全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 445鄄448(2011)
收稿日期: 2010鄄03鄄26; 修回日期: 2011鄄04鄄21
基金项目: 河北省自然科学基金项目(C2006000438); 国家“十一五冶支撑计划(2006BAD08A05)
通讯作者: 杨文香,教授,研究方向为分子植物病理学及植物病害生物防治; Tel: 0312鄄7528585, Fax: 0312鄄7528500, E鄄mail: wenxiang
yang2003@163. com
刘大群,教授,研究方向为分子植物病理学及植物病害生物防治; Tel: 0312鄄7528500, Fax: 0312鄄7528500, E鄄mail: ldq@ he鄄
bau. edu. cn。
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研究简报
小麦抗叶锈病近等基因系 TcLr19 的差异表达分析
陈玉婷1#, 陈云芳1,2#, 李淑凤1, 高士刚1, 闫红飞1, 杨文香1*, 刘大群1*
( 1河北农业大学植物病理系,河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心, 保定 071001; 2苏州出入境检验检疫局, 苏州 215126)
Differential expression of near鄄isogenic line TcLr19 resistant to wheat leaf rust
CHEN Yu鄄ting1, CHEN Yun鄄fang1,2, LI Shu鄄feng1, GAO Shi鄄gang1, YAN Hong鄄fei1, YANG
Wen鄄xiang1, LIU Da鄄qun1 摇 ( 1Department of Plant Pathology, Agricultural University of Hebei, Biological Control Center
of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province, Baoding 071001, 2Suzhou Entry鄄exit Inspection and Quarantine Bureau,
Suzhou 215126)
Abstract: Complementary DNA amplified fragments length polymorphism (cDNA鄄AFLP) analysis was em鄄
ployed to detect the differential expression of genes in TcLr19 and Thatcher inoculated with Puccinia triticina
isolate 05鄄21鄄116盂 (THTS) . A total of 58 from 224 primer pairs displayed polymorphism between TcLr19
and Thatcher. Polymorphic transcript鄄derived fragments(TDFs) between TcLr19 and Thatcher were grouped
into seven types, and five were supposed to correspond to the process of disease鄄resistant. Twelve of these
TDFs were sequenced and nine were homologic with the known function genes by BLASTx analysis. Calmo鄄
dulin鄄binding protein, leucine鄄rich repeat receptor鄄like kinase and serine / threonine kinase protein were supposed
to correspond to signal transduction of plants. Stem rust resistance like protein, stress regulated protein and
PDR鄄type ABC transporter 9 were supposed to correspond to the expression of the Lr19 disease鄄resistant gene.
Key words: wheat leaf rust; TcLr19; cDNA鄄AFLP; differential expression
