全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 432鄄436(2011)
收稿日期: 2010鄄08鄄30; 修回日期: 2011鄄05鄄12
基金项目: 国家质量监督检验检疫总局项目(2007IK259; 2009IK276); 甘肃省科技厅中小企业创新基金计划 (0802NCCA028)
通讯作者: 刘 箐,副研究员,主要从事植物检疫研究; Tel: 0931鄄8658115, E鄄mail: ciqql@sohu. com。
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研究简报
应用蛋白宏阵列快速检测西瓜细菌性果斑病菌
熊亮斌1,2, 高丽萍1, 刘 箐2,3*, 夏俊芳2, 黄超杰2, 王天昌3
( 1兰州大学, 兰州 730000; 2甘肃出入境检验检疫局, 兰州 730020; 3兰州慧盟生物科技有限公司 兰州 730010)
Rapid detection of Acidovorax avenae subsp. citrulli using protein macroarray 摇
XIONG Liang鄄bin1,2, GAO Li鄄ping1, LIU Qing2,3, XIA Jun鄄fang2, HUANG Chao鄄jie2, WANG Tian鄄chang3
( 1 School of Basic Medical Science, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China; 2 Gansu Entry鄄Exit Inspection and Quarantine
Bureau, Lanzhou 730020, China; 3 Lanzhou Prajna鄄Union Biology Technique Ltd. , Lanzhou 730010, China)
Abstract: Acidovorax avenae subsp. citrulli (Aac) is a seedborne pathogen harmed cucurbitaceae plants se鄄
riously. In this research, a protein macroarray was developed to detect the pathogen rapidly using chemilumi鄄
nescence. On nitrocellulose membrane, a macroarray was fabricated and it showed satisfactory results in the
detectability. The macroarray could detect Aac as low as 2. 3 伊 105 cfu / mL without apparently crossing reac鄄
tion with other seedborne pathogens of cucurbitaceae crops, and it showed a same detectability with ELISA for
seed samples. This method also had a good specificity and repeatability. Moreover, 60 seed samples were
used to test the practicability of this detection method. The results showed that the detection system had a high
consistent (60 / 60) with ELISA assay. This system had identical detectability with only 1 / 12 capture antibody
and 1 / 8 detection time of ELISA assay and the operation was very convenient. After assembling with a hybri鄄
dization box, it could be generalized to grass roots workstation. Meanwhile, this work provided a basis of
simultaneous detection to multiple plant pathogens using protein macroarray.
Key words: Acidovorax avenae subsp. citrulli; protein macroarray; rapid detection
文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0432鄄05
摇 摇 蛋白阵列(Protein array)也叫蛋白芯片,是生
物芯片(Biochip)的一种,主要利用抗原 /抗体可特
异性结合原理制备而成。 按阵列样点大小,蛋白阵
列又可分为微阵列(Microarray)和宏阵列(Mac鄄
roarray)两类。 微阵列集成度极高,可进行高通量
平行分析,已较多应用于蛋白质组学等基础研究领
域[1];宏阵列样点较大,集成度较低,多用于目视
化检测领域[2]。
西瓜细菌性果斑病菌,学名为燕麦噬酸菌西瓜
亚种[Acidovorax avenae subsp. citrulli ( Schaad)
Willems et al. (Aac)],是一种革兰氏阴性菌。 该病
原在我国新疆、内蒙古等省部分地区记录的最高发
病率甚至可达 100% ,对当地西瓜、甜瓜的生产造
成毁灭性危害。 西瓜果斑病菌主要依靠带菌种子
远距离传播,常用检测方法主要有种子培养、分离
培养、血清学方法和基于 PCR 的分子生物学方
法[3]。 本研究利用蛋白宏阵列技术,建立一种快
速、灵敏、廉价的西瓜果斑病菌检测新方法。 以种
子提取液测试阵列对实际样品的检测能力,结果显
示其阳性检出率与 ELISA 相当,显示良好的实用
前景。 同时,本研究为利用蛋白芯片同时检测多种
植物病原的研究奠定基础。
摇
摇 4 期 摇 熊亮斌,等:应用蛋白宏阵列快速检测西瓜细菌性果斑病菌
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料与试剂
硝酸纤维素膜 (孔径 0. 45 滋m,美国 Milli鄄
pore);西瓜果斑病菌株 Acidovorax avenae subsp.
citrulli (NCPPB: 3679,英国国家植物致病性细菌
培养中心);西瓜果斑病菌 ELISA 检测试剂盒
(SRA 14800 / 1000,美国 Agdia);魔芋假单胞菌
Acidovorax konjaci 由 Hu 等[4]从水稻茎部分离鉴
定,并由福建省农业科学院农业生物资源所刘波老
师惠赠;黄瓜细菌性角斑病菌 Pseudomonas syrin鄄
gae pv. lachrymans阳性液(苏格兰 Neogen),黄瓜
花叶病毒、西瓜花叶病毒阳性液(美国 Agdia);显
色底物 5鄄溴鄄4鄄氯鄄3鄄吲哚基磷酸盐 /四唑硝基蓝
(BCIP / NBT,天津 TIANGEN);脱脂奶粉(黑龙江
省完达山乳业股份有限公司)。
1. 2摇 细菌悬液制备
菌种复壮后,接种于 KB 液体培养基(聚蛋白
胨 20. 0 g, Mg2SO4·7H2O 1. 5 g, K2HPO4 1. 5 g,
丙三醇 10. 0 mL, ddH2O 1 000 mL), 28益水浴摇
床(100 r / min)培养 24 h。 菌悬液以无菌 PBS
(NaCl 8. 0 g, Na2HPO4 . 2H2O 1. 15 g, KH2 PO4
0郾 2 g, KCl 0. 2 g, ddH2O 1 000 mL, pH 7. 2 ~
7郾 4) 10 倍梯度稀释,制得 Aac 梯度菌液。 平板计
数法获取细菌悬液浓度。
1. 3摇 蛋白宏阵列制作
将硝酸纤维素膜裁成适当大小(0. 8 cm 伊 0郾 8
cm),去离子水浸泡 20 min, 37益干燥 20 min。 以
点样缓冲液 (Na2 CO3 1. 59 g, NaHCO3 2. 93 g,
NaN3 0. 2 g, ddH2O 1 000 mL, pH 9. 6) 5 倍稀释
捕获抗体至 80 mg / L,同时以碱性磷酸酶标记的
IgG为阳性对照,点样缓冲液为阴性对照。 在膜表
面,按阳性对照、阴性对照、捕获抗体自左向右,每
点 0. 2 滋L 依次点样,各 4 ~ 8 个重复。 37益固定
30 min, 4益保存备用。
1. 4摇 特异性、灵敏度及重复性测试
特异性测试:取 3 批 Aac阳性的不同葫芦科植
物种子提取液,可种子带菌的黄瓜细菌性角斑病
菌、与 Aac 近源的魔芋假单胞菌、可同时感染西瓜
的黄瓜花叶病毒, Aac 阳性对照液及 PBS 各
300滋L,分别与蛋白阵列反应 45 min。 PBST (PBS
+ 0. 05% Tween鄄20)洗涤 1 min,重复 3 次。 用
PBST (含 1. 2%脱脂奶粉)按 200颐 1 稀释 Aac 检
测抗体,各取 300 滋L加至阵列表面,室温下继续振
荡反应 45min,洗涤。 最后加入适量的 BCIP / NBT
显色液避光显色 15 min, ddH2O洗涤终止反应,晾
干保存结果。
灵敏度测试:取 Aac 梯度菌液各 300 滋L 分别
与蛋白宏阵列振荡孵育(60 r / min) 45 min,其余步
骤与特异性测试相同。 另取本室保存的 Aac 阳性
