全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 41(1): 98-101(2011)
收稿日期: 2010-05-20; 修回日期: 2010-10-27
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项经费资助(nyhyzx3-22); 现代苹果产业技术体系建设专项资金资助
通讯作者: 李保华,教授,主要从事病害流行学研究; Tel: 0532-88030480, E-mail: baohuali@qau. edu. cn。
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췍研究简报
苹果轮纹病瘤组织形态研究
张高雷1, 李保华1*, 董向丽1, 王彩霞1, 李桂舫1, 国立耘2
( 1青岛农业大学农学与植物保护学院, 青岛 266109; 2中国农业大学植物病理学系, 北京 100193)
Microanatomy conformation of apple branch tumors caused by Botryosphaeria
dothidea ZHANG Gao-lei1, LI Bao-hua1, DONG Xiang-li1, WANG Cai-xia1, LI Gui-fang1, GUO
Li-yun2 ( 1College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
2Department of Plant Pathology, China Agricultural University, Beijing 100193, China)
Abstract: Three to five months old Fuji apple branches were inoculated with conidia or mycelium of Botryo-
sphaeria dothidea. Barks were sampled around lenticels or tumors from the inoculated and naturally diseased
branches. The samples were cut with freezing microtomy and microanatomy conformations of tumors were ex-
amined with the microtome-sections. Observation results showed that newly formed tumors could be found just
under lenticels from the branches 30 days after inoculation. The mycelia grew and expanded radially from the
lenticels and the hyphae in tumors were thