全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 334-336(2012)
收稿日期: 2011-04-25; 修回日期: 2012-02-10
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30971949); 教育部高校博士点专项基金(20090073110048); 公益性行业(农业)科研专项
(200903056); 上海市科委重点项目(09391910900); 上海市科委重大科技攻关项目(09dz1900103); 现代农业产业技术体系
专项(CARS-02)
通讯作者: 陈 捷,教授,博士生导师,主要从事植物病理学和环境微生物工程研究; E-mail: jiechen59@sjtu. edu. cn。
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췍研究简报
绿木霉 Sm1 基因的克隆、原核表达及蛋白纯化
朱洁伟, 吴 琼, 陈 捷*
(上海交通大学农业与生物学院 农业部都市农业(南方)重点开放实验室, 上海 200240)
Sm1 gene cloning from Trichoderma virens, prokaryotic expression and protein
purification　 ZHU Jie-wei, WU Qiong, CHEN Jie　 (School of Agriculture and Biology and Key Laboratory of
Urban Agriculture (South) of Ministry of Agriculture , Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)
Abstract: Trichoderma spp. have been recognized as the agents for the biocontrol of plant disease. They
produce or release a variety of compounds that induce localized or systemic resistance responses in plants. In
this study, Sm1 gene was cloned from Trichoderma virens (YZ2612) . Sequence analysis showed that the cD-
NA fragment had an ORF with length of 414 bp encoding 138 amino acid residues. The recombinant prokar-
yotic expression vector pET-28a( + ) -Sm1 was constructed, and then transformed into Escherichia coli BL21
(DE3) . IPTG concentration, induction time and temperature were optimized for enhancing fused protein ex-
pression, It was revealed that the best expression was achieved under conditions of 24℃ and 1 mmol / L of
IPTG for 4 hours. The recombinant protein was solubilized, denatured, refolded, and purified. These results
might offer an important gene resource for being used to construct transgenic resistant lines of plants and to
prepare new kind of protein biofungicide.
Key words: Sm1 gene; Trichoderma; prokaryotic expression; protein purification
文章编号: 0412-0914(2012)03-0334-03
　 　 木霉菌(Trichoderma spp. )是土壤内普遍存在
的习居菌,具有多种生物防治功能,其中诱导植物
免疫反应是重要的生物防治功能之一[1]。 木霉菌
Sm1 蛋白 ( small one protein) 是从绿木霉 ( Tri-
choderma virens)中分离得到的一种低分子量、富
含半胱氨酸的疏水性蛋白,属于蛋白类激发子,与
Cerato-platanin基因家族有很高的同源性,具有诱
导植物免疫抗性的作用[2]。 该小分子蛋白对植物
和微生物无毒,能诱导棉花、水稻活性氧的释放以
及葡聚糖酶、几丁质酶和过氧化物酶等防御反应基
因的局部和系统表达[3]。 关于木霉 Sm1 基因表达
特性研究国内外报道较少,本研究从华东地区分离
到的绿木霉菌株中克隆 Sm1 基因,通过该基因的
原核表达获得纯化的融合蛋白质,为今后利用 Sm1
进行转基因抗性育种、创制新蛋白农药和揭示木霉