种子提取液,PBS 10 倍梯度稀释,各取 300 滋L 分
别与蛋白阵列反应。 参照 Aac ELISA 检测试剂盒
推荐流程,同步检测上述梯度菌液、阳性种子梯度
稀释液:以碳酸盐缓冲液(Na2CO3 1. 59 g, NaH鄄
CO3 2. 93 g, NaN3 0. 2 g, ddH2O 1 000 mL, pH
9郾 6) 200 倍稀释捕获抗体至 2 mg / L,每孔 100 滋L
加至 96 孔板,置于湿盒中 37益孵育 4h, PBST 洗
板 3 次,按 100 滋L / well加入待检测样品, 4益杂交
过夜(16 ~ 18 h),次日以 PBST 洗板 5 次,随后加
入 200 倍稀释的酶标记抗体,置于湿盒中 37益孵
育 2 h,PBST 洗涤 4 次,每孔加入 PNP 显色液各
100 滋L,室温下避光显色 1 h,酶标仪读取 OD405吸
光度值。
重复性验证:以同一份 Aac 阳性种子提取液,
分别与 3 个蛋白阵列反应,验证阵列检测的稳
定性。
1. 5摇 种子样品的检测
收集 60 批葫芦科植物种子样品(西瓜、甜瓜、
南瓜、西葫芦),各随机挑取 20 粒,在灭菌研钵中
研碎。 粉末与提取缓冲液(聚乙烯吡咯烷酮 MW
24000 ~ 40000 20. 0 g, Na2SO3 1. 3 g, NaN3 0. 2 g,
卵清蛋白 2. 0 g, Tween鄄20 20. 0 g, PBST 定容到
1 000 mL, pH 7. 4)按 1颐 10 (1 g种子粉末颐 10 mL
提取缓冲液)配制种子样品液。
按 ELISA法推荐流程,检测 60 份种子样品提
取液。 然后以蛋白阵列复检,对比 ELISA 结果,评
估其对实际样品的检测能力。
2摇 结果与分析
2. 1摇 特异性测试
以蛋白阵列分别检测 3 批 Aac 阳性的葫芦科
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植物病理学报 41 卷
植物种子,及黄瓜细菌性角斑病菌、魔芋假单胞菌、
黄瓜花叶病毒 3 种病原,测试其对 Aac的特异性检
测能力。 结果显示,蛋白阵列对 3 种带 Aac菌的葫
芦科植物种子,检测结果均显示较强阳性(图 1鄄A,
B, C);而在对黄瓜细菌性角斑病菌、魔芋假单胞
菌、黄瓜花叶病毒的检测中,均无明显阳性反应
(图 1鄄E, F, G), 图 1鄄D和图 1鄄H 分别为阴性、阳
性对照实验结果,显示蛋白阵列对西瓜果斑病菌良
好的检测特异性。
Fig. 1摇 Specificity test of macroarray
A鄄C: Three positive seed sample suspensions; D: Negative
control; E鄄G: Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Aci鄄
dovorax konjaci, Cucumber mosaic virus; H: Positive con鄄
trol.
