全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""*"!(
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#
"%*#&(*"(
收稿日期$
!"#$*"+*"(
%修改稿收到日期$
!"#$*"&*$"
基金项目$河北省自然科学基金"
,!"##"("!!
#%国家自然科学基金"
$##"##((
#%&十二五农村领域国家科技计划项目"
!"##-./"+-"#
#
作者简介$袁进成"
#%&")
#!男!副教授!主要从事植物种质资源方面的研究(
0*1234
$
567
89
:
!
#+$;:<1
"
通信作者$刘颖慧!教授!主要从事分子生物学研究(
0*1234
$
4==4
8
(#%
!
#!+;:<1
玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和特性研究
袁进成!马海莲!宋晋辉!宋小青!刘颖慧"
"河北北方学院!河北张家口
"&("""
#
摘
!
要$通过电子克隆方法得到玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因!命名为
!"#$%&#
(结果显示!
!"#$%&#
基因
全长
&!$>
?
!开放阅读框
+!>
?
!编码
!#
个氨基酸(
!"#$%&#
基因与高粱)水稻及小麦等植物的脱氢抗坏血酸
还原酶基因高度相似!其中与高粱的
#$%&
基因相似性为
@(A
!与水稻的
#$%&#
基因相似性为
@$A
(基因表
达分析显示!
"#$%&#
基因在根以外的其他部位都可以检测到表达!而且
!"#$%&#
基因可以在
B
低温)
#""
"
1<4
*
C.-.
)
#""11<4
*
CD0E
)
!("11<4
*
CF2,4
和机械损伤等多种逆境胁迫下均可应答表达(研究表明!
!"#$%&#
基因可能在玉米抗逆境胁迫反应中发挥重要的作用(
关键词$玉米%
#$%&
基因%诱导表达%逆境胁迫
中图分类号$
G&@%
文献标志码$
.
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0
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478
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L
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M.N234325
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OPFEJ35KQ3
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OPFER32<
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35
L
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CTIH35
L
KQ3
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N=>=3F8
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YK25
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N=>=3"&("""
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ZU<2X:2V=U=ZQ:V2X=
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42
8
X2:UQ:324U<4=351235V23535
L
2X:3:2:3Z
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L
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L
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#$%&=5:?
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L
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S
Q=5:= 3^VK
XL
KQ1
!
U3:=25Z K^=2VXK<^ =Z2X3
L
53]3:25V:<5X=UW2V3<525ZK3
L
KX31342U 3^VKVK=VKU==X
?
=:3=X
!
XQ:K2X
@(A3Z=5V3]3=Z 3^VKXL
KQ1#$%&25Z@$A3Z=5V3]3=Z 3^VKU3:=#$%&#
L
=5=;DK
8
4<
L
=5=V3:2524
8
X3X35*
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U!
XL
KQ1
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K^=2V25ZU3:=
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U?
U=X*
X3<5
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2VV=U5U=W=24=Z:<5XV3VQV3W==7
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U=XX3<525Z2>3L
4
8
35ZQ:=Z>
8
:<4Z
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C
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D0E
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F2,4
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C
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25Z <^Q5ZXVU=XX;.4V<
L
=VK=UVK=U=XQ4VX35
VK3X <^U6Z=1<5XVU2V=ZVK2VVK=#$%& 12
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42
8
2531
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3<4<
L
3:24U<4=35
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425VXQ5Z=U2>3XVU=XX;
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0
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$
123_=
%
#$%&
L
=5=
%
35ZQ:V3<5=7
?
U=XX3<5
%
2>3!!
抗坏血酸"
2X:3:2:3Z
!
.X.
#即维生素
,
"
3`*
V2135,
#!是在植物中丰富存在的小分子抗氧化物
质!是植物自身代谢必不可少的物质!在植物的抗氧
化反应)光合作用中发挥重要的作用(
.X.
还参与
植物细胞分裂)生长发育)细胞分化等多种生命过
程+#,!在植物的整个生长发育期均起着重要的作用(
同时抗坏血酸还作为某些重要酶类的辅因子在植物
的酶促反应中发挥作用!最近新的研究发现
.X.
也
可以作为信号因子在信号传递中发挥重要作用(
作为植物体内重要的还原剂之一!
.X.
的再生
体系在植物应答逆境胁迫反应中起到非常重要的作
用!
.X.
的再生不仅参与清除光合)呼吸过程中产
生的活性氧"
[PO
#!同时还参与维生素
0
的再生合
成!并作为多种酶的辅酶发挥作用+!,(在逆境条件
下!尤其是
[PO
产生时!
.X.
被氧化为脱氢抗坏血
酸"
Z=K
8
ZU<2X:2V=
!
/N.
#!
/N.
在脱氢抗坏血
酸还原酶"
/N.U=ZQ:V2X=
!
/N.[
#的催化下以谷
胱甘肽"
EON
#为底物!催化脱氢抗坏血酸还原为
.X.
!
/N.[
在循环利用
.X.
)保护细胞组分)抵御
氧化损伤中发挥重要作用+$,(因此!
/N.[
在植物
适应逆境条件下维持
.X.
的动态平衡非常重要+,(
.X.
作为植物体内重要的还原剂之一!不仅参
与清除植物光合)呼吸作用产生的活性氧!还参与维
生素
0
的再生并作为多个酶的辅酶发挥作用(对
其合成)转化和利用!可以为人类提供丰富而方便的
维生素
,
源!因此受到越来越多的重视(
/N.[
在
维持植物内源
.X.
的动态平衡起着非常重要的作
用!所以对其功能和作用机制的研究报导很多+(*+,(
本研究在玉米中获得了
#$%&
基因!并对其基因
特性和表达特征进行了初步研究!对了解其作用机
制及在抗氧化胁迫中的作用进行了探索(
#
!
材料和方法
<8<
!
1256!7<
基因的获得
前期!本课题组开展玉米抗旱机制研究!通过生
物信息学分析发现
E=5>256
中的一段序列"
E=5*
-256
$
-\"$$!((;#
#和其他作物的
#$%&
基因高
度同源!将该序列在
F,-T
"
KVV
?
$**
^^ ^;5:>3;
541;53K;
L
*#和
M.TY0E/-
"
KVV
?
$**
^^ ^;
123_=
L
Z>;L
*#以及
M.TY0O0GI0F,0
"
KVV
?
$**
^^ ^;123_=X=
S
Q=5:=;L
*#数据库中进行同源查
询!得到一个全长的
:/F.
!根据该序列设计引物进
行扩增"正向$
(a*EE..,,.E..E,\..,,EE,*
$a
%反向$
(a*EE.E\,,.,,.E\\.E,.,,.*$a
#!
扩增反应条件为
%B
预变性
(135
!
%B$"X
!
(+
B$"X
!
&!B%"X
!
$(
个循环!
&!B
延伸
(135
(最
终从玉米中获得了
!"#$%&
基因(
<;=
!
植物材料与处理
玉米播种于试验田中!分别取大田生长
#"Z
玉
米的叶片及幼根!以及花期玉米的幼穗和授粉
!"Z
后的籽粒!供提取不同组织
[F.
(同时剪取幼叶叶
片提取基因组
/F.
(用于胁迫处理的玉米播种于
营养土蛭石
#b$
配置的基质中!种植在人工培养箱
中!生长
#"Z
的幼苗分别进行
B
)
#""
"
1<4
*
C
.-.
)
#""11<4
*
CD0E
)
!("11<4
*
CF2,4
和机械
损伤的胁迫处理!分别处理
"
)
#
)
$
)
+
)
#!
)
!
和
"K
!
取处理后的幼苗经液氮冷冻后超低温保存!供提取
[F.
(
<8>
!
1256!7<
基因的表达分析
取不同材料及不同处理总
[F.
进行基因表达
分析(利用
M*MC`
"
T5W3VU<
L
=5
#反转录合成第一
链
:/F.
(取
#
"
L
总
[F.
按说明书操作!将反转
录产物稀释
"
)
(
)
#"
倍不同的梯度!摸索较好的模板
上样浓度!进行半定量
D,[
分析(
D,[
反应条件
为$
%B$135
!
%B$"X
!
(@B$"X
!
&!B$"X
!
!@
个循环!最后
&!B
延伸
(135
(
[=24*V31=D,[
技术研究基因的诱导表达特性!根据
OH-[EU==5
S
D,[OQ
?
=UM37
"
T5W3VU<
L
=5
#试剂盒的操作进行实
时定量
D,[
!
D,[
的条件为$
%(B(135
!
%B$"
X
!
(@B$"X
!
&!B$"X
!
(
个循环!最后
&!B
延伸
(135
(同时对玉米看家基因
%()*
进行平行
D,[
反应作为内参(扩增
%()*
基因引物
%+
()**c
"
E,.\,.,.,,\\,\.,..,E.
#和
%+
()**[
"
,.E,,\EE.\.E,..,.\.,.#(扩
增
!"#$%&
基因的引物
!"#$%&
正义"
E\\,*
,,..,\,,\\,\,\EE#和
!"#$%&
反义"
\E*
,\,,\,EE.\EE,\\.E#(
<;?
!
生物信息学分析
利用
F,-T
以及
M23_=X=
S
Q=5:=
数据库分析对
基 因 进 行 比 对 分 析%利 用
,4QXV247
"
KVV
?
