全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(5): 528-531(2012)
收稿日期: 2011-06-16; 修回日期: 2012-05-19
基金项目: 河南科技大学博士启动基金项目(200709001215); 河南省科技厅重点科技攻关项目(102102110090)
通讯作者: 康业斌,教授,主要从事植物免疫学研究; Tel: 0379-64270236, E-mail: kangyb999@163. com。
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췍研究简报
牡丹溃疡病—葡萄座腔菌引起的新病害
赵 丹, 康业斌*
(河南科技大学林学院, 洛阳 471003)
Peony canker — a new disease caused by Botryosphaeria dothidea in China
ZHAO Dan, KANG Ye-bin 　 (College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003,
China)
Abstract: A new canker disease of peony was found and investigated in Luoyang, Henan Province. A fun-
gus was isolated from diseased stems with typical symptom, cultured by single spore isolation and tested for
pathogenicity according to Koch’s postulation. The rDNA ITS sequence of the fungus was analyzed for simi-
larity. Its colony on PDA was initially white with irregular margin, then gradually turned to dark brown to cae-
sious color. More pycnidia were produced on thick aerial hyphae, and some ascostroma were latterly formed.
The pathogenicity test showed that the cultured fungus was pathogenic to peony. Based on the morphological
characteristics and rDNA ITS sequence analysis, the fungus was identified as Botryosphaeria dothidea.
Key words: Paeonia suffruticosa; canker disease; Botryosphaeria dothidea
文章编号: 0412-0914(2012)05-0528-04
　 　 洛阳自古便是著名的牡丹之乡,其牡丹栽培始
于隋,鼎盛于唐,宋时甲于天下。 据统计,洛阳共有
牡丹品种 1 000 多个,占全国的 67. 25 % ,已成为
中国乃至世界牡丹的栽培中心之一[1]。
2009 ~ 2010 年,对洛阳地区牡丹病害调查发
现,牡丹多年生枝条上发生溃疡病症状。 发病初期
出现褐色小斑点,逐渐扩展成椭圆形、梭形或不规
则形的紫褐色病斑,中间灰白色,凹陷呈溃疡状,高
湿时病斑边缘形成不规则形水渍状病斑,后期在病
部皮层下形成许多针状小黑点,埋生或半埋生,为
病原菌的分生孢子器或子囊座,严重发生时病斑表
皮开裂,甚至枝条枯死(图 1-a)。 轻度发病的植株
鳞芽抽枝较慢,花蕾较小,开花迟缓,花朵小;重度
发病的植株鳞芽萎缩,不能抽枝或抽枝后不能开
花,甚至萎蔫青枯,造成单株枝条稀疏,整株枯死
(图 1-b)。 本文对具典型症状的枝条进行了病原
菌分离和鉴定,以期明确洛阳牡丹溃疡病的病原种
类。
1　 材料与方法
1. 1　 病原菌的分离、纯化与培养
病害样本于 2010 年 5 月采自河南省洛阳市中
国国花园、国际牡丹园。 调查的 12 个牡丹品种中,
有 10 个品种的植株上有针状小点,其中日月锦、群
英、翁狮子、五大洲、洛阳红等品种的病情较重。 将
采集到的罹病牡丹枝条用自来水冲洗干净,再用
70%酒精擦洗,无菌条件下,无菌水冲洗 3 次后,用
灭菌解剖针将小黑点挑下,转入 PDA培养基上,于
25℃温箱中培养,定期观察其培养特征。
1. 2　 致病性测定
活体植株接种:在盆栽牡丹植株上选取 12 个
　
　 5 期 　 　 赵 丹,等:牡丹溃疡病———葡萄座腔菌引起的新病害
健康的枝条,用 70%的酒精擦洗后用无菌水冲洗 3
次,用灭菌牙签在每个枝条上刺几个小孔;将在培
养基上生长的分生孢子器轻轻敲破,使分生孢子分
散出来,加入无菌水配制浓度 106个 / mL 孢子悬浮
液;用脱脂棉球蘸取孢子悬浮液后包裹在 9 个枝条
的小孔处,另外 3 个用脱脂棉球蘸取无菌水包裹在
枝条上作为对照,用塑料薄膜覆盖整株后,将盆栽
牡丹整株置于 25℃和 12 h / 12 h 光暗条件下恒温
保湿培养。
1. 3　 形态学和分子生物学鉴定
选取采自田间具子实体的典型样本,挑取子实
体制水玻片;选取 PDA 培养基上培养的典型分生
孢子器和子囊座,做石蜡切片。 显微镜下观察其形
态特征,并测量分生孢子器、分生孢子、子囊座、子
囊及子囊孢子的大小。
在 PDA上培养 5 ~ 7 d 后的菌落,采用 CTAB
法提取 DNA,用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA。
利用通用引物 ITS1 和 ITS4 将提取出来的 DNA进
行 PCR扩增(BIOMETRA PCR 仪 德国制造),设
计 25 μL PCR反应体系,反应条件为:94℃预变性
5 min;94℃变性 45 s,54℃退火 45 s,72℃延伸 105