菌诱导植物免疫分子机理提供参考。
1　 材料与方法
1. 1　 供试菌株
本实验室木霉资源库菌株 Trichoderma virens
(YZ2612)
1. 2　 主要酶等分子试剂
原核表达载体 pET-28a ( + ) 及其宿主菌
　
　 3 期 　 　 朱洁伟,等:绿木霉 Sm1 基因的克隆、原核表达及蛋白纯化
E. coli BL21 (DE3) 均为本实验室保存。 限制性
内切酶 BamH Ⅰ、 Xho Ⅰ、 T4 DNA 连接酶、蛋白标
准分子量均购于北京经科宏达生物技术有限公司
上海分公司。 Premix Taq Version 2. 0 购于大连宝
生物公司。
1. 3　 引物设计
根据已克隆的木霉菌 Sm1 基因全长 cDNA 序
列,分析限制性酶切位点,并根据原核表达载体
pET-28a( + )的特点,在 Sm1 基因全长 cDNA ORF
区域的 5′ 和 3′ 末端分别设计上下游引物 Sm1-F
(5′-CGCGGATCCATGCAACTGTCCAACATC-3′)
和 Sm1-R(5′-CCGCTCGAGGAGACCGCAGTTCT-
TAA-3′)。 在上下游引物的 5′端分别加入 BamH
Ⅰ和 XhoⅠ酶切位点和保护碱基(下划线部分为酶
切位点,斜体部分为保护碱基)。
1. 4　 Sm1 基因的克隆及融合表达载体的构建
利用 Trizol 法提取木霉菌株 Trichoderma vi-
rens (YZ2612)的总 RNA。 利用 Oligo(dT)18 引
物逆转录合成第一链 cDNA,按 TaKaRa 公司 Pri-
meScript TM RT reagent Kit 操作。 以第一链 cDNA
产物为模板, Sm1-F / Sm1-R 为引物对,用 Premix
Taq 酶对 Sm1 基因全长 cDNA ORF 区序列进行
PCR 扩增。 反应条件为:94℃预变性 5 min;94℃
30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s,33 个循环;72℃延伸 8
min。 将双酶切回收的目的片段,连接到同样双酶
切的原核表达载体 pET-28a ( + ),转化 E. coli
BL21(DE3)。 利用 M13 通用引物对阳性克隆进
行测序,融合表达载体命名为 pET-28a( + ) -Sm1。
1. 5　 融合表达载体 pET-28a( + ) -Sm1 的诱导表
达和 SDS-PAGE电泳分析
1. 5. 1　 重组细胞的培养及诱导表达　 挑取重组菌
单菌落,接种至 20 mL含有 100 mg / L 卡那霉素的
LB 培养基中,37℃,220 rpm,培养至 OD600约为
0． 6,取 1 mL阴性菌液作为对照。 设置 IPTG诱导
浓度(1 mmol / L)及不同的诱导温度( 37℃、28℃、
24℃),诱导表达 4 h 后,各取菌液 1 mL,6 000
rpm,离心 5 min,收集菌液沉淀,用 40 μL ddH2O
重悬菌体,加入 10 μL 5 × SDS-Loading Buffer,煮
沸 3 min,室温高速离心 1 min,取上清液,进行
10% SDS-PAGE电泳鉴定。
1. 5. 2　 目的蛋白的可溶性分析 　 100 μL 过夜培
养的阳性菌液转接到 100 mL LB 液体培养基(含
100 mg / L卡那霉素)中,37℃,200 rpm,培养至
OD600约为 0． 6,IPTG 诱导 4 h。 用 50 mL 大离心
管,6 000 rpm,离心 5 min,弃上清。 沉淀用 20 mL
冰冷的 Lysis buffer ( 50 mmol / L Na3PO4、 300
mmol / L NaCl,pH 8. 0)溶液吹散,进行冰上超声:
超 5 s,停 10 s,超 100 次,功率 200 W。 电泳确定
表达形式:取 100 μL 超声后的菌悬液,4℃,10 000
rpm,离心 10 min。 取 40 μL上清液至另一 EP管,
同时将沉淀用 40 μL Lysis buffer(pH 8. 0)溶液吹
散,两管分别加入 10 μL 5 × SDS-Loading buffer,
100℃煮 3 min,10% SDS-PAGE检测。
1. 6　 目的蛋白的纯化及Western blotting
参考 Ren[4]等方法,对蛋白进行复性纯化及
Western blotting。
2　 结果与分析
2. 1　 融合表达载体 pET-28a( + ) -Sm1 的诱导表
达和 SDS-PAGE表达分析
设置不同的诱导温度( 37℃ 、28℃ 、24℃ )诱
导表达 4 h,观察蛋白诱导表达的差异情况(图
1),结果发现随着诱导温度的降低,目的蛋白诱
导表达量逐渐增加。 28℃和 24℃时目的蛋白的
表达量大于 37℃时诱导的蛋白表达量,说明低温
诱导有助于增加重组蛋白的产率。
Fig. 1 　 SDS-PAGE analysis of recombinant
protein at different temperature
Lane 1,3,5: Recombinant protein in the absence of IPTG at
37℃, 28℃, 24℃; Lane 2,4,6: Recombinant protein in the
presence of IPTG for 4 h at 37℃, 28℃, 24℃.
