全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$上海市农业科学院青年基金农青年科技
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#(&上海市现代水稻产业技术体系建设沪农科产字"
!"#*
#第
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号(
作者简介$闫
!
影"
#1$(
#!女!硕士!研究实习员!主要从事常规水稻育种工作)
2+34.5
$
6
40
6
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7
"*
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#&%,893
"
通信作者$吴书俊!博士!副研究员!主要从事常规优质粳稻育种工作)
2+34.5
$
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/44/,/<,80
水稻香味基因分子标记的开发及应用
闫
!
影#!诸光明!!张丽霞#!万常照#!曹黎明#!赵志鹏#!吴书俊#"
"
#
上海市农业科学院 作物育种栽培研究所!上海
!"#*"%
&
!
上海市嘉定区农业技术推广服务中心!上海
!"#1""
#
摘
!
要$根据香稻材料在
!"#$!
基因"甜菜碱醛脱氢酶基因#第
)
外显子的突变位点!设计了分子标记
==$+==1
用来区分这种突变类型的香稻材料)同时结合已报道的针对
!"#$!
在第
!
*
*
*
$
外显子处突变设计的功能标记
>0?@5+2!
和
ABC4D!对
1"
份不同生态区香稻材料进行了标记检测)结果表明!
&
份材料属于第
)
外显子
突变类型!
%)
份材料属于第
!
外显子突变类型!无第
*
*
$
外显子突变类型材料)该研究构建了针对
!"#$!
突变的
新的分子标记
==$+==1
!并且鉴定了上述香稻材料的突变类型!为优质香稻分子育种奠定基础)
关键词$水稻&香味基因&分子标记
中图分类号$
E)1
文献标志码$
F
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(
)%*+",-"%./01-012%13,"1410
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7
@0@
&
395@8;54T34T[@T
!!
随着当前城乡居民稻米消费水平的提高!高端
优质大米市场开发的经济价值和市场前景日益受到
关注)而香味作为评价优质米的一项重要指标!由
于其在大米储藏和米饭蒸煮过程中散发出怡人香
气!一直受到消费者的青睐!市场上的高档大米也大
多为香米)长期以来!优质香味米品种的选育受到
广泛重视)传统育种过程中鉴别水稻材料是否具有
香味通常采用咀嚼法#(或
Q^I
法!(!这
!
种方法
主要依赖人的感官进行判定)如咀嚼法依靠味觉!
咀嚼样品多时误差较大!而且香味以粒为单位分离!
低世代单株上会出现既有香粒也有非香粒!鉴定结
果难以准确可靠&
Q^I
法除了费时费工!且在鉴定
叶片时易受强烈的叶绿素气味干扰!同样存在准确
性差的问题)另外遗传研究表明!香味为单隐性质
量性状!在杂交分离后代中!纯合香型单株或籽粒一
般只占
!$_
左右"香
`
非香为
#` %
#!按传统检测方
法易使一半含有香味基因的优良杂合个体在选择过
程中被淘汰!不利于优良香型新品种的选育%()因
此!如何准确*快速*简单地对香味进行鉴定一直是
香稻育种中的难题之一)
研究表明!香稻含有多种挥发性化合物!而直接
与水稻香味相关的挥发性物质为
!+
乙酰
+#+
吡咯啉
"
!+48@V
6
5+#+
R6
TT95.0@
!
!Fa
#

*+$
(
)由于甜菜碱醛脱
氢酶基因
!"#$!
功能的缺失会导致
!Fa
前体物质
的增加!从而积累
!Fa
使稻米产生香味&()自
UT4DC;T
6
等首先发现水稻第
1
染色体
!"#$!
基因
第
)
外显子
1C
R
缺失及
%C
R
突变产生无功能蛋白
导致水稻香味以来!该基因序列已经有
#%
处位点的
变异被相继报道)+1()同时根据香味基因序列差异
开发了一系列的分子标记!利用分子标记鉴定香味
基因作为一种快速*准确*有效的手段已经开始应用
于香稻分子育种)
王军等(针对第
!
外显子
)C
R
和第
)
外显子
1
C
R
缺失分别设计了检测香味基因的
>0?@5
标记
>0+
?@5+2!
和
>0?@5+2)
)邵高能等#"(在香稻品种+在妙
香糯,中发现
!"#$!