s,共 30 个循环;最后 72℃延伸 10 min。 反应结束
后,4℃保存,扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,以
BST-20M型凝胶成像系统(德国制造)检测并记录
扩增产物在琼脂糖凝胶上的图谱。 将扩增产物送
交上海生工进行序列测定,对 ITS测序结果进行比
较分析。
2　 结果与分析
2. 1　 致病性
在枝条上接种 2 ~ 3 d 后,用牙签刺破的小孔
处变黑(图 1-c),黑斑逐渐扩大,形成水渍状溃疡
病斑,7 ~ 8 d 后枝条上出现黑色小点(图 1-d),湿
度大时,产生灰白色菌丝。 挑取接种后发病枝条上
病部小黑点,在 PDA 上 25℃温箱中培养,重新得
到了病原菌,而对照枝条均无症状,证明该菌对牡
丹植株具有致病性,并产生溃疡病症状。
2. 2　 菌落特征与形态鉴定
在田间发病枝条上,分生孢子器或子囊座自皮
层下顶出,黑色小点状,散生。 分生孢子器黑色,球
形,具孔口,(98. 2 ~ 230. 5) μm × (90. 5 ~ 190. 3)
μm(平均 159. 2 μm ×131. 5 μm)(图 1-e);分生孢
子纺锤形、梭形,单胞,无色,(13. 7 ~ 25. 3) μm ×
(4. 9 ~ 7. 2) μm(平均 20. 0 μm × 5. 9 μm) (图
1-f)。 产孢细胞为全壁芽殖单生式,圆筒形,单胞,
无色,(7. 5 ~ 13. 2) μm × (2. 1 ~ 5. 2) μm(平均
9． 9 μm ×3. 7 μm)。 子囊座黑色,具孔口,(215 ~
340) μm × (189 ~ 275) μm (平均 272. 4 μm ×
230. 2 μm)(图 1-g);子囊棍棒形,略弯曲,双层壁,
成熟时易消解, (58. 6 ~ 193. 5) μm × (12. 6 ~
18． 8) μm (平均 111. 7 μm ×16. 3 μm);子囊孢子
长椭圆形、梭形,单胞,无色,内常含油球,(18. 9 ~
25. 8) μm × (7. 0 ~ 11. 4) μm (平均 22. 5 μm ×
9． 4 μm)(图 1-h)。
在 PDA培养基上,菌落初期呈白色,绒毛状,
边缘不整齐,后期逐渐转为青灰色至黑褐色,近圆
形,气生菌丝茂密,部分气生菌丝纠结形成分生孢
子器;分生孢子器聚生或散生,呈黑色小粒状。 分
生孢子器球形或近球形,褐色,(150 ~ 320) μm ×
(100 ~ 300) μm (平均 238. 8 μm ×204. 6 μm);产
孢细胞着生在器壁内侧周壁,全壁芽生单生式,圆
筒形;分生孢子梗短缺,无色,末端产生分生孢子
(图 1-i);分生孢子纺锤形、梭形,单胞,无色,
(14． 2 ~ 21. 7) μm × (3. 9 ~ 5. 4) μm (平均 18. 5
μm ×4. 7 μm)(图 1-j)。 培养基培养后期,形成子
囊座,产生子囊和子囊孢子;子囊座黑色,孔口不显
著,(135. 4 ~ 350) μm × (115 ~ 310. 7) μm (平均
284. 5 μm ×232. 6 μm);子囊棍棒形,具短柄,双层
壁,(41. 3 ~ 64. 5) μm × (9 ~ 16) μm(平均 52. 6
μm ×12. 4 μm) (图 1-k);子囊孢子长椭圆形,单
胞,无色,(12. 9 ~ 18. 8) μm × (3. 9 ~ 7. 2) μm(平
均 16. 6 μm ×5. 3 μm)(图 1-l)。
根据以上形态特征,将该菌鉴定为葡萄座腔菌
属[Botryosphaeria (Moug. )Ces. et de Not. ] [2 ~ 5]。
2. 3　 ITS序列分析
对病菌 rDNA-ITS 进行 PCR 扩增和序列测定
后,其有效序列长度 421 bp。 在 GenBank 中进行
BLAST 比 对。 结 果 表 明, 该 序 列 与 序 列 号
HQ328038. 1和 HQ384217. 1[B. dothidea (Moug. )
Ces. et de Not. ]的 ITS序列同源性均为 100 % ,表
明洛阳牡丹溃疡病菌为 Botryosphaeria dothidea。
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植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 Symptoms of peony canker disease caused by Botryosphaeria dothidea
(a-c) and morphology of the pathogen (e-l)
a, b: Symptoms on peony stems in field (a: dehiscent epidermis, withered bud and black dots; b: dieback);
c, d: Symptoms on peony stems by wounding inoculation(c: Symptom on third day after inoculation;
d: Symptom on seventh day after inoculation); e-h: Morphological characteristics of Botryosphaeria dothidea
on diseased tissues (e: pycnidium; f: conidiophore; g: ascostroma; h: asci and ascospores);
i, j: Morphological characteristics of anamorphic Botryosphaeria dothidea on PDA ( i: conidiophore; j: conidium);
k, l: Morphological characteristics of teleomorphic Botryosphaeria dothidea on PDA (k: asci; l: ascospores) .