$**
X<]V#XVQZ2#:<1
*
Z<^ 535]<
*
%($+#KV14
#软件对来源
于不同植物基因进行序列比对和聚类分析(用
0R*
D.OH
对蛋白结构和功能进行预测"
^^ ^;=7
?
2X
8
;
L
#(
!
!
结果与分析
=8<
!
1256!7<
基因的克隆及序列分析
本课题组前期开展干旱条件下玉米抗旱基因的
克隆和功能研究!通过
F,-T
及玉米基因组数据库
查询!得到一个全长的
:/F.
"
E=5-256
登录号为
-\"$$!((;#
#!该序列和水稻及小麦等植物的脱氢
抗坏血酸还原酶"
/N.[#
#高度相似!命名为
!"+
#$%&#
基因(
!"#$%&#
基因全长
&!$>
?
!开放
阅读框
+!>
?
!编码
!#
个氨基酸!理论等电点
?
T
(;#(
"图
#
#(
将获得基因编码蛋白序列在
F,-T
数据库中比
+&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
对发现!其与高粱的
#$%&
基因编码蛋白序列"登录
号为
RM
-
""!"$&
#相似性为
@(A
!和水稻的
#$%&#
编码蛋白序列"登录号为
.-"$&%&"
#相似性
为
@$A
(聚类分析结果表明
!"#$%&#
基因编码蛋
白序列和高粱的
#$%&
基因编码蛋白序列聚在一起(
和其他植物!如水稻
/N.[#
蛋白序列"
.-"$&%&"
#!大
麦的
/N.[
蛋白序列"
.d$(%!!
#!小麦的
/N.[
"
EG%""%
#!二穗短柄草的
/N.[!
蛋白"
RM
-
""$(+@%++
#以及高粱的
/N.[
蛋白"
RM
-
""!"$+
#
的相似性都很高"图
!
)
$
#(通过分析基因的亲水性
以及二级结构表明!玉米的
!"#$%&#
基因和其他
作物的基因在蛋白特性和结构上都是高度一致的!
即具有相同的疏水结构和相同的蛋白二级结构域
"结果未列#!这也表示该基因是一个保守性很强的
基因!这可能和其功能作用密切相关(
=8=
!
1256!7<
基因在玉米中的表达情况
分别取大田出苗后生长
#"Z
玉米的叶子)茎和
图
#
!
!"#$%&#
基因电泳图
M;#"">
?
/F.42ZZ=U
%
#;!"#$%&#
基因产物%
!;
阴性对照
c3
L
;#
!
\K=D,[
?
UL
=5=
M;#"">
?
/F.42ZZ=U
%
#;D,[
?
U!"#$%&#
%
!;F=
L
2V3W=:<5VU<4
图
!
!
玉米
Y1/N.[#
和其他作物
/N.[
蛋白序列的比对分析
选用的蛋白序列分别为水稻
/N.[#
"
.-"$&%&"
#)大麦
/N.[
"
.d$(%!!
#)小麦
/N.[
"
EG%""%
#)
二穗短柄草
/N.[!
"
RM
-
""$(+@%++
#)高粱
/N.[
"
RM
-
""!"$+
#和高粱
/N.[
类似蛋白"
RM
-
""!"$&
#%图
$
同
c3
L
;!
!
,<1
?
2U3X<5<]VK=Z=ZQ:V=Z2135<2:3ZX=
S
Q=5:=X<]Y1/N.[#
?
U?
425VX
.135<2:3Z1Q4V3
?
4=243
L
51=5V<]Y1/N.[# 3^VKK<1<4<
L
X]U<1?
425VX
$
,-
.
/0102340/N.[#
"
.-"$&%&"
#!
$5-678"102348" /N.[
"
.d$(%!!
#!
(-32398"0712348" /N.[
"
EG%""%
#!
:-09;
.<
5638"/N.[!
"
RM
-
""$(+@%++
#
25ZV^ <=5-
>
;8"?395@5-/N.[
?
U"
RM
-
""!"$+
!
RM
-
""!"$&
#%
\K=X21=2Xc3
L
;$
&&#
%
期
!!!!!!!!!!!!
袁进成!等$玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和特性研究
幼根!及花期玉米的幼穗以及授粉
!"Z
后的籽粒!
提取不同组织的
[F.
!检测基因的表达情况(图

可见!
"#$%&#
基因在植物根除外的其他部位都
可以检测到表达!该基因的表达量在叶片中是最高
的!通过定量分析!叶片中的表达量是茎的
$
倍!是
幼穗的
(
倍!是籽粒的
!
倍多(基因的表达结果表
明该基因在玉米的发育中有重要的作用!需要进一
步研究(
=8>
!
1256!7<
基因受多种逆境因子诱导表达
在不同胁迫处理中!可以看出玉米在处理
#
#
图
$
!