的等位基因在第
*
和
$
外显子
之间共发生了
1"%C
R
的缺失!并开发了可以检测该
基因型的分子标记
ABC4D)本研究针对
!"#$!
基因第
)
外显子处同时存在
1C
R
缺失及
%
C
R
突变的序列特点利用扩增受阻突变体系
aOX
"
FXBS
!
43
R
5.Y.84V.90T@YT48V9T
6
3;V4V.90/
6
/V@3
#
技术进行等位基因特异扩增!开发了新的功能标记
==$+==1
)
本研究利用前面所述的
!
个分子标记
>0?@5+2!
和
ABC4D!以及本实验开发的分子标记
==$+==1
!对
1"
份来源广泛的香稻资源进行香味
基因检测!旨在明确这些资源的香味基因突变类型!
有助于科学*合理选择香稻资源开展优质香稻分子
育种!大幅提高优质香稻育种效率)
#
!
材料和方法
=,=
!
水稻材料
本研究中
1"
份香稻资源来源于中国不同生态
区以及泰国*越南*日本等地!大致可分为三大类$粳
稻*籼稻和糯稻"表
#
#!同时以非香粳稻品种+秀水
#!%
,为实验对照)所有水稻材料均于
!"#%
年夏季
种植于上海市农业科学院庄行综合试验站!常规水
肥管理)
=,>
!
分子标记
本实验所用
%
个分子标记
>0?@5+2!
*
ABC4D2*+$
和
==$+==1
分别是针对香味基因
!"#$!
在
其第
!
**
$
*
)
外显子等
%
个主要变异区域相关碱基
缺失或突变而设计!其中
>0?@5+2!
和
ABC4D$
分别为王军等和邵高能等所开发!
==$+==1
为本
研究所自主设计)各标记扩增产物大小及其引物序
列见表
!
!引物均由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成)经过预备实验!该
%
个标记均表现反
应体系稳定*实验重复性好*结果清晰可靠)
=?@
!
$A8
提取和
BCD
扩增
利 用
O\FU
法 提 取 水 稻 叶 片 全 基 因 组
?GF

##
(
)
反 应体系
!"
"
L
!包含
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模板
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"
L
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表
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本实验所用水稻材料
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R
@T.3@0V
分类
O54//.Y
6
水稻材料
X.8@34V@T.45
粳稻
Z4
R
90.84T.8@
大华香粳*香粳
###
*广陵香粳*南粳*苏沪香粳*香粳
*
*苏香粳
#
号*武香粳
#*
号*武香粳
#
*武运粳
!#
*银玉
!#
*香粳
"$+)
*太湖香粳*早优
香粳*银香
#1
*银香
!1
*青香粳
!$&
*申香粳
*
号*申香粳
&
号*申香粳
1
号*松香粳*香粳
1%!
*黑香粳*闵恢香粳*秀水
#!%
*香粳
!*"!
*香粳
#"%
*关西香*大粒香*圣香
#*$
*武香
+#$
*武香
%!$
*武香
")$
*
!%&
*曲阜香稻*早香
"+#
*早香繁
!
*
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*
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*
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*
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*
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##+1
籼稻
>0D.84T.8@
粤香占*奇妙香*广东香稻*巨升海香
#
号*香米*龙香禾*泰国香丝米*泰国香米*香丝米*中香
#
号*江西香稻*香籼
!)")
*丰优香*农香
*&
*泸
县香稻*
O
香
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糯稻
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广陵香糯*金陵香糯*香糯
1%%%
*香血糯*香血糯
""
*紫香糯
1&#
*紫香糯
1&%
*珍珠香糯*中香糯*香黑糯
#$
*香紫糯*紫香糯*越南香糯*
##+
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*武进香糯
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7-
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7
M.40
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Z.05.0
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M.40
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西
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北
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物
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卷
表
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本实验所用
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个分子标记详细信息
\4C5@!
!
?@V4.5@D.0Y9T34V.909YVR
@T.3@0V
分子标记
B95@8;54T
34T[@T
突变类型
B;V4V.90V
6R
@
退火温度
F00@45.0
7
V@3
R
@T4V;T@
%
c
片段长度
2M
R
@8V@D
/.P@
%
C
R
引物序列
aT.3@T
/@
]
;@08@
>0?@5+2!
第
!
外显子
)C
R
缺失
)C
R
D@5@V.90.0@M90!
