全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 551鄄555(2011)
收稿日期: 2010鄄12鄄08; 修回日期: 2011鄄07鄄20
基金项目: 国家梨产业技术体系(nycytx鄄29鄄08); 国家农业行业公益性项目(200903004鄄05)农业行业专项计划(Grant No: nyhyzx 07鄄
023)资助
通讯作者: 洪 霓,教授,主要从事植物病毒研究; E鄄mail: whni@mail. hzau. edu. cn;
王国平,教授,主要从事植物病毒研究; E鄄mail: gpwang@mail. hzau. edu. cn。
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研究简报
来源于新疆的 3 个苹果褪绿叶斑病毒
分离物的分子变异研究
黄妍妍1,2, 王利平1, 洪 霓1*, 韦向东3, 王国平1*
( 1 湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室,华中农业大学植物科技学院, 武汉 430070;
2 塔里木大学植物科学学院, 新疆 阿拉尔 843300; 3 农六师 103 团农业科研所, 新疆 五家渠 831304)
Molecular diversity of three Apple chlorotic leaf spot virus isolates from XinJiang
HUANG Yan鄄yan1,2, WANG Li鄄ping1, HONG Ni1, WEI Xiang鄄dong3, WANG Guo鄄ping1 摇 ( 1Key Lab of
Crop Disease Monitoring and Safety Control in Hubei, College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural Univer鄄
sity, Wuhan 430070,China; 2College of Plant Science and Technology, Tarim University, Alar XinJiang 843300, China;
3Agricultural Division of 103 Regiment, Agricultural Six Division ,Wujiaqu Xinjiang 831304, China )
Abstract: Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) isolates from Korla pear (KI鄄2), New pear no. 7 (XI鄄
1) and Red Fuji apple (API鄄4) were collected from XinJiang and characterized by analyzing sequences of
their near genomic 3忆鄄terminal. The RT鄄PCR products were cloned, and analyzed by single鄄strand conforma鄄
tion polymorphism (SSCP) . Eight out of 39 collected positive clones showing different SSCP patterns were
sequenced. The results showed that the amplified products had sizes ranging 676 - 703 bp, including partial
coat protein (CP) gene (506 bp, accounts for 87% of the complete cp gene) and 3忆鄄terminal non鄄coding re鄄
gion (3忆 NCR) sequences. The cp gene sequences from isolate KI鄄2 showed a high intra鄄isolate divergence,
with 84. 8% -85. 4% identities at the nucleotide (nt) level, and the intra鄄isolate identities were 99. 8 % and
92郾 5% -99. 8 % for isolate XI鄄1 and API鄄4, respectively. Phylogenetic analysis on the nt sequences of cp
gene showed that the analyzed ACLSV variants from three isolates fell into two different clusters. A variant
KI鄄2鄄6 from KI鄄2 was clustered into a group with an apple isolate aclsv鄄c from China and a plum isolated from
France, and all other variants fell into a large cluster. The 3忆 NCR sequences of these variants were identical
ranging 80. 6% -100 % .
