭儿芹根中表
达量最高!其次为叶柄!叶和花中表达量最低"图
*
#根中的表达量分别为叶和花的
&-!*
和
&-&"*
倍!叶柄中表达量分别为叶和花的
,-,(*
和
,-,!(
倍
ABI
!
鸭儿芹
1
4
516
基因在不同温度下的表达
为了研究温度对鸭儿芹产生的影响!取其
!
月
龄健壮幼苗于不同温度下分别处理不同时间!荧光
定量
D3C
检测
!
"
#!$
基因在叶片和叶柄中的相
对表达量"以
"B
为对照!表达量设为
#
#
叶片检测结果表明"图
&
#!在
"-$B
时!
#"J
时
表达量下调!而
#J
(
%"J
和
%J
处理表达量较
高!其中
%"J
处理表达量远高于其他处理!提高达
到
!,-(
倍!而
#"J
(
#J
(
%J
处理下表达量比
对照分别提高
"-!*
(
%-%%
(
-",
倍在
#B
时!
#J
处理表达量下调!而在
%"J
和
%J
处理下表达量
较高!
%J
处理表达量最高在
!
$
,B
时!
#J
和
%J
处理表达量相似!而且
#"J
和
%"J
处理的表
达量均高于前两者!
%"J
处理表达量最高而在

$
#!B
时!
%"J
和
%J
处理表达量下调!
%"J
处
理表达量最低但在
#!B
时!所有处理的表达量都
图
*
!
鸭儿芹不同组织中
!
"
#!$
基因的相对表达
不同大小写字母分别表示
"-"#
和
"-"$
水平差异显著性
R/
A
-*
!
C<:9V/[<<]
F
Y<00/@1:<[<:0@P!
"
#!$
A
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F
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A
1/P/>91V=/PP<9V"-"$91="-"#:<[<:0
图
$
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不同植物
I35
进化树
标尺代表遗传距离
R/
A
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期
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吴雪君!等$鸭儿芹羟基肉桂酸转移酶基因的克隆及其对不同温度的响应
图
&
!
不同温度处理下鸭儿芹叶片中
!
"
#!$
基因的相对表达水平
同一温度处理不同大小写字母分别表示
"-"#
和
"-"$
水平差异显著性&下同
R/
A
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!
C<:9V/[<<]
F
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图

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不同温度处理下鸭儿芹叶柄中
!
"
#!$
基因的相对表达水平
R/
A
-
!
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F
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W
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"
#!$
A
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F
F
高于
B
处理在
!,B
时!
%J
处理表达量最低!
#"J
(
#J
和
%"J
处理下表达量都高于
%J
处
理在
#"J
和
#J
处理下
!
"
#!$
基因的相对表
达量在
#!B
时达到峰值!且
#J
处理表达量较低
在
#"J
和
#J
处理下
!
"
#!$
基因的相对表达量
在
!,B
时降低在
%"J
与
%J
处理下
!
"
#!$
基
因的相对表达量在
"-$B
时达到峰值!且
%"J
下表
达量较高
叶柄检测结果表明"图