&"
香
AT4
7
T40V
$
#""
非香
G90+YT4
7
40V
$
#")
A
$
KKKFKKOKO\KFFKFKKF
(
X
$
KKK\FK\OFOOFOOO\FOO\\K
ABC4D第
*
*
$
外显子
1"%C
R
缺失
1"%C
R
D@5@V.90C@V:@@0@M90*40D$
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香
AT4
7
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$
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非香
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7
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A
$
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#"
(
X
$
K\\\FKOFOFOO\KFFKKFFKFOOF
==$+==1
第
)
外显子
1C
R
缺失!
%C
R
突变
1C
R
D@5@V.9040D%C
R
3;V4V@.0@M90)
$$
香
AT4
7
T40V
$
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非香
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7
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#
!
**
==$
$
OOKK\KO\OO\\\K\OF\O
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$
\KFFFO\KK\FFFFFKF\\F\KKO
==)
$
KFKOFKO\KFFF\F\F\FOO
==1
$
\\KOF\OO\KO\OK\O\KK
3395
%
LDG\a",*
"
L
!
$3395
%
LB
7
O5
!
#,&
"
L
!
#"dU;YY@T#,&
"
L
!引物等体积混合液
#,&
"
L
!
#
J
%
"
L%"
&
酶
",!
"
L
!加
DDI
!
Q#!,&
"
L
)所用试
剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)
反应程序为
*c
预变性
$3.0
&
*c
变性
%"
/
!
$$c
#
&"c
退火
%"/
!
)!c
复性
%"/
!共
%%
个循
环&
)!c
延伸
#"3.0
!
#"c
保存)
=,E
!
电泳检测
标记
==$+==1
和
ABC4D的扩增产物
在
!_
琼脂糖凝胶上电泳!
K@5X@D
染料染色!利用
凝胶成像系统观察结果&标记
>0?@5+2!
的扩增产物
在
&_
非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳!银染后观察
结果)
!
!
结果与分析
>,=
!
香味基因新功能标记开发
根据
!"#$!
基因的克隆结果!针对第
)
外显子
处
1C
R
缺失和
%C
R
突变!利用软件
aT.3@
R
T@3.@T
$,"
设计该突变类型的功能标记
==$+==1
"图
#
#)
该标记由
*
个序列组成!
aOX
扩增时!外部上
下游序列在香稻基因序列和非香稻基因序列中均可
以在相应位置结合!而内部上游序列只与非香稻或
是非本突变类型香稻基因序列相应位置结合!内部
下游序列只与本突变类型香稻基因序列相应位置结
合)所以扩增产物为
$1%
和
#&C
R
片段时!则该材
料 为该突变类型香稻&产物为
$#
和
**C
R
片段
图
#
!
基因
"#$!
第
)
外显子缺失位置区域序列及分子标记
==$+==1
F,
香稻序列&
U,
非香稻序列
A.
7
,#
!
U4/@/@
]
;@08@/9YD@5@V@DT@
7
.90.0@M90)9Y
7
@0@"#$!40D395@8;54T34T[@T==$+==1
F,AT4
7
T40VT.8@
&
U,G90+YT4
7
T40VT.8@
#)!
!
期
!!!!!!!!!!!!!!!
闫
!
影!等$水稻香味基因分子标记的开发及应用
时!则材料为非香稻或非本突变类型香稻)
以已知属于该突变类型的香稻材料+太湖香粳,
和+紫香糯
1&#
,!非该突变类型香稻材料+大华香
粳,和+南粳
*&
,!以及非香材料+秀水
#!%
,的基因组
?GF
为模板!利用标记
==$+==1
进行
aOX
扩增!
电泳检测结果表明!+太湖香粳,和+紫香糯
1&#
,可
扩增出大小分别为
$1%
和
#&C
R
的
!
个片段!+大
华香粳,*+南粳
*&
,和+秀水
#!%
,扩增出大小分别为
$#
和
**C
R
的
!
个片段"图
!
#!证明标记
==$+
==1
可用于筛选出基因
!"#$!
第
)
外显子
1C
R
缺
失和
%C
R
突变导致香味的水稻材料!而不能区分其
他突变类型香稻材料和非香稻材料)
>,>
!
香稻材料基因型的分子标记检测
>?>?=
!
标记
FFGHFFI
的检测结果
!
分别以
1"
份
香稻材料的基因组
?GF
为模板!利用标记
==$+
==1
进行
aOX
扩增)电泳结果"部分结果如图
%
!