2. 2摇 灵敏度测试
以蛋白阵列分别与 Aac 梯度纯菌液和阳性种
子提取液反应,对比 ELISA检测结果,测试阵列的
检测灵敏度。 当阵列阳性对照显色、阴性对照不显
色时,可认为检测结果可信。 结果表明,蛋白阵列
对 Aac 标准菌悬液的灵敏度为 2. 3 伊 105 cfu / mL
(图 2鄄A),这比 ELISA 104 cfu / mL的灵敏度(结果
未列出)约低 10 倍。 以扫描仪获取阵列结果,
Quantity One分析灰度,利用阳性对照点灰度值将
各阵列检测点灰度值作归一化处理,绘制标准菌液
浓度与检测灰度值的关系曲线(图 2鄄B),拟合曲线
R2 = 0. 961,表明菌液浓度与灰度值间有一定的线
性相关性。 在对 Aac 阳性种子提取液的检测中
(图 2鄄C),蛋白阵列和 ELISA 法的检测灵敏度均
为 10 -2(图 2鄄D)。 若将阵列检测点灰度值带入拟
合曲线方程,便可估算种子液中细菌浓度;并且随
着种子液的梯度稀释(100 ~ 10 -3), 检测点灰度值
也呈现递减的趋势(图 2鄄D),进一步验证蛋白阵列
定量测定的可能。
2. 3摇 重复性测试
以同浓度的菌液与阵列反应,3 次重复试验结
果(图 3)显示蛋白阵列良好的检测稳定性。
2. 4摇 种子样品的检测
以蛋白阵列检测 60 份种子样品,对比 ELISA
结果 (图 4),评估蛋白阵列实用前景。 微孔板
ELISA法检测 60 份样品,阳性率为 11. 7% (7 /
60),蛋白阵列检测阳性率也为 11. 7% (7 / 60),显
示其对种子样品同等的检测能力,这也验证了 2. 2
中“蛋白阵列相对 ELISA法,对梯度稀释的阳性种
子液灵敏度相同冶的结论。
3摇 讨论
将生物芯片技术用于病原快速检测是目前一
个研究热点。 基于核酸杂交原理,LeBlanc 等[5]利
用寡核苷酸探针构建可同时检测 4 种瘟病毒属病
原的基因芯片,芯片与生物素标记的 PCR 产物杂
交,随后与链霉亲和素偶联的磁珠反应,利用链霉
亲和素结合生物素的高亲和力连接磁珠使杂交结
果肉眼可见。 将基因芯片技术用于病原检测领域
的相关报道还有很多,但目前仍未见有关植物病原
蛋白检测芯片的报道,主要原因可能有以下几点:
第一, 抗体制作成本高、周期长,而植物病原抗体
使用范围又较窄,同时获得针对多种植物病原的特
异性抗体比较困难;第二,具有多级结构的抗体分
子,在芯片制作过程中活性易受温度、pH值等环境
因素的影响而失活;第三,抗原抗体分子间结合力
相对较低,难以保证检测的特异性和灵敏度。
本项研究以西瓜果斑病菌为检测对象,探索将
蛋白芯片技术用于植物病原检测实践,为本实验室
多种植物病原蛋白检测芯片的研发奠定基础。 蛋
白芯片检测植物病原,样品液不需特殊处理,可避
免基因芯片检测中的核酸提取、反转录、分子标记
等操作。 经估算,相对传统 ELISA 法,本方法只需
1 / 12 的捕获抗体,1 / 8 的检测时间; 并且每个阵列
上同时包含阳性对照点、阴性对照点和检测点,不
需另外设计对照试验。 蛋白阵列与本实验室自行
设计的杂交盒组装成西瓜果斑病菌蛋白阵列快速
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摇 4 期 摇 熊亮斌,等:应用蛋白宏阵列快速检测西瓜细菌性果斑病菌
Fig. 2摇 Detection results of serial diluted Aac suspensions and positive
seed samples using macroarray assay
A: Results ofserial diluted Aac suspensions; B: Fitting curve of bacteria concentration with grayscale;
C: Results of serial diluted positive seed sample suspensions; D: Grayscale of serial diluted seed sample suspensions.
Fig. 3摇 Repeatability evaluation of macroarray
检测试剂盒,全检测过程甚至只需 1 套移液器即
可,检测样品量可根据实际情况在300 ~ 1 000滋L
范围内灵活选择,检测结果用肉眼判断,极大的
简化了操作难度,降低了成本,可推广至基层工
作站使用。 若进一步以平板扫描仪获取结果,经
灰度分析,则可实现对西瓜细菌性果斑病菌的定
量检测。
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植物病理学报 41 卷
Fig. 4摇 The detectability comparison of macroarray with ELISA assay to seed samples
A: Seven positive (No. 3, 19, 40, 46, 50, 54, 60) and negative (N) results of 60 seed samples using macroarray assay;
B: Comparison of two detection methods.
致谢: 福建省农业科学院农业生物资源研究所农
业微生物研究中心刘波、胡桂萍惠赠魔芋
假单胞菌株,特此致谢!
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责任编辑:曾晓葳
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