文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0445鄄04
摇 摇 由小麦叶锈菌(Puccinia triticina)引起的小麦
叶锈病是影响小麦生产的重要病害之一[1],利用
抗病品种是控制小麦叶锈病的主要措施。 研究不
同抗叶锈病基因与小麦叶锈菌互作后基因表达的
特异性,对于探明小麦抗叶锈病机制具有重要作
用,同时为抗病基因的克隆及优秀抗病小麦品种的
选育提供理论依据。 cDNA鄄AFLP 已经成为目前
筛选差异表达基因最有效的方法之一。
摇 摇 小麦抗叶锈病基因 Lr19 来源于长穗偃麦草
(Agropyron elongatum),已定位于小麦 7DL 染色
体上,具有很强的抗叶锈性,在我国有较大的应用
潜力。 本研究从小麦叶锈菌与小麦抗叶锈病近等
基因系 TcLr19 的互作着手,利用 cDNA鄄AFLP 技
术分析小麦抗叶锈病近等基因系 TcLr19 与叶锈菌
互作过程中基因表达情况,从而揭示 TcLr19 的抗
病表达差异,为从基因表达的整体水平研究小麦抗
叶锈病机制奠定基础。
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植物病理学报 41 卷
1摇 材料与方法
1. 1摇 试验材料
小麦抗叶锈病近等基因系 TcLr19、感病对照
Thatcher和小麦叶锈菌种 05鄄21鄄116盂(THTS,对
TcLr19 表现低毒力,对 Thatcher 表现高毒力)皆由
河北农业大学小麦叶锈病研究中心提供。
1. 2摇 试验方法
将 Thatcher和 TcLr19 接菌,同时设不接菌材
料作为对照,于接菌 0、3、6、12、16、20、24、30、36、
48、72、96 h 后,应用 BIOZOL 总 RNA 提取试剂
(BioFlux)提取小麦叶片总 RNA。 按照 M鄄MLV
RTase cDNA Synthesis kit(TaKaRa)操作说明合成
cDNA第一链和第二链。 参照 Chen等[2]的方法完
成 cDNA鄄AFLP 分析。 半定量 RT鄄PCR 以接菌及
不接菌 TcLr19 和 Thatchter 的不同时间点植株叶
片 cDNA为材料,以 Actin 基因作为内标调整模板
浓度,用序列 19鄄5、19鄄9 设计的正向和反向引物分
别对调整后的模板进行 RT鄄PCR 扩增, PCR 产物
用 1. 2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2摇 结果与分析
2. 1摇 TcLr19 的 cDNA鄄AFLP分析
应用 224 对 AFLP 引物对小麦抗叶锈病近等
基因系 TcLr19 和感病对照 Thatcher接菌和不接菌
的样品进行筛选,最终用 19 对引物扩增出 36 条对
TcLr19 具有特异性的条带,并将这 36 条特异性条
带划分为 7 种基因表达类型。 其中 5 种类型(域、
芋、郁、吁、遇型)可能与小麦抗病反应相关,而且
这 5 种特异表达类型又分为 2 个亚型,第一亚型是
小麦抗叶锈病近等基因系与小麦叶锈菌互作时特
异表达(域型)或表达量明显增加(郁、遇型),为诱
导性特异表达类型;第二亚型为组成型特异表达类
型(芋、吁型)。
2. 2摇 片段的序列分析及测定
对 5 种可能与小麦抗病反应相关类型的片段
进行回收测序,最终得到 12 条在 TcLr19 中特异表
达片段。 经 BLASTn 比对, 9 条来自普通小麦,2
条来自大麦。 经 BLASTx 比对,12 条序列所推导
的蛋白质序列在 GenBank 中有 9 条能够找到其所
对应的同源序列,同源性为 38% ~ 86% 。 其中包
括植物信号转导相关的钙结合蛋白( calmodulin鄄
binding protein,CaMBPs)、富含亮氨酸重复序列的
类受体蛋白激酶(putative leucine鄄rich repeat recep鄄
tor鄄like kinase,LRR鄄RLKs)和丝氨酸 /苏氨酸蛋白
激酶(serine / threonine kinase protein,STK);还包括
可能与抗病相关的秆锈抗病类似蛋白( stem rust
resistance like protein)、胁迫相关蛋白( stress regu鄄
lated protein)、氧化还原酶 2OG铁加氧酶家族蛋白
(oxidoreductase 2OG鄄Fe oxygenase family protein)、
葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶家族蛋白 [ glucose鄄
methanol鄄choline ( gmc) oxidoreductase, putative]
和多效耐药调控蛋白类 ABC 转运蛋白 9 ( PDR鄄
type ABC transporter 9)。