F
#表明!共有+广陵香糯,*+广陵香粳,及+江西香
稻,等
!&
份材料可扩增出大小分别为
$1%
和
#&C
R
的
!
个片段!说明这些香稻材料在
!"#$!
基因第
)
外显子处存在
1C
R
缺失和
%C
R
突变!属于同一种
香味基因变异类型)其余材料均扩增出大小分别为
$#
和
**C
R
的
!
个片段!说明这些香稻材料不属
于第
)
外显子变异类型)
>?>?>
!
标记
7*$%HJ>
检测结果
!
分别以
1"
份香
稻材料的基因组
?GF
为模板!利用标记
>0?@5+2!
进行
aOX
扩增)电泳结果"部分结果如图
%
!
U
#表
明!共有+大华香粳,*+丰优香,及+关西香,等
%)
份
香稻材料可扩增出大小为
#""C
R
的片段!说明这些
香稻材料在
!"#$!
基因第
!
外显子处存在
)C
R
缺
失!属于同一种香味基因变异类型)其余材料均扩
增出一条大小为
#")C
R
的片段!说明这些香稻材料
不属于第
!
外显子变异类型)
>?>?@
!
标记
4-90!K>HJEHG
检测结果
!
分别以
1"
份香稻材料的基因组
?GF
为模板!利用标记
AB+
C4D进行
aOX
扩增)电泳结果"部分结果
图
!
!
==$+==1
对
$
份材料电泳检测图
#
#
$
分别为大华香粳*南粳
*&
*太湖香粳*紫香糯
1&#
和秀水
#!%
A.
7
,!
!
$34V@T.45/:@T@
7
@09V
6R
@D:.V<==$+==134T[@T
#($4T@?4<;4M.40
7-
.0
7
!
G40
-
.0
7
*&
!
\4.<;M.40
7-
.0
7
!
H.M.40
7
0;91(Db.;/<;.#!%
!
T@/
R
@8V.W@5
6
如图
%
!
O
#表明!所有材料均扩增出一条大小为
##!%C
R
的片段!表明这些香稻材料在
!"#$!
基因
第
*
*
$
外显子处不存在缺失!均不属于这种香味基
因变异类型)
%
个标记检测统计结果见表
%
)由表
%
可以看
出!
1"
份香稻材料被分为
!
种香味基因突变类型!
其中
!&
份材料为第
)
外显子突变类型!
%)
份材料
为第
!
外显子突变类型!无第
*
*
$
外显子突变类型
材料)
另外!本实验材料中还有
#)
份香稻均不属于这
%
种突变类型!有可能是已发现的其他突变类型!因
此需要进一步搜集或开发可以鉴别出这些材料的功
能分子标记&也有可能是尚未发现的新香味基因!可
以根据这些材料开展新基因的鉴定*定位及克隆)
%
!
讨
!
论
香味是稻米重要的食味品质性状!香稻资源遍
图
%
!
%
个标记对部分香稻材料电泳检测图
F,#
和
!
分别是香与非香对照材料太湖香粳和秀水
#!%
&编号
为
*
*
)
*
1
*
#"
#
#%
*
!"
的材料是由标记
==$+==1
检测出在
!"#$!
基因第
)
外显子处存在
1C
R
缺失和
%C
R
突变的香稻
材料&
U,#
和
!
分别是香与非香对照材料南粳
*&
和秀水
#!%
&编号
为
%
#
&
*
#"
*
#%
*
#$
*
!#
的材料是由标记
>0?@5+2!
检测出
在
!"#$!
基因第
!
外显子处存在
)C
R
缺失的香稻材料&
O,
利用标记
ABC4D未检测出在
!"#$!
基因第
*
*
$
外显子处存在
1"%C
R
缺失的香稻材料
A.
7
,%
!
S93@T.8@YT4
7
T40V34V@T.45/:@T@
7
@09V
6R
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!
4T@YT4
7
T40VT.8@W4T.@V
6
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40D
090+YT4
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T40VT.8@W4T.@V
6
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L40@/*
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)
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R
D@5@V.9040D%SGa/.0@M90)
D@V@8V@DC
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D@5@V.90.0
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7
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R
D@5@V.90.0@M90*9T$D@V@8V@DC
6
ABC4D!)!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
@
!
IL
份香稻材料分子标记检测结果分类
\4C5@%
!
