全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(６): ５９５￣６０２(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０７￣１９ꎻ 修回日期: ２０１４￣０８￣１２
基金项目: 国家重大基础研究计划(２０１１ＣＢ１１１６１２)ꎻ国家自然科学基金(３１１６０３５９)ꎻ国家农业产业技术体系建设(ＣＡＲＳ￣３４￣ＧＷ８)ꎻ教育部
博士点基金(２０１０４６０１１１０００４)ꎻ海南大学科研启动资金(ｋｙｑｄ１００６)
通讯作者: 缪卫国ꎬ教授ꎬ从事分子植物病理学研究ꎻＴｅｌ: ０８９８￣６６２７０２２９ꎬＦａｘ: ０８９８￣６６１９２９１５８ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｗｅｉｇｕｏｍｉａｏ１１０５＠１２６.ｃｏｍ
郑服丛ꎬ教授ꎬ从事植物病理学研究ꎻＴｅｌ: ０８９８￣６６２７０２２９ꎬＦａｘ: ０８９８￣６６１９２９１５８ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｚｈｅｎｇｆｕｃｏｎｇ＠１２６.ｃｏｍ
第一作者: 万三连ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为分子植物病理学ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗａｎｓａｎｌｉａｎ１９８８＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０６.００５
橡胶树白粉病菌分生孢子在不同介质的萌发过程
及其内容物的变化
万三连ꎬ 梁 鹏ꎬ 宋风雅ꎬ 张 宇ꎬ 刘文波ꎬ 缪卫国∗ꎬ 郑服丛∗
(海南省热带生物资源可持续利用重点实验室 /海南大学环境与植物保护学院ꎬ海口 ５７０２２８)
摘要:本研究采用不同的染色方法和显微技术观察橡胶树白粉病菌(Ｏｉｄｉｕｍ ｈｅｖｅａｅ)分生孢子的超微结构ꎬ分生孢子在不同
介质表面及不同介质溶液中的萌发情况ꎬ以及孢子萌发过程中孢内主要物质的变化ꎬ以明确 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子在不同介
质萌发的形态变化及萌发所需能量来源ꎮ 结果表明:Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子表面具有较浅的花纹结构ꎬ呈椭圆形或者卵圆形ꎬ
大小为 ２６.１ ~４５.１ μｍ×１３.５ ~２１.９ μｍꎮ Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子在亲水和疏水介质上均能萌发产生芽管和附着胞ꎬ在葡萄糖水
中的萌发率略高于清水中ꎬ但萌发率无显著性差异 (Ｐ>０.０５)ꎬ芽管和附着胞形成与形态无明显差别ꎮ 分生孢子萌发过程
中ꎬ几个液泡会融合形成一个ꎬ最终消散而呈不明显可见的泡囊结构ꎮ 孢子内的糖原、脂质及分裂后的核仁等可通过芽管
向附着胞输送ꎬ表明 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子萌发所需能量物质主要来源于自身能量贮备ꎮ
关键词:橡胶树白粉病菌ꎻ 分生孢子ꎻ 附着胞ꎻ 能量物质ꎻ 介质
Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｆ Ｏｉｄｉｕｍ ｈｅｖｅａｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｉｔｓ
ｃｏｎｔｅｎｔ ｃｈａｎｇｅｓ　 ＷＡＮ Ｓａｎ￣ｌｉａｎꎬ ＬＩＡＮＧ Ｐｅｎｇꎬ ＳＯＮＧ Ｆｅｎｇ￣ｙａꎬ ＺＨＡＮＧ Ｙｕꎬ ＬＩＵ Ｗｅｎ￣ｂｏꎬ ＭＩＡＯ
Ｗｅｉ￣ｇｕｏꎬ ＺＨＥＮＧ Ｆｕ￣ｃｏｎｇ　 (Ｈａｉｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ / Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉ￣
ｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｈａｉｋｏｕ ５７０２２８ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｖａｒｉｏｕｓ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｆ
ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ (Ｏｉｄｉｕｍ ｈｅｖｅａｅ) ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ. Ｔｈｅ ａｉｍ ｉｓ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ
ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｅｒｇｙ ｓｏｕｒｃｅ ｎｅｅｄｅｄ ｆｏｒ ｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉ￣
ｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ. Ｃｏｎｉｄｉａ ｏｆ Ｏ. ｈｅｖｅａｅ ａｒｅ ｏｖａｌ ｏｒ ｎｅａｒｌｙ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｓｈａｐｅꎬ ２６.１ ~ ４５.１ μｍ×
１３.５~２１.９ μｍ ｉｎ ｓｉｚｅ. Ｓｐｏｒｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｃｔ ｓｕｒ￣
ｆａｃｅｓꎬ ｏｒ ｂｙ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｅｄｉａ. Ｔｈｅ ｓｈａｐｅ ｏｆ ｇｅｒｍ ｔｕｂｅ ａｎｄ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｗａｓ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ￣
ｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａ (Ｐ>０.０５) . Ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉｕｍ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎꎬ ｓｅｖｅｒａｌ ｖａｃｕｏｌｅｓ ｆｕｓｅｄ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ａｎｄ
ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｄｉｓｓｉｐａｔｅｄ ｓｏ ｔｈａｔ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ ｖａｃｕｏｌｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ. Ｔｈｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｆ Ｏ. ｈｅｖｅａｅ ｃｏｕｌｄ
ｇｅｒｍｉｎａｔｅ ｉｎ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ. Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄｓ ｓｔｏｒｅｄ ｉｎ ｃｏｎｉｄｉａ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ａｐｐｒｅｓｓｏ￣
ｒｉｕｍ ｖｉａ ｇｅｒｍ ｔｕｂｅ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉａ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ ｃｏｕｌｄ ａｌｓｏ ｂｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ. Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｅｎｅｒｇｙ ｆｏｒ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃａｍｅ ｆｒｏｍ ｃｏｎｉｄｉａ’ｓ ｏｗｎ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｒｅｓｅｒｖｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｏｉｄｉｕｍ ｈｅｖｅａｅꎻ ｃｏｎｉｄｉａꎻ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍꎻ ｅｎｅｒｇｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅꎻ ｍｅｄｉａ
中图分类号: Ｓ４３５.７６　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０６￣０５９５￣０８
　
植物病理学报 ４４卷
　 　 白粉病是橡胶树叶部重要病害之一ꎬ引起橡胶
树不正常落叶而影响干胶产量ꎮ 橡胶树白粉菌
(Ｏｉｄｉｕｍ ｈｅｖｅａｅ Ｂ. Ａ. Ｓｔｅｉｍｎａｎｎ ) 为专性寄生
菌[１]ꎮ 孢子萌发是病原菌入侵的最初阶段ꎬ直接
影响寄主发病的严重程度ꎬ因此ꎬ研究 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ
分生孢子的形态及萌发条件ꎬ有助于我们认识及了
解该病菌ꎮ 国内外学者对 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子的
研究报道存在一定的差异ꎬ主要包括大小、形状及
分生孢子梗是否为长链ꎬ孢子单生或串生等ꎮ
Ｓｔｅｉｎｍｎａｎｎ[１]描述 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子梗顶端具有
连续的分生孢子ꎬ通常是长链ꎮ 与此相反ꎬＰｅｒｉｅｓ[２]
认为 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 具有不连续生长的分生孢子ꎮ
Ｌｉｍｋａｉｓａｎｇ等[３]认为 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ分生孢子椭圆形或
圆柱体形ꎬ大小为 ２５.１~４３.６ μｍ ×１３.４~２３.３ μｍꎬ
长宽比为 １.４ ~ ２.５ꎬ并认为其应当属于类粉孢属
(Ｐｅｓｕｄｏｉｄｉｕｍ)ꎬ这与 Ａｒｅｎ[４] 报道新几内亚的
Ｏ. ｈｅｖｅａｅ孢子的大小基本一致ꎬ即 ２８ ~ ４２ μｍ×１４
~２３ μｍꎮ 在中国ꎬ有报道指出 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢
子大小为 ３６~４５ μｍ×１８~ ２７ μｍ [５]ꎬ而 Ｌｉ等[６]记
录该病菌分生孢子大小是 ２７~４５ μｍ×１５~２５ μｍꎬ
接近 Ｌｉｍｋａｉｓａｎｇ 的结果ꎬ分生孢子呈椭圆形或者
卵圆形ꎬ透明ꎬ单生或串生于分生孢子梗上端ꎮ
Ｚｈａｎｇ等[７]记录 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ分生孢子大小为 ３８.１ ~
４６.６ μｍ×１５.８~ ２１.８ μｍꎬ且在分生孢子外面有一
层透明物质存在ꎬ然而该记录与 Ｌｉ等[[６]的存在较
大差异ꎮ
　 　 植物病原菌分生孢子萌发受到其所接触基质
及周围环境因子的影响ꎬ包括寄主组织特有的结构
特点或非生命介质结构特点等[８~１３]ꎬ有研究表明亲
水性表面和寄主的蜡质层可以诱导 Ｏ. ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒ￣
ｓｉｃｉ 萌发[８]ꎬ但未见关于橡胶树白粉病菌分生孢子
在不同介质接触面萌发的研究报道ꎮ
　 　 湿度及自由水是影响白粉菌分生孢子萌发的
重要因素ꎮ 小麦白粉菌 (Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ.