Key words: Apple chlorotic leaf spot virus; SSCP; cp gene
文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0551鄄05
摇 摇 苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot
virus,ACLSV)可侵染多种仁果类和核果类果树,
广泛分布于世界各个果产区。 该病毒侵染苹果树
一般不产生明显症状,但可与其他病毒复合侵染引
起树体衰退。 梨树感染该病毒后,在某些敏感的植
株上产生褪绿斑或环纹花叶症状。 该病毒还可引
起核果类果树果实环斑或叶片褪绿斑及裂皮等病
害症状[1]。 ACLSV为纤毛病毒科(Flexiviridae)发
摇
植物病理学报 41 卷
状病毒属(Trichovirus)代表种[2]。 已有研究结果
表明,不同来源的 ACLSV 分离物间存在高度的分
子变异,cp基因序列变异存在株系与血清型特异
性[3],而影响血清学检测效果。 因此,明确不同来
源 ACLSV cp基因的分子特点,可为该病毒株系鉴
定及建立有效的检测技术提供依据。
新疆具有独特的地域环境和丰富的独具地方
特色的果树资源,库尔勒香梨为新疆独有的梨资
源,虽然目前已有少量关于库尔勒香梨 ACLSV 检
测及部分分子信息的报道[4],但有关其他新疆梨
来源的 ACLSV 分子特性研究尚很缺乏。 本研究
对新疆主栽的 2 个梨及 1 个苹果品种的 ACLSV
基因组 3忆末端序列进行了分析,以期为深入研究
该病毒的分子特性及其地域或寄主特点提供有用
的信息
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
1. 1. 1摇 毒源材料摇 分别从新疆阿拉尔市塔里木大
学杂种圃、农一师农科所果园及农一师 10 团果园
采集库尔勒香梨、新梨 7 号和红富士苹果的一年生
休眠枝条,于 4益保存。
1. 1. 2 摇 引物 摇 引物 P1 / P 5忆鄄TTCATGGAAAGA鄄
CAGGGGCAA鄄3忆 / 5忆鄄AAGTCTACAGGCTATTTAT鄄
TATAAGTCTAA鄄3忆由上海生工生物技术有限公司
合成,用于 ACLSV 的 cp 及基因组近 3忆端非翻译
区的扩增。
1. 2摇 研究方法
1. 2. 1摇 总 RNA提取摇 取待检材料休眠枝条催生
出的嫩叶 0. 5 ~ 1 g,加液氮研磨成粉状,快速转入
1. 5 mL离心管中,后加入 800 滋L 经 65益水浴预
热的 CTAB 提取缓冲液(2% CTAB、100 mmol / L
Tris鄄HCl、pH 8. 0、20 mmol / L EDTA、1. 4 mol / L
NaCl、0. 2% 茁鄄巯基乙醇)的离心管中,剧烈混匀,
于 65益水浴 30 min后离心,上清液经氯仿 /异戊醇
(24 / 1)抽提 2 次后,加入 2 / 3 体积的异丙醇沉淀
核酸;沉淀物经 75%乙醇洗涤 2 次,风干后溶于 30
滋L DEPC处理水, -70益保存。
1. 2. 2 摇 RT鄄PCR摇 以提取的总 RNA 为模板,合成
cDNA第一链,反应体系为 20 滋L ,含 5 伊反转录缓
冲液 4 滋L、 dNTPs 1 滋L (100 mmol / L)、 Rnasin
(40 U / 滋L) 0郾 5 滋L、M鄄MLV (200 U / 滋L) 0. 5 滋L、
互补引物(10 pmol / 滋L)1 滋L、RNA 模板 3 滋L 和
DEPC处理水 10 滋L。 PCR反应总体系为 25 滋L,含
10 伊缓冲液2. 5 滋L、 dNTPs (100 mmol / L) 0. 2 滋L、
Taq DNA聚合酶(5 U / 滋L) 0. 2 滋L、引物 P1 和 P2
各 0郾 5 滋L、cDNA 2. 5 滋L 和灭菌的去离子水 18. 6
滋L。 扩增条件为 95 益 5 min,94 益 30 s, 60 益
45 s,72 益 1 min,40个循环; 72 益 10 min。
1. 2. 3 摇 扩增产物克隆及 PCR鄄SSCP摇 RT鄄PCR 扩
增产物经 1. 2%琼脂糖凝胶电泳,切取含目标产物
的凝胶,按试剂盒说明回收目标 DNA,与载体
PMD18鄄T连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)
DH5琢菌株感受态细胞,涂布在含 50 mg / L Amp
的 LB固体培养基上,于 37益培养过夜。 随机挑取
一定数量的白色单菌落进行 PCR鄄SSCP分析,即采
用以上引物对选取的克隆进行 PCR 扩增,然后取
1 滋L PCR 产物与 2 滋L 变性液 (95% 甲酰胺 +
0郾 5%溴酚蓝)混匀后,在沸水中变性 10 min,迅速
冰浴 5 min,在 8%的 PAGE(丙烯酰胺 颐甲叉丙烯
酰胺为 49颐 1)凝胶上(4益,180 V)电泳 14 h, 1%
硝酸银染色后,观察 SSCP带型。
1. 2. 4摇 测序与序列分析摇 将表现不同 SSCP 带型
的阳性克隆送由南京金斯瑞生物科技有限公司进
行双向测序。 序列比对用 Clustalx(1. 81)、DNA鄄
MAN(5. 2. 2)和 GeneDoc 等生物学软件完成,系
统发育树构建采用 MEGA4. 0 软件的 Neigbour鄄
Joining法进行。
2摇 结果与分析
2. 1摇 ACLSV RT鄄PCR 检测及扩增产物克隆
以提取的总 RNA为模板,经 RT鄄PCR分析,从
样品库尔勒香梨(KI鄄2)、新梨 7 号(XI鄄1) 和红富
士苹果(API鄄4)中扩增得到大小约为 680 bp 的特
异带。 RT鄄PCR扩增产物与载体连接后转化大肠
杆菌 DH5琢,经 PCR鉴定,获得来自这 3 个样品的
ACLSV 扩增片段阳性克隆各 12、14 和 10 个。
2. 2摇 ACLSV克隆片段的 SSCP分析
用以上引物对所选取阳性克隆的目标片段进
行 PCR扩增,扩增产物 SSCP 分析的结果显示,来
自 3 个寄主的 ACLSV 克隆片段共表现 8 种不同
的 SSCP带型(图 1),其中来自 API鄄4 和 KI鄄2 的 12
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摇 5 期 摇 摇 黄妍妍,等:来源于新疆的 3 个苹果褪绿叶斑病毒分离物的分子变异研究
Fig. 1摇 SSCP patterns of cloned target fragments from three ACLSV isolates
和 14 个克隆片段分别表现 3 种带型,优势 SSCP
单体型均占 50% ;来自样品 XI鄄1 的 11 个克隆片段
产生 2 种带型,其中 10 个克隆表现相同的 SSCP
单体型,占 90. 9 % 。
2. 3摇 cp基因序列特点
选取表现不同 SSCP带型的克隆进行测序,结
果显示克隆片段的大小存在一定差异,为 676 -
703 bp,包含 cp基因 3忆端的 506 bp(占完整 cp 基
因 582 bp的 87% )和基因组 3忆端非翻译区。 cp 基
因核苷酸序列(nt)比对分析结果表明,来自库尔勒
香梨分离物 KI鄄2 的 3 个分子变种(KI鄄2鄄6、KI鄄2鄄17
和 KI鄄2鄄23 ) 存在较大的分子变异,相似性为
84郾 8% ~ 85. 4% ,与已报道的来源于库尔勒香梨分
离物“kuerle冶的 cp基因同源性为 91. 6% ~ 100 % ;
来自新梨分离物 XI鄄1 的 2 个分子变种(XI鄄1鄄3 和
XI鄄1鄄17)间及来自红富士苹果分离物 API鄄4 的 3
个分子变种间的相似性相对较高,分别为 99. 8 %
和 92. 5% ~ 99. 8 % 。 编码区推导编码 167 个氨基
酸(aa),氨基酸序列相似性为 91. 6% ~ 100 % 。 其
中 KI鄄2鄄6 与我国已报道的苹果分离物 aclsv鄄c 的
cp 基因同源性很高,为 99. 6 % ( nt)和 100 %
(aa); 8 个分子变种与我国桃上分离物 hbp、波兰
李分离物 sx / 2 及法国李上的分离物 P863 的相似
性相对较低,分别为 82. 1% ~ 86. 9 % ( nt)和
90郾 4% ~ 96. 4 % ( aa);与匈牙利樱桃上的分离物
同源性最低,为 81. 2% ~ 82. 7 % ( nt)和 88% ~
89. 2 % (aa)。 对 cp 基因核苷酸推导编码的氨基
酸进行多重匹配分析,分子变种 KI鄄2鄄17、XI鄄1鄄3 和
XI鄄1鄄17 存在 13 个位点的相同变异(图 2)。