2. 3摇 半定量 RT鄄PCR
片段 19鄄5 仅在未接种和接种小麦叶锈菌的
TcLr19 材料所有时间点表达,但其表达量在不同
时间点存在一定的差异,未接种 TcLr19 在处理后
3 h表达量最高,之后表达量下降,在 72、96 h 时表
达量有微量上调。 在接菌 TcLr19 中 0、3、16、30 h
和 72 h时出现较高水平的表达量,其他时间点的
表达量较弱,总体出现表达量反复增强减弱的变化
趋势。 片段 19鄄9 在未接菌和接菌 Thatcher 材料中
出现极微量表达,在未接菌的 TcLr19 中该片段在
6 h 时开始表达,并在后续时间点呈现递增趋势,
到 24 h之后表达量稳定。 在接菌的 TcLr19 材料
中从 0 h开始表达,并且在各个时间点的表达量基
本一致(图 1)。
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摇 4 期 陈玉婷,等:小麦抗叶锈病近等基因系 TcLr19 的差异表达分析
Fig. 1摇 RT鄄PCR detection of two transcript鄄derived fragments 19鄄5 and 19鄄9
3摇 讨论与结论
植物生理反应受复杂的信号转导网络调控,许
多信号转导途径和信号分子参与植物的抗病反应。
由引物组合 P鄄CA / M鄄CGA 扩增得到特异性条带
19鄄15(215 bp)与水稻钙调素结合蛋白( calmodu鄄
lin鄄binding protein)的同源性达 81% 。 Ca2 +信号参
与植物防卫素的合成及抗病相关基因的诱导和过
敏反应[3],钙调素(Calmodulin,CaM)是植物细胞
内 Ca2 +信号的主要受体,参与植物的抗病反应,且
不同的 CaM亚型可能调控不同的抗病途径。 迄今
为止,对小麦抗叶锈病的分子机制和信号转导途径
仍了解甚少,对于 Ca2 + 鄄CaM信号系统是否参与及
如何参与复杂的小麦抗叶锈病反应,国内外尚未见
相关报道。 本研究从小麦叶锈菌鄄TcLr19 非亲和
组合中得到与编码钙调素结合蛋白的基因片段同
源性达 81%的片段,初步推测 Ca2 + 鄄CaM信号系统
可能参与小麦与叶锈菌互作体系中小麦抗叶锈病
的反应,其功能和结构有待进一步研究。
氧化还原酶基因在植物逆境反应中起重要作
用。 引物组合 P鄄GG / M鄄CGG、P鄄CC / M鄄CCG 扩增
得到特异性条带 19鄄6、19鄄12 分别与葡萄糖甲醇胆
碱氧化还原酶家族蛋白、氧化还原酶鄄2OG 铁加氧
酶家族蛋白有一定的同源性,初步推测这两种氧化
还原酶在生物胁迫中有一定的敏感性。
ABC(ATP鄄Binding Cassette)转运蛋白是目前
已知最大、功能最广泛的蛋白家族,大多数 ABC转
运蛋白都能利用水解 ATP释放的能量直接转运底
物,植物 ABC转运蛋白在植物生长素的极性转运、
脂质的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和气孔的
功能调节等一系列过程中都发挥作用。 Krattinger
等[4]研究发现假定 ABC 转运蛋白基因可导致
Lr34 对叶锈菌表现持久抗病性,Shang等[5]从小麦
赤霉病发病过程中起重要作用的一种毒性因子脱
氧血腐镰刀菌烯醇(DON)诱导的小麦望水白穗组
织 cDNA中克隆出 PDR 型转运蛋白基因,半定量
RT鄄PCR表明该蛋白在望水白穗中受 DON 和禾谷
镰刀菌诱导表达,表明其参与了植物抗病防御反
应。 本研究中分离得到片段 19鄄12 (261 bp)是
TcLr19 接种叶锈菌后诱导表达的片段,经比较后
与水稻的多效耐药调控蛋白类 ABC 转运蛋白
(PDR鄄type ABC transporter 9)同源性达 84% ,说明
该基因参与小麦与叶锈菌的互作过程。
本研究通过 cDNA鄄AFLP 技术,得到了 36 条
叶锈菌侵染小麦抗、感病品种差异表达片段,对其
中 12 条特异表达的片段测序并且进行了 BLASTx
分析,推测钙结合蛋白、富含亮氨酸重复序列的类
受体蛋白激酶和丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶与植物信
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植物病理学报 41 卷
号转导相关,秆锈抗病类似蛋白、胁迫相关蛋白、氧
化还原酶、2OG铁加氧酶家族蛋白、葡萄糖甲醇胆
碱氧化还原酶家族蛋白、多效耐药调控蛋白类
ABC转运蛋白 9 可能参与 Lr19 抗病或防御过程。
参考文献
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责任编辑:
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