全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 42(4): 436-439(2012)
收稿日期: 2011-06-23; 修回日期: 2012-04-25
基金项目: 国家质检总局科技计划项目(2009IK264)
通讯作者: 李会平, 副教授, 主要从事植物病害防治研究; E-mail:huipingli@sohu. com。
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췍研究简报
大豆茎溃疡病菌子囊壳诱导及孢子萌发方法探索
李会平1*, 师 情1, 王 凯2
( 1河北农业大学林学院, 保定 071000; 2河北出入境检验检疫局, 秦皇岛 066000)
Method of the perithecium producing and ascospore germination of Diaporthe
phaseolorum LI Hui-ping1, SHI Qing1, WANG Kai2 ( 1College of Forest, Hebei Agricultural University,
Baoding 071000, China; 2Hebei Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinhuangdao 066000, China)
Abstract: Diaporthe phaseolorum is a potential dangerous fungus to soybean. Determination method for ob-
taining a big amount of ascospores and a reliable spore germination rate is the base of quarantine treatment and
control. On the basis of acquiring quantities of perithecium of D. phaseolorum, a new method of ascospore
germination with perithecium as the observation unit was explored. In the test, the traditional suspended drops
method and water agar surface germination method were used as reference. The results showed that the germi-
nation rate of perithecium germination method was lower than that of traditional method in the earlier stage
(12 h, 24 h, 36 h), then became in accordance with the traditional method gradually. So, for pathogenetic
fungi which can easily produce quantities of perithecium on the host organization and difficultly obtain asco-
spore, perithecium germination method has reference value on spore germination rate determination.
Key words: Diaporthe phaseolorum; spore germination; perithecium germination
文章编号: 0412-0914(2012)04-0436-04
大豆茎溃疡病是为害大豆的重要病害,世界上
十大大豆生产国中已有 7 个国家发现大豆茎溃疡
病菌的分布,对当地农业造成严重威胁[1]。 该病
是我国进境植物检疫性有害生物[2],目前没有发
生为害的报道。 大豆茎溃疡病菌以菌丝和子囊壳
在大豆植株及其残体上越冬,子囊壳在干燥 35 d
后子囊孢子仍能萌发[3]。 在该病害的检疫处理和
防治工作中,子囊孢子萌发率的检测是一项重要任
务。 因此,如何快速获得大量的子囊孢子及简便快
捷的孢子萌发率测定方法就显得尤为重要。 在常
规离体培养条件下,病原菌在培养基内部几乎不产
生子囊壳,给利用子囊孢子进行进一步的研究带来
不便。 本研究采用常规培养基培养数天后加入寄
主组织的方法获得了大量的子囊壳。 传统的孢子
萌发方法主要有悬滴法、水琼脂板表面萌发法、培
养皿萌发法、琼脂平板表面萌发法等,但这些方法
均需要大量纯净的孢子悬浮液,目前国外在收集子
囊孢子时,多采用自然放射法,而国内仍采用传统
方法,即利用孢子的自然弹射或用水洗,这不仅不
易控制,而且收集的量也很有限,同时给利用孢子
悬浮液进行孢子萌发试验无疑增加了难度和工作
量。 本文在得到大量子囊壳的基础上,探索了一种
新的测定孢子萌发率的方法。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试菌株:大豆北方茎溃疡病菌 (Diaporthe
phaseolorum var. caulivora,DPC),编号为 60217,
从 American Type Culture Collection(ATCC)购买。
大豆南方茎溃疡病菌(D. phaseolorum var. meridio-
nalis,DPM),编号为 Select-1,由中国检验检疫科
学研究院动植物检疫研究所提供。
4 期 李会平,等:大豆茎溃疡病菌子囊壳诱导及孢子萌发方法探索
1. 2 方法
1. 2. 1 大豆茎溃疡病菌子囊壳诱导 将供试菌株
接种在水琼脂培养基上 3 d后,接种 1 cm长、经过
连续 3 次高压灭菌(将大豆秸秆用自来水冲洗后,
自然风干,切成 1 cm 左右的小段,置于培养皿中,
加少量蒸馏水以保持其润湿,在 121℃,25 min 下
高压灭菌)的大豆秸秆,12 h 光照 /黑暗交替,25℃
恒温培养,待子囊壳和子囊孢子成熟后取出秸秆,
放置在无菌的培养皿中备用。
1. 2. 2 大豆茎溃疡病菌子囊孢子萌发
(1)孢子悬浮液制备 将长有子囊壳的大豆
秸秆用接种针轻轻去掉喙部,无菌水中浸泡 10 min