对所获 cp基因核苷酸序列及已报道的 ACLSV
部分分离物相同片段序列进行系统发育分析,以分
离物 a鄄ball为外组群,结果显示这些分子变种分别
聚在两大组群,来自库尔勒香梨的 KI鄄2鄄6 与来自我
国的苹果分离物 aclsv鄄c 及法国的李子分离物 P863
聚为一组,其他 7 个分子变种与其他分离物位于另
一分支 (图 3)。
2. 4摇 3忆端非翻译区的序列特点
对所测定的 8 个分子变种 3忆端非翻译区核苷
酸序列匹配分析的结果显示,除来自新梨 7 号的
ACLSV分离物 XI鄄1 的 2 个分子变种高度相似
(99. 5% )外,来自库尔勒香梨和红富士苹果的 2
个分离物内存在较高的分子变异,相似性分别为
80. 6% ~ 82. 8%和 80. 9% ~ 100% 。 分子变种间
除核苷酸序列差异外,还存在多个位点的核苷酸缺
失突变。
3摇 讨论
国外对来自苹果和西洋梨的 ACLSV 分离物
的分子特性研究较多[3],我国近些年也开展了不
同来源梨的病毒检测及分子特性的比较研究[4, 5]。
新疆梨具独特的地理起源和地域分布,本研究对来
自新疆部分地区的库尔勒香梨、新梨 7 号和红富士
苹果的 ACLSV部分分子特性研究的结果显示,不
同寄主来源的 ACLSV 分离物均存在一定的分子
变异,所分析的目标片段表现出 8 种 SSCP 带型。
不同分离物内的分子变异程度也不相同,其中库尔
勒香梨分离物 KI鄄2 出现高度的变异,分子变种间
相似性仅为 84. 8% ~ 85. 4% ,在所构建的 cp 基因
系统发育树中,KI鄄2 的 3 个分子变种分别聚在不
同分支或亚分支。 但 3 个分离物的多数分子变种
具有高度的相似性,聚为同一亚分支。 这些结果表
明,ACLSV存在优势分子变种,且这些变种与已报
道的其他 ACLSV 分离物存在一定分子差异。 而
其他非优势分子变种则与来自日本和我国的苹果
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摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 2摇 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of eight cp gene
sequences from three ACLSV isolates
Fig. 3摇 Phylogenetic analysis based on cp nucleotide sequences of ACLSV
The molecular variants obtained in this study are marked with a shadow. The GenBank accession numbers, hosts and source
countries of reference isolates are P205 (D14996, Apple, Japan), P863 (NC鄄001409, Plum, France), PBM1 (AJ243438,
Plum, German), a鄄ball (X99752, Cherry, Hungary), kuerle (AY669389, Pear, China), hbp (AY728180, Peach, China),
aclsv鄄c (EF079060, Apple, China) and sx / 2 (AF251275, Plum, Poland) .
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摇 5 期 摇 摇 黄妍妍,等:来源于新疆的 3 个苹果褪绿叶斑病毒分离物的分子变异研究
分离物较近,可能与该病毒再感染有关,目前尚未
发现该病毒的自然传播介体,寄主植物繁殖过程中
的嫁接操作是该病毒传播和重复感染的主要途径。
本研究所测定的分离物数量较少,要确定在新疆梨
和苹果上检测到的 ACLSV 优势分子变种是否存
在地域起源特异性还需进一步对大量样品的分析。
参考文献
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责任编辑:
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