ｔｒｉｔｉｃｉ)与大麦白粉菌(Ｂ. ｇｒａｍｉｎｉｓ ｆ. ｓｐ. ｈｏｒｄｅｉ)的
分生孢子可在 ０~１００％湿度范围萌发ꎬ且水面上萌
发率高ꎬ在淹水的环境下萌发率很低ꎬ 只有
３.４％[１４~１６]ꎮ 老鹰茶白粉菌(Ｏ. ｓｐ.)在 ２０％~１００％
的湿度和水滴中均可以萌发[１７]ꎮ 新番茄白粉菌
(Ｏ. ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ)分生孢子萌发的最适湿度范围
为 ８０％~１００％ꎬ但在水滴中不能萌发[１８]ꎮ 针对橡
胶树白粉菌ꎬ一些研究者认为其分生孢子可在
０~１００％湿度的环境中萌发ꎬ８８％为萌发最适湿度ꎬ
而大水滴对孢子的萌发不利[７ꎬ１９ꎬ２０]ꎬ但是有研究者
认为其在水滴中可以萌发[７]ꎮ
　 　 综上所述ꎬ在橡胶树白粉病菌分生孢子形态、萌
发过程以及不同介质对孢子萌发的影响等尚缺乏更
深一步的研究ꎮ 明确橡胶树白粉病菌分生孢子在萌
发过程中的显微结构及超微结构ꎬ研究不同介质对
孢子萌发的影响ꎬ以及孢子萌发所依赖的能量物质
及其输送途径ꎬ可为 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 形态学、分类学以及
其侵染机制研究和防治策略制定提供科学依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试材料
　 　 橡胶树品系:热研 ７３￣３￣９７(中感品系)ꎻ供试菌
种:橡胶树白粉菌菌种 ＨＯ￣７３ꎬ接种至橡胶树大古铜
期叶片上ꎬ并保持 １２ ｄꎮ 在接种前 ２４ ｈ轻摇感病叶
片以除去老死的孢子ꎬ采用 ２４ ｈ 时龄的新鲜白粉菌
分生孢子作为试验所用菌种ꎻ显微镜:Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ
５１显微镜ꎬ配备了微分干涉(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ
ｃｏｎｔｒａｓｔꎬ ＤＩＣ)ꎬ并具有明场及不同波段荧光配件ꎻ
扫描电镜:Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ￣３０００Ｎ扫描电镜ꎮ
１.２　 病菌孢子形态观察
　 　 直接从已接种叶片上取下新鲜 ＨＯ￣７３分生孢子ꎬ
分别于光学显微镜明场、ＤＩＣ下观察白粉菌孢子的外
部形态ꎮ 将含有分生孢子的新鲜病叶组织ꎬ按照
Ｋａｎｇ等[２１]的方法ꎬ于扫描电镜(Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ￣３０００Ｎ)
下观察叶片上分生孢子及菌丝、分生孢子梗等形
态ꎮ 按照Ｗｏｌｆ 等[２２]考马斯亮蓝染色方法ꎬ观察橡
胶树叶组织上病原菌萌发的不同形态ꎮ
　 　 将 ＨＯ￣７３分生孢子置于载玻片上:１)参照 Ｂｏｔｈ
等[２３]的 Ｌｕｇｏｌ及 Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ 两种染色方法处理分生
孢子ꎬ染色后于明场光学显微镜(Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ ５１)
下观察糖原染色的结果ꎬ于荧光显微镜下(激发光为
ＵＶ光)观察脂质染色结果ꎻ２)按照 Ｘｕ 等[２４]ＤＡＰＩ
染色方法ꎬ于荧光显微镜下(激发光为 ＵＶ光)观察
分生孢子核酸染色结果ꎻ３)按照 Ｘｉａｏ等[２５]的 ＤＩＯＣ
(６)３内质网的染色方法ꎬ于荧光显微镜下(激发光
为蓝光)观察分生孢子内质网膜染色结果ꎮ
１.３　 在不同介质表面分生孢子萌发观察
　 　 将新鲜 ＨＯ￣７３ 分生孢子ꎬ采用弹射法轻轻地
６９５
　
　 ６期 万三连ꎬ等:橡胶树白粉病菌分生孢子在不同介质的萌发过程及其内容物的变化
使孢子落于不同的非生命介质表面(载玻片、琼脂
膜、ｐａｒａｆｉｌｍ膜)ꎬ并置于人工气侯培养箱中(Ｓａｎｙｏ
Ｒ３１５)培养(温度 ２２℃ꎬ湿度 ６０％ ~ ７０％)ꎬ于接种
后 ０~８ ｈ期间ꎬ每间隔 １ ｈ于光学显微镜下观察分
生孢子萌发情况ꎻ按照Ｗｏｌｆ等[２２]考马斯亮蓝染色
方法ꎬ每隔 １ ｈ取样观察橡胶树叶组织上的病原菌
萌发情况ꎮ 每次随机取 ５０ ~ １００ 个孢子观察计数ꎬ
并比较萌发差异ꎮ
１.４　 不同介质溶液中分生孢子萌发率测定
　 　 将 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ分生孢子分别混于 ７ ｇ􀅰Ｌ－１葡萄
糖水与清水中ꎬ制成 １×１０６个􀅰ｍＬ－１孢子悬浮液ꎬ
于光学显微镜下在 ０ ~ ８ ｈ 期间连续观察ꎬ并记录
孢子萌发时间及萌发率ꎮ 每次随机取 ５０ ~ １００ 个
孢子观察计数ꎮ
１.５　 孢子萌发过程中内容物变化
　 　 将橡胶树白粉菌分生孢子置于载玻片上的水
滴中ꎬ在 ０ ~ ８ ｈ 培养期间ꎬ每间隔 １ ｈꎬ分别采用
Ｌｕｇｏｌ染液、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ 染液、ＤＡＰＩ 染液、Ｄｉｃｏ６(３)
染液染色ꎬ置于光学显微镜以及荧光显微镜下观察
病原菌发育过程中分生孢子内容物的变化ꎮ
１.６　 数据分析
　 　 所有数据均采用 Ｅｘｃｅｌ处理ꎬ差异性分析采用
ＳＡＳ ９.０ꎻ所有样本均进行至少 ６次重复ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 橡胶树白粉病菌分生孢子的形态特征
　 　 橡胶树白粉病菌分生孢子呈椭圆柱形或者卵
圆形(图 １)ꎮ 分生孢子在普通光下是透明可见的
(图 １Ａ)ꎬ采用 ＤＩＣ 微分干涉技术ꎬ看到细胞核处
于分生孢子中心ꎬ呈球面镜形ꎬ核仁中部有突起ꎬ扫
描电镜下核仁呈球状ꎬ白色ꎬ略偏离纵轴中心位置ꎮ
每个分生孢子都有一个或多个体积较大的明显可
见的液泡ꎬ在靠近分生孢子末端位置还有很多的小
液泡(图 １Ｂ)ꎮ 采用考马斯亮蓝染色后ꎬ可以明显
看到分生孢子外围有一层类似膜的物质(图 １Ｃ)ꎬ
实为分生孢子较厚的细胞壁外层ꎮ
　 　 通过扫描电镜观察ꎬ分生孢子表面有较浅的花
纹结构ꎬ而其两端则相对光滑ꎬ无明显花纹(图 １Ｄ)ꎬ
Ｆｉｇ. １　 Ｃｏｎｉｄｉａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ (Ｏｉｄｉｕｍ ｈｅｖｅａｅ)
Ａ: Ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉｕｍ (ａｒｒｏｗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｃｏｎｉｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌꎻ ａｒｒｏｗｈｅａｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓꎻ Ｄｅｌｔａ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｖａｃｕｏｌｅ)ꎬ
ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ ２０ μｍꎻ Ｂ: Ｔｈｅ ｔｙｐｉｃａｌ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ (ＤＩＣ)
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ (ａｒｒｏｗｈｅａｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓꎻ Ｄｅｌｔａ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｖａｃｕｏｌｅ)ꎬｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ ２０ μｍꎻ Ｃ: Ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ
ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０ (ａｒｒｏｗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｃｏｎｉｄｉａｌ ｃｅｌｌ ｗａｌｌꎻ ａｒｒｏｗｈｅａｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ)ꎬ
ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ ２０ μｍꎻ Ｄ: Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ (ＳＥＭ) ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａꎬ ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ １０ μｍ.
７９５
　
植物病理学报 ４４卷
此处应为顺次生长的分生孢子的芽痕(ｂｕｄ ｓｃａｒ)ꎮ
分生孢子大小为 ２６.１ ~ ４５.１ μｍ×１３.５ ~ ２１.９ μｍꎬ
长宽比为 １.５~２.６ꎮ
２.２　 分生孢子在不同介质表面萌发与发育结构差异
　 　 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ分生孢子接种于寄主或者非生命介
质的表面ꎬ于 ２ ｈｐｉ(ｈｏｕｒｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬ ｈｐｉ)常
从其近末端开始萌发产生 １个芽管ꎬ个别分生孢子
会从两端分别产生 １个芽管ꎬ但通常只有 １个芽管
顶端细胞膨大形成耳垂体状(或掌状)的附着胞
(图 ２Ｅ)ꎮ 附着胞的形成经历了一系列的步骤:核
仁的分裂ꎬ形成初隔膜ꎬ形成附着胞幼体ꎬ顶部肿胀
突起以及形成第二层隔膜ꎮ 分裂后核仁最后会进
入到附着胞中ꎬ一个成熟的附着胞通常含有一个单
核ꎮ ８ ｈｐｉꎬ９８％己经萌发的分生孢子都产生了对称
的耳垂状的附着胞(图 ２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ)ꎮ 在寄主(橡胶
树叶)表面ꎬ从附着胞的上部会产生次生菌丝ꎬ并
进一步伸长ꎬ最后在叶表面形成肉眼可见的菌落ꎮ
相反ꎬ在非生命介质表面(载玻片、琼脂膜、ｐａｒａｆｉｌｍ
膜)ꎬ分生孢子至形成附着胞后发育停滞或者进一
步形成较多的分瓣ꎬ附着胞的芽管不会形成菌丝ꎬ
甚至附着胞芽管以及附着胞均会渐渐萎缩
(图 ２Ｈ)ꎮ
　 　 接种 ８ ｈ 后ꎬＯ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子在非生命介
质表面的萌发率均在 ９５％以上ꎬ而在寄主植物叶
表ꎬ则只达到了 ８１％ꎬ明显低于在非生命介质表面
的萌发率(表 １)ꎮ
２.３　 分生孢子在不同介质溶液中的萌发情况
　 　 我们测试了 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子在葡萄糖水
和清水中的萌发率ꎬ结果表明ꎬ在葡萄糖水中分生
孢子开始萌发的时间要早于清水中 １０~２０ ｍｉｎꎬ同
Ｆｉｇ. ２　 Ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｇｅｒｍ ｔｕｂｅ ａｎｄ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｆ Ｏｉｄｉｕｍ
ｈｅｖｅａｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｄｉａ
Ａꎬ Ｅ: Ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｌｅａｖｅｓ (ｈｏｓｔ)ꎻ Ｂꎬ Ｆ: Ｏｎ ｗａｔｅｒ ａｇａｒ (ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ)ꎻ Ｃꎬ Ｇ: Ｏｎ ｐａｒａｆｉｌｍ ｍｅｍｂｒａｎｅ
(ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｓｕｒｆａｃｅ)ꎻ Ｄꎬ Ｈ: Ｏｎ ｇｌａｓｓ ｓｕｒｆａｃｅ. ０ ｈｐｉ: Ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻ
８ ｈｐｉ: ８ ｈｏｕｒｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ ２０ μｍ.