\<@D@V@8V.90T@/;5V/9Y1"YT4
7
T40VT.8@34V@T.45/:.V<395@8;54T34T[@T/
突变类型
B;V4V.90V
6R
@
水稻材料
X.8@34V@T.45
第
)
外显子
1C
R
缺失!
%C
R
突变
1C
R
D@5@V.9040D%C
R
3;V4V@.0@M90)
广陵香糯*广陵香粳*
#"+#
*武香
+#$
*香粳
#"%
*香血糯*太湖香粳*申香粳
*
号*香血糯
""
*紫香糯
1&#
*紫香糯
1&%
*中香
糯*中香
#
号*粤香占*香黑糯
#$
*香米*
##+!
*巨升海香
#
号*农香
*&
*大粒香*
O
香
$#)
*
##+)
*武香
")$
*香紫糯*紫香糯*江
西香稻
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7
5.0
7
M.40
7
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5.0
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外显子
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R
缺失
)C
R
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大华香粳*丰优香*香粳
###
*
#"+!
*南粳
*&
*苏沪香粳*武香
%!$
*武香粳
#*
号*武香粳
#
*武运粳
!#
*银玉
!#
*香粳
"$+)
*香
糯
1%%%
*
#"+$
*
##+1
*
N$+!
*早优香粳*银香
#1
*银香
!1
*青香粳
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*
!%&
*申香粳
&
号*申香粳
1
号*早香
"+#
*早香繁
!
*松香
粳*珍珠香糯*圣香
#*$
*香粳
!*"!
*香粳
1%!
*
##+$
*
##+&
*金陵香糯*香粳
*
*广东香稻*泰国香米*关西香
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*
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*
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*奇妙香*龙香禾泰国香丝米*香丝米*香籼
!)")
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香粳*越南香糯*武进香糯
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!
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7
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布全球)到目前为止!认为水稻香味主要与第
1
染
色体上编码甜菜碱醛脱氢酶基因
!"#$!
相关#!(!
香味基因
!"#$!
的致香环节是由其第
!
外显子*第
*
*
$
外显子及第
)
外显子相关区域碱基缺失引起
的)已有研究表明!大多数的香稻材料都是由于在
!"#$!
基因第
!
外显子和第
)
外显子处发生碱基缺
失而产生香味#%+#*(!在第
*
*
$
外显子处发生碱基缺
失的香稻材料报道极少!同时也有一些香稻材料在
这
%
个区域都没有发生碱基变异)本研究通过
%
个
香味特异分子标记在分子水平上对
1"
份香稻资源
进行了检测分类!共有
&%
份香稻属于
!"#$!
基因
第
!
外显子和第
)
外显子处发生碱基变异!没有发
现第
*
*
$
外显子处发生碱基缺失的材料!另外也有
#)
份香稻不属于这
%
种基因变异类型)
充分挖掘利用香稻资源!结合分子标记开展香
味基因辅助选择是当前进行优质香稻品种选育的主
要策略!而分子标记检测的简易程度和成本高低是
影响分子育种效率的重要因素#$+#&()已有香稻鉴定
及利用研究#)+#1(主要围绕
!"#$!
基因第
!
外显子
和第
)
外显子碱基变异展开!且大多为设计的
>0D@5
类型标记!多态性片断仅有
)
或
1C
R
碱基差异!必
须借助聚丙烯酰胺凝胶电泳观察结果!操作程序繁
琐不便于大量开展标记检测工作)本研究针对前人
研究的不足!除根据
!"#$!
基因的
%
处碱基变异均
设计了相关分子标记进行香稻资源检测外!更主要
围绕第
)
外显子处碱基变异特点利用扩增受阻突变
体系
aOX
技术开发了
*
引物标记!
aOX
产物多态
性差异显著!借助琼脂糖凝胶电泳即可观察!电泳时
间短!便于进行大量香味材料检测!更有利于提高香
稻分子育种效率)
水稻香味的产生除了香味基因起主导作用外!
还与产地气候*土壤及水等因素密切相关#+!"()水
稻香气的类型及浓淡主要是由香味遗传基因或背景
控制还是受生长环境因子决定!目前研究还没有阐
明)本研究旨在先通过分子标记对香稻资源进行香
味基因分类!今后将利用气相色谱
+
质谱技术!#(对
属于同一香味基因类型的香稻资源进行香味定量测
定!结合对香味基因类型和生长环境因素的控制进
一步开展香味产生的内外在机理研究)
参考文献!

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