后取出,用灭菌毛笔(121℃灭菌 30 min)轻刷秸秆
使子囊孢子释放于无菌水中,配制孢子悬浮液浓度
为 7. 2 ×106 个 / mL。
(2)测定孢子萌发率 以悬滴法和水琼脂板
表面萌发法为对照,参照 Fang[4]和 Xu[5]的方法进
行操作。 2 种方法分别于培养 12、24、36、48、60 h
后观察孢子萌发率。 每个处理设置 5 次重复,每次
观察 500 ~ 800 个孢子。 孢子萌发标准:以芽管长
度超过孢子直径长度(指直径最小的一边)的一
半,视为已经萌发的孢子。
孢子萌发率(% ) =萌发孢子数孢子总数 ×100%
(3)子囊壳萌发法 将长有子囊壳的大豆秸
秆无菌水冲洗后,1% NaClO 中表面消毒 30 s,灭
菌水冲洗 3 次后,置于铺有 3 层湿滤纸的培养皿
中,25℃恒温保湿培养,12、24、36、48、60 h 后用解
剖镜观察其萌发情况,每次观察 5 个大豆秸秆。
萌发率(%) =产生菌丝的喙(或子座)所有的喙(或子座) ×100%
2 结果与分析
2. 1 大豆茎溃疡病菌子囊壳诱导结果
大豆秸秆接种于水琼脂培养基上 10 d 后开始
出现黑色病斑,随后在病斑上陆续出现大量黑色的
突起,即子囊壳的喙。 菌株 Select-1 子囊壳扁球
形,直径(159 ~ 232)μm × (246 ~ 369)μm,常单生
埋生于豆秆表皮中。 喙长(292 ~ 391)μm,宽(88
~ 105 )μm,喙宽度均匀,顶部钝圆(图 1-B)。 菌
株 60217 子囊壳黑色、球形,单生或 2 ~ 12 个丛生,
直径(165 ~ 340) μm × (282 ~ 412) μm,埋生于表
皮组织中。 喙表面光滑,喙长(180 ~ 336) μm,宽
(75 ~ 110) μm,喙宽度均匀,顶部钝圆(图 2-B)。
Fig. 1 The perithecia and germination shape of Diaporthe phaseolorum
var. meridionalis(Select-1) on the soybean stalk
A: Perithecia germination shape; B: Perithecia on the soybean stalk.
Fig. 2 The perithecia and germination shape of Diaporthe phaseolorum
var. caulivora (60217)on the soybean stalk
A: Perithecia germination shape; B: Perithecia on the soybean stalk.
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4 期 李会平,等:大豆茎溃疡病菌子囊壳诱导及孢子萌发方法探索
2. 2 不同方法孢子萌发率比较
保湿培养后,菌株 Select-1 子囊壳的喙上开始
长出白色菌丝(图 1-A),菌株 60217 的子囊壳因大
多是丛生,孢子萌发时首先在子座的周围观察到菌
丝体(图 2-A),因此以子座作为观察单位。 美国南
方大豆茎溃疡病菌 Select-1 和北方茎溃疡病菌
60217 不同方法的孢子萌发率情况见表 1。
由表 1 可知, 2 个菌株在处理 12 h 后均开始
萌发,随着时间延长,萌发率逐渐上升。 与传统方
法相比,本试验采用的子囊壳萌发法在前期(12、
24 和 36 h)萌发率均比较低,之后与传统方法的萌
发结果逐渐一致,48 h 时与悬滴法的萌发率相当,
而 60 h时与水琼脂板表面萌发法相当,分别达到
93. 8%和 89. 3% 。
3 讨论
3. 1 本试验采用高压灭菌的大豆秸秆诱导产生
了大量的子囊壳,分析其原因,主要是因为前期的
水琼脂培养基因营养极少,限制了病菌的生长,而
大豆作为该病原菌的主要寄主,其秸秆中含有大量
可以刺激子囊壳产生的物质。
3. 2 本试验采用子囊壳萌发法获得了与传统方
法相似的萌发率,该方法对于其他可在寄主上大量
产生子实体,但不易获得孢子的病原菌,具有一定
参考价值。
3. 3 采用子囊壳萌发法时,在处理的早期其萌发
率略低于传统方法,其原因可能是由于子囊壳萌发
首先需要子囊壳吸水,使得观察到的萌发情况要滞
后于传统方法。 因此,在实际应用时不宜过早观察
记载萌发率,而观察时间过晚,菌丝会生长连在一
起,影响结果的统计。 因此,对于不同病原菌,要根
据其萌发特性具体确定其观察的适宜时间。
参考文献
[1] Pioli R N,Morandi E N,Martinez M C, et al. Mor-
phologic,molecular,and pathogenic characterization of
Diaporthe phaseolorum variability in the core soybean-
producing area of Argentina [ J ] . Phytopathology,
2003, 93(2): 136 -146.
[2] Wang Y,Yang W D,Chen Z N,et al. Biological cha-
racters and the risk of introduced into China of Dia-
porthe phaseolorum( in Chinese)[ J] . Plant Quarantine
(植物检疫), 2009, 23(1): 23 -25.
[3] Backman P A,Weaver D B,Morgan-Jones G. Soybean
stem canker:An emerging disease problem [ J] . Plant
Disease, 1985, 69: 641 -647.
[4] Fang Z D. Plant disease research methods( in Chinese)
[M] . Beijing:China Agriculture Press(北京:中国农
业出版社), 1998. 151 -153.
[5] Xu W Y. General phytopathology experiment guidance
( in Chinese)[M] . Beijing:Science Press(北京:科学
出版社), 2006. 74.
责任编辑:于金枝
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