Ｔａｂｌｅ １　 Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ (％) ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｆ Ｏｉｄｉｕｍ ｈｅｖｅａｅ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
Ｈｏｕｒｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ / ｈ
２ ３ ４ ５ ６ ７ ８
Ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ ｌｅａｖｅｓ １５.０±２.１ ａ ５９.７±２.１ ａ ７６.０±２.６ ａ ７８.７±２.３ ａ ７９.７±４.７ ａ ８１.０±４.６ ａ ８１.７±２.３ ａ
Ａｇａｒ ｐｌａｔｅｓ ５７.０±１.０ ｂ ８９.３±２.１ ｂ ９４.０±１.０ ｂ ９５.７±０.６ ｂ ９７.３±０.６ ｂ ９７.０±１.０ ｂ ９６.３±１.５ ｂ
Ｐａｒａｆｉｌｍ ｓｌｉｄｅｓ ５７.３±２.１ ｂ ８９.７±２.１ ｂ ９６.０±１.０ ｂ ９５.７±１.５ ｂ ９６.０±１.０ ｂ ９７.３±０.６ ｂ ９７.７±１.５ ｂ
Ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅｓ ５５.７±０.６ ｂ ９０.７±１.５ ｂ ９５.７±１.２ ｂ ９５.７±１.５ ｂ ９６.７±１.５ ｂ ９５.７±０.６ ｂ ９５.７±１.５ ｂ
Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ａｖｅｒａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ± ＳＤꎻ Ａｖｅｒａｇｅｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｔｔｅｒ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ (Ｐ＝ ０.０５) .
８９５
　
　 ６期 万三连ꎬ等:橡胶树白粉病菌分生孢子在不同介质的萌发过程及其内容物的变化
时在葡萄糖水中分生孢子芽管比清水中分生孢子
芽管明显要长ꎮ 在这两种介质中ꎬ随着 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ
分生孢子芽管的伸长ꎬ芽管顶端细胞(ｕｐ ｃｅｌｌ)均会
膨大形成附着胞ꎬ但清水中附着胞的形成时间要比
在葡萄糖水中早 １~２ ｈ(图 ３)ꎮ
２.４　 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ孢子萌发以自身糖原和脂肪等作
为主要能源物质
　 　 经 Ｌｕｇｏｌ染色(图 ４Ａ)ꎬ可以看到在待萌发分
生孢子的中间显现棕褐色的颗粒状物ꎬ趋向外层其
膜状物质被染的颜色逐渐变淡ꎬ说明分生孢子中含
Ｆｉｇ. ３　 Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ ｏｆ Ｏｉｄｉｕｍ ｈｅｖｅａｅ ｉｎ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ
Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ ０ꎬ ２ꎬ ４ꎬ ６ ａｎｄ ８ ｈ ａｆｔｅｒ ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｗａｔｅｒ. Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝２０ μｍ.
Ｆｉｇ. ４　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｏｎｉｄｉａ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｓｓ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ
２４￣ｈｏｕｒ￣ｏｌｄ ｃｏｎｉｄｉａ ｗｅｒｅ ｐｌａｃｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｌｉｄｅ. Ｅｖｅｒｙ １ ｈｏｕｒꎬ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ Ｌｕｇｏｌꎬ Ｎｉｌｅ Ｒｅｄꎬ ＤＡＰＩ ｏｒ Ｄｉｃｏ６
(３) ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｅｉｔｈｅｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｃｏｎｉｄｉａ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ. Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ ２０ μｍ.