#!
#"J
处理表达量全
部下调!且在
,
$
!,B
时表达量较为相近!
B
处理
表达量为该温度下所有处理表达量峰值!与对照相
比无极显著性差异
#J
处理表达量全部上调!且
在
"
$
,B
时表达量随着时间的延长而增加!在
#B
时表达量与对照相比已有极显著性差异
%"J
和
%J
处理在
"-$B
时表达量均上调且有极显著性
差异!其中
%J
比
%"J
处理表达量更高!分别提高
%-"!
和
!-,,
倍&在
#B
时!
%J
和
%"J
处理表达
量相似&在
!B
时!前者表达量最高!提高到
%-$$
倍在
#J
处理下!
!
"
#!$
基因的相对表达量在
,B
时达到峰值&在
%"J
处理下!
!
"
#!$
基因的相
对表达量在
"-$B
时达到峰值&在
%J
处理下!
!
"
#!$
基因的相对表达量在
!B
时达到峰值!且
"-$B
时表达量高于
%"J
处理下
!
"
#!$
基因的相
对表达量
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报
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卷
%!
讨
!
论
!
"
#!$
基因在植物木质素合成中具有重要作
用)#&+!"*木质素的合成过程需要受到多个基因的调
控!是一个复杂的过程当该过程中某个酶的表达
活性降低时!其他酶的表达活性也会受到影响)!#+!!*
木质素
%
种单体的合成均起始于莽草酸代谢中生成
的苯丙氨酸"
F
B<1
W
:9:91/1<
#!苯丙氨酸通过苯丙氨
酸氨裂解酶"
DLX
#生成反式肉桂酸"
VY910+>/1198+
/>9>/=
#此外!在该生物合成进程中!对
+
香豆酰辅
酶
L
在羟基肉桂酸转移酶"
I35
#和肉桂酸
+%+
羟化
酶"
3%I
#的催化下!最终合成咖啡酰辅酶
L
"
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W
+
:3@L
#咖啡酰辅酶
L
在
T+
甲基转移酶"
TZ5
#和
阿魏酸
+$+
羟化酶"
R$I
#的作用下!依次生成阿魏酰辅
酶
L
"
PW
+:3@L
#和
$+
羟基阿魏酰辅酶
L
"
$+
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W
PW
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#
$+3@L
苯环上
$
位的羟基被
TZ5
家族的
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或
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甲基化后!经肉桂
酰辅酶
L
还原酶"
33C
#和肉桂醇脱氢酶"
3LH
#的催
化后形成木质素的直接单体)!%*例如!研究表明转
基因烟草中
?6@
表达活性降低后!木质素的含量也
随之降低!但是该烟草的正常生长发育被抑制)!,*
如果以植物能够进行正常生长为条件!以降低木质素
含量!提高
U
%
O
"紫丁香基木质素%愈创木基木质素#
比值等为衡量标准!那么
!,#
(
#!$
(
!!)6=>$
(
A$#
和
!63
等都是可用的理想基因例如在苜蓿
中利用反义
C2L
技术抑制
!%#
(
!,#
和
!=>$
的表达会使木质素的含量明显降低!提高单体比
值)!$*还有一种被称为
T+
甲基转移酶的物质!即
咖啡酰辅酶
L+%+T+
甲基转移酶"
33@L@Z5
#!当采
用反义
C2L
技术抑制烟草
!.)6=>$
活性时!会
使木质素的含量降低并且改变其组分成分例如紫
丁香基木质素会有所增加)!*+!&*
U<^ 9:V
又对抑制
?6@
或
!,#
表达转基因烟草进行了进一步的研究
并加以比较!结果表明在烟草中反义转入
?!,#B
!!)6=>$
基因!能有效降低木质素的含量)!+!(*
人工栽培鸭儿芹的目的是为了采摘其嫩叶和叶
柄!延缓鸭儿芹木质素的合成有利于提高鸭儿芹品
质在叶柄处理较低温度"
#"J
和
#J
#时基因表
达量比较高温度"
%"J
和
%J
#时基因表达量更低
更慢!根据苜蓿中的研究可以推测出!较低温度处理
时鸭儿芹中木质素含量可能减少)#*该实验意义在
于初步研究低温栽培鸭儿芹能抑制其体内
!
"
#!$
基因的表达!与鸭儿芹为冷凉性蔬菜的结论一
致)##*鸭儿芹栽培过程中!高温促进鸭儿芹的生长
发育!且较易导致鸭儿芹木质化程度提前出现!同时
温度过高!也会阻碍鸭儿芹生长发育!低温虽然延迟
木质素的合成!也会出现鸭儿芹生长发育不良!产量
低等现象)!%*因此还需要进一步研究温度对鸭儿
芹生长发育的影响!为人工种植鸭儿芹温度控制提
供借鉴
参考文献!
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