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植物病理学报 42 卷
2. 2　 目的蛋白可溶性分析
SDS-PAGE电泳发现(图 2),目的诱导蛋白主
要集中在沉淀中,而在上清液中几乎没有出现目的
蛋白,说明目的蛋白主要以包涵体形式存在于大肠
杆菌中,为不可溶。
2. 3　 目的蛋白的纯化及Western blotting
将上清液和沉淀分别加入 SDS-上样缓冲液分
别进行电泳,结果在沉淀中得到了初步纯化的目的
蛋白(图 3)。 对不同含量的纯化蛋白,进行 Wes-
tern杂交,检测目的蛋白,结果发现目的条带均能
出现杂交信号 (图 4)。
Fig. 2 　 SDS-PAGE analysis of recombinant
protein
M: Marker; Lane 1: Total cell proteins in non-induced E.
coli cells; Lane 2: Total cell proteins in induced E. coli cells
for 4 h; Lane 3, 4: Soluble fractions and insoluble fractions
of total cell proteins in induced E. coli cells for 4 h.
Fig. 3　 SDS-PAGE analysis of the purified fu-
sion protein
Lane M: Marker; Lane 1: Purified fusion protein.
Fig. 4 　 Western blotting of recombined Sm1
protein
Protein blots were probed with Sm1 antibody. Lane 1: 3 μL
protein; Lane 2: 5 μL protein ; Lane 3: 10 μL protein; Lane
4: 15 μL protein.
3　 结论与讨论
本文利用原核表达系统对绿木霉 Sm1 蛋白进
行了表达,在 IPTG 为 1 mmol / L,24℃诱导 4 h 时
产率较高,可溶性分析显示该蛋白以包涵体形式存
在。 作为有益的生防微生物,木霉菌可产生多种具
有诱导抗性功能的激发子,如疏水蛋白、次生代谢
物、有抗菌活性的酶类等。 近年发现 Sm1 在功能
上属于一种效应因子,可激发宿主植物发生 ETI反
应[5]。 Djonovic[3]等研究表明,在不同营养条件
下,Sm1 能在真菌整个生长发育过程中表达,利用
过表达子处理玉米根系,进行炭疽病菌(Colletotri-
chum sp. )的接种,发现木霉菌株的 Sm1 高水平表
达与玉米叶片茉莉酸诱导增加和发病程度下降呈
正相关,因此可以将 Sm1 作为一种免疫诱导因子,
使之在田间病害防治中发挥重要作用,并为进一步
利用该基因构建转基因抗病品种、创制蛋白农药提
供重要资源。
参考文献
[1] 　 Hanson L E, Howell C R. Elicitors of plant defense
responses from biocontrol strains of Trichoderma virens
[J] . Phytopathology, 2004, 94: 171 -176.
[2] 　 Djonovic S, Pozo M J, Dangott L J, et al. Sm1, a
proteinaceous elicitor secreted by the biocontrol fungus
Trichoderma virens induces plant defense responses and
systemic resistance[J] . Molecular Plant-Microbe Inter-
actions, 2006, 19: 838 -853.
[3] 　 Djonovic S, Vargas W A, Kolomiets M V, et al. A
proteinaceous elicitor Sm1 from the beneficial fungus
Trichoderma virens is required for induced systemic re-
sistance in maize[ J] . Plant Physiology, 2007, 145:
875 -889.
[4] 　 Ren X, Wu Z Y, Huang C L, et al. Expression and
purification of Arabidopsis FT gene in prokaryotic cells
( in Chinese) [J] . Biotechnology Bulletin(生物技术
通报), 2010, 3: 99 -103.
[5] 　 Lorito M, Woo S, Harman G, et al. Translational re-
search on Trichoderma: from’Omics to the field[ J] .
Annual Review of Phytopathology, 2010, 48: 395 -
417.
责任编辑:于金枝
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