９９５
　
植物病理学报 ４４卷
有大量的糖原颗粒物质ꎬ且主要集中于分生孢子中
部ꎮ
　 　 Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ染色的结果发现待萌发分生孢子整
体呈现亮红色(图 ４Ｄ)ꎬ细胞壁外层染色更深ꎬ表
明此时的分生孢子含有大量的脂质物质ꎬ外层更
多ꎮ
　 　 经 Ｄｉｏｃ６(３)对待萌发的分生孢子染色ꎬ结果
发现整个分生孢子呈现出绿色荧光(图 ４Ｈ)ꎬ荧光
强度的大小与其活力的大小有关ꎬ进一步确认此时
的分生孢子积聚有较高的能量ꎬ充满活力ꎮ
　 　 在荧光显微镜下观察 ＤＡＰＩ 染色的分生孢子ꎬ
待萌发孢子呈现有较强荧光的核仁(图 ４Ｋ)ꎬ位置
在分生孢子的中间ꎬ成紧缩状ꎬ说明此时分生孢子
正处于活力较旺盛的阶段ꎮ
　 　 随着孢子的萌发ꎬＬｕｇｏｌ 染液染色发现ꎬ孢子
内容物颜色由棕褐色慢慢变淡ꎬ最后呈现黄色和淡
黄色等ꎬ同时附着胞逐渐变为棕褐色ꎬ说明随着孢
子的萌发及附着胞的形成ꎬ其内含的糖原物质慢慢
地被消耗(图 ４Ｂ、４Ｃ)ꎻＮｉｌｅ Ｒｅｄ 染液染色发现ꎬ随
着孢子的萌发ꎬ孢子内容物颜色由红色荧光慢慢变
弱ꎬ说明分生孢子自身的脂质含量随着其发育而减
少ꎬ而附着胞红色荧光逐渐趋强ꎬ说明其聚焦了来
自于分生孢子内部大量的脂质等物质 (图 ４Ｅ、
４Ｆ)ꎮ 在分生孢子的萌发过程中ꎬ通过 Ｄｉｏｃ６(３)染
色ꎬ可以看到在形成的附着胞中逐渐产生较强黄绿
色荧光ꎬ说明附着胞中有完整的细胞膜ꎬ且其中含
有来自于分生孢子内部的线粒体基质ꎬ是能量聚集
的地方ꎬ而此时的分生孢子ꎬ却几乎看不到任何的
荧光现象(４Ｉ、４Ｊ)ꎮ 采用 ＤＡＰＩ 染色发现ꎬ随着孢
子萌发ꎬ核位置慢慢转移到萌发的位点ꎬ并且在萌
发位点处呈分裂状ꎬ随着芽管的伸长ꎬ进入到附着
胞中ꎬ并在附着胞中逐渐显现出较强的蓝色荧光团
(４Ｌ、４Ｍ)ꎬ说明此时在细胞核中存在复制与分裂
过程ꎮ 因此ꎬ不管何种方法染色ꎬ在分生孢子萌发
的过程中ꎬ都可以发现芽管中并不积累来自于分生
孢子的物质ꎬ它只起到了一个管道传输的作用ꎬ将
分生孢子中的内容物质输送到芽管顶端的细胞ꎬ并
在附着胞处聚集、积累ꎬ支持病原菌进一步侵染ꎮ
３　 讨论
　 　 白粉菌的分类除了根据有性世代进行划分ꎬ还
会根据其无性世代的特征划分ꎬ包括分生孢子大
小、芽管产生方式、附着胞的形态等[２６~２９]ꎮ 在我们
研究中ꎬ橡胶树白粉病菌分生孢子大小为 ２６.１ ~
４５.１ μｍ×１３.５ ~ ２１.９ μｍꎬ与 Ｌｉ 等[６]以及 Ｌｉｍｋａｉ￣
ｓａｎｇ等[３]报道分生孢子大小接近ꎬ但是却与我国
学者 Ｌｕ等[５]和 Ｚｈａｎｇ等[７]报道相差较远ꎬ这说明
白粉菌分生孢子的大小不仅在不同国家或者地区
之间存在一定差异ꎬ而且在同一个地方不同年份也
有差异ꎬ这是否与不同年份因环境气候差异有关还
是由于白粉菌自然形态本身的差异ꎬ还需进一步实
验证明ꎮ
　 　 我们的研究结果表明ꎬＯ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子可
以在自由水或者水滴中萌发ꎮ 从萌发结果看ꎬ自由
水或者水滴能够促使附着胞较早形成ꎬ但自由水在
促使分生孢子产生芽管的效率不如葡萄糖水ꎬ有学
者认为这是由于液泡吸水胀裂释放出了毒性物
质[２０]或者淹水环境下缺氧所致[１５ꎬ１６]ꎬ但自由水与
葡萄糖水两者在孢子萌发方面并未有显著性差异ꎮ
　 　 以考马斯亮蓝、Ｌｕｇｏｌ染色、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ 染色以及
Ｄｉｏｃ６(３)等染色结果表明ꎬ占分生孢子体积约
９０％的液泡中含有大量的蛋白、糖原及脂质等ꎬ这
可为孢子萌发提供所必须的能量及酶类物质[３０]ꎮ
因此ꎬＯ. ｈｅｖｅａｅ在与寄主正式互作前ꎬ并不需要来
自寄主或者外界的能量或营养ꎬ在不同的基质面
Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子都有较高的萌发率ꎬ其萌发不
受特定外界基质的限制ꎬ不管分生孢子处于亲水还
是疏水的介质之上ꎬ其萌发时间及萌发率之间都没
有显著性差异ꎬ从进化角度ꎬ这将有利于 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ
作为专性寄生菌在自然环境下的生存ꎮ 但是我们
的研究结果发现在非生命介质上 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 分生
孢子萌发率较寄主(橡胶树叶片)高ꎬ可能是病原
菌与寄主相互识别时ꎬ病原菌会受到寄主一定程度
上的非专化识别ꎬ影响病原菌萌发ꎮ 在 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ
附着胞形成过程中ꎬ随着芽管的伸长ꎬ大量的糖原、
脂质、蛋白酶类、线粒体基质及核酸物质等积累于
附着胞处(图 ４)ꎬ附着胞会形成球状或者半球状的
突起ꎬ形成多个分辨ꎬ这些现象类似于稻瘟菌ꎬ在其
分生孢子形成附着胞的突起中积累了大量脂质
(甘油)ꎬ对寄主产生一定的膨压ꎬ有利于病原菌侵
入到寄主细胞中[３１]ꎮ 但在我们后续 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 基
因组学研究中ꎬＯ. ｈｅｖｅａｅ 致病基因仅占可注释基
因的 ０.６％ꎬ并显示 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ缺乏类似稻瘟病菌具
有的侵入寄主的黑色素相关基因(资料未显示)ꎬ
００６
　
　 ６期 万三连ꎬ等:橡胶树白粉病菌分生孢子在不同介质的萌发过程及其内容物的变化
这是否表明 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ 侵入寄主的方式会与稻瘟
病菌存在一定差异ꎮ 因此ꎬＯ. ｈｅｖｅａｅ 与寄主互作
识别与侵入及与孢子萌发间关系ꎬ我们将在橡胶树
与白粉病菌互作转录谱研究中做进一步验证ꎮ
　 　 附着胞分瓣是附着胞畸形的一种表现形式ꎬ是
由于附着胞首次无法正常侵入时而做出不断改变
其侵入的方向和部位的结果[３２ꎬ３３]ꎮ 附着胞不断的
分瓣ꎬ最终消耗了病原菌自身贮存的营养和能量ꎬ
若没有办法获取到外界能量的补充ꎬ最终会导致病
原菌丧失了侵染能力[３１ꎬ３２]ꎮ 在本研究中 ＨＯ－７３
分生孢子在非生命介质(ｐａｒａｆｉｌｍ 膜及水琼脂、载
玻片)表面形成的附着胞ꎬ 一般会形成 ２ ~ ３ 次的
分瓣ꎬ形成的分瓣数多于寄主表面ꎬ且在附着胞下
方有很多小的附着胞幼体出现(图 ２)ꎮ 白粉菌在
萌发形成附着胞后ꎬ会不停地进行尝试ꎬ他们成功
侵入到寄主的表皮细胞并形成具有功能的吸器ꎮ
有的白粉菌如 Ｏ. ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ 可以尝试侵染 ７
次ꎬ甚至可能从原本附着胞的位置再重新伸长出芽
管ꎬ但是一般情况下ꎬ新长出的芽管ꎬ在后来的 １~２
ｈ内则可能会停止继续发育[３１ꎬ３４]ꎮ 橡胶树白粉病
菌附着胞形态在寄主和非生命介质上的改变ꎬ存在
的是附着胞分瓣数目的区别ꎮ 这些说明在 ｐａｒａ￣
ｆｉｌｍ膜、水琼脂及载玻片上ꎬＯ. ｈｅｖｅａｅ 分生孢子附
着胞多重分瓣现象可能是由于其进行多次的侵染
尝试但仍没有成功ꎬ不能形成吸器以获取外界能
量ꎬ待能量耗尽而变瘪平ꎬ这些还有待做进一步验
证ꎮ
　 　 致谢:浙江大学农业与生物技术学院胡东维教
授为本研究 Ｏ. ｈｅｖｅａｅ超微结构确定提供了帮助ꎮ
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责任编辑:李晖
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