3　 讨论
根据洛阳牡丹溃疡病病原物的培养形态特征、
rDNA ITS序列分析及致病性测定结果,同时参考
国内外文献资料[2 ~ 5],将洛阳牡丹溃疡病的病原菌
鉴定为茶藨子葡萄座腔菌[B. dothidea(Moug. )
Ces. et de Not. ]。 该菌属于子囊菌门(Ascomyco-
ta)中的葡萄座腔菌属(Botryosphaeria Ces. et de
Not. )。 葡萄座腔菌属真菌在我国分布于东北、华
北、西北和江淮等区域,可危害杨树、苹果、桉树等
多种木本植物,引起溃疡病或干腐病,是目前我国
重大生物灾害之一,已受到广泛关注[3]。 但该菌侵
染牡丹引起溃疡病,尚未见报道。
在自然基质上,Botryosphaeria 的无性阶段比
035
　
　 5 期 　 　 赵 丹,等:牡丹溃疡病———葡萄座腔菌引起的新病害
有性阶段更常见。 田间调查时发现在牡丹发病枝
条上同时产生无性和有性阶段,而无性阶段产生的
时间较早。 培养条件下,在 PDA 培养基上同时产
生了无性和有性阶段,表明该菌属于同宗配合。 关
于 Botryosphaeria 的 无 性 型 报 道 较 多, 包 括
Diplodia、Dothiorella、Fusicoccum、 Lasiodiplodia 和
Sphaeropsis等属[4]。 Slippers 等[5]认为 B. dothidea
的无性型为七叶树壳梭孢 ( Fusicoccum aesculi
Corda)。
牡丹溃疡病在洛阳地区发生较普遍,且易与其
他病原菌混合侵染,常导致罹病枝条萎蔫青枯、凋
零枯死,严重影响牡丹花蕾的形成与抽枝开花,从
而降低牡丹的观赏价值。 牡丹为多年生木本植物,
病原菌以菌丝体、分生孢子器或子囊座形态在被侵
染的枝条上越冬,次年越冬分生孢子器内产生的成
熟分生孢子为主要初侵染源。 随着栽培时间的延
长,该病为害逐年加重。 在生产上应注意及时清除
枯枝,适时开展化学药剂防治,将危害控制在最低
水平。
参考文献
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countermeasures of peony ornamental garden in Luo-
yang ( in Chinese) [J] . Chinese Horticulture Abstracts
(中国园艺文摘), 2010, (8): 85 -86.
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[J] . Mycosystema (菌物学报), 2009, 28(3): 332 -
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[3] 　 Chen H Y, Tian C M, Liang J, et al. Studies on tax-
onomy of pathogenic Botryosphaeria and its anamorphs
causing tree canker ( in Chinese ) [ J ] . Journal of
Northwest Forestry University (西北林学院学报),
2006, 21(6): 145 -150.
[4] 　 Yu Z D, Zhao G C, Dan J Y, et al. Phylogeny of
Botryosphaeria species based on ITS-rDNA sequences
( in Chinese) [J] . Mycosystema (菌物学报), 2010,
29(2): 285 -293.
[5] 　 Slippers B, Crous P W, Denman S, et al. Combined
multiple gene genealogies and phenotypic characters
differentiate several species previously identified as
Botryosphaeria dothidea [ J] . Mycologia, 2004, 96:
83 -101.
责任编辑:于金枝
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