玉米
Y1/N.[#
和其他作物蛋白的进化树分析
分支上的数值表示每单位长度位点替代率
c3
L
;$
!
DK
8
4<
L
=5=V3:VU==]3^VK?
425V
?
U\K=X:24=>2U35Z3:2V=XVK=5Q1>=U<]
XQ>XV3VQV3<5X
?
=UX3V=]U25:K4=5
L
VK
图

!
!"#$%&#
的表达模式
c3
L
;
!
,K2U2:V=U3_2V3<5<]!"#$%&#
=7
?
U=XX3<535Z3]]=U=5VV3XXQ=X
图
(
!
!"#$%&#
不同胁迫诱导表达情况
c3
L
;(
!
07
?
U=XX3<5
?
U<]34=X<]!"#$%&#
2524
8
_=Z>
8
U=24*V31=D,[
"K
之间
!"#$%&#
出现了上调表达"图
(
#(其
中诱导表达最强烈的是
.-.
处理!当处理到
+K
时!表达量达到最高!为对照的
!
#
$
倍!
.-.
处理
#!K
表达量显著降低!到
"K
表达量接近于对照(
从图
+
可见干旱对基因的表达量影响较小!在
D0E
处理
#!K
表达量达到最高!为对照的
#;(
倍(冷)
盐以及机械损伤都可以诱导基因的表达!而且在处
理的早期达到最高的表达量!如冷处理
$K
基因表
达量达到最高!为对照的
$
倍!盐处理
+K
基因表达
量达到对照的
!;$
倍!当机械处理
+K
时!基因的表
达量为对照的近
$
倍(从基因的诱导表达情况可
见!该基因是受多种逆境因子诱导表达的!而且在
诱导的早期基因对逆境因子做出快速的应答!因此
!"#$%&#
基因可能在玉米抵抗逆境胁迫中发挥
重要的作用(
$
!
讨
!
论
.X.
作为一种重要的抗氧化剂!在植物细胞的
酶促反应和非酶促反应中均发挥重要作用!为了维
持植物体内
.X.
的平衡!其再生尤为重要(脱氢抗
坏血酸还原酶"
/N.[
#可以催化氧化态的抗坏血酸
/N.
还原成
.X.
!因此该酶对维系植物抗坏血酸
平衡和再生是非常重要的(
近年来!人们已经相继在小麦)烟草)水稻等植
物中克隆到
#$%&
基因并进行深入研究+(*+,(
!"""
年
d31
等从水稻中克隆到了
#$%&
基因!并
研究了基因的特性和表达模式+&,(
HL
等将水
稻的
#$%&
基因过表达后在逆境条件下可以明显
提高 植 株 的 产 量+@*%,(
,K=5
等 分 离 出 小 麦 的
#$%&
!并在烟草和玉米中进行表达后!检测结果
显示
#$%&
表量高达
$!
#
#""
倍! 种植物的抗氧
化系统功能明显增强+(,(同时!作为
/N.[
还原剂
的
EON
"谷胱甘肽#含量及其氧化还原水平也大为
提高(
OK312<62
等通过以
EON
为底物研究菠菜叶
绿体中
/N.[
的反应!发现
/N.[
反应特异性远
远高于动物酶类!并提出了
/N.[
的
?
35
L
*
?
<5
L
反
应机制!证明
/N.[
作为还原剂在抗氧化反应中起
重要作用(
H等发现拟南芥的
#$%&
基因
在抗离子胁迫中起作用+#",(
04V2
8
=>
等研究表明
#$%&
过表达可以增强植物对逆境环境的抵抗
力+,!如过表达小麦的
#$%&
可以增强烟草对臭
氧的抵抗力!在烟草中表达人的
#$%&
基因可以
增强烟草对高温和盐的抵抗力+#"*##,(
H35
等过表达
拟南芥细胞质
#$%&
!可以增强烟草对臭氧和干旱
@&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
的抵抗!提高植物抗氧化胁迫的能力+#!*#$,(
人类等少数动物自身不能合成抗坏血酸!必须
通过食物获得(近年来!对
.X.
合成)代谢)功能)
调控)利用等方面研究日益广泛和深入!同时
.X.
含量也已成为衡量果蔬品质的标准之一(玉米不仅
是重要的食物来源也是重要的饲草作物!玉米中的
.X.
含量直接影响其品质!所以对其含量的研究有
重要的意义(玉米中的
.X.
还参与植物的抗逆境
胁迫反应!在逆境环境下起重要的作用!所以研究
.X.
合成关键酶有重要的意义(本课题从玉米中
获得了控制
.X.
合成的关键基因
#$%&
并对其转
录特性及诱导表达情况进行了初步研究!结果表明
该基因可以应答多种逆境因子!其具体的作用机制
还需要深入研究(
参考文献!
+
#
,
!
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袁进成!等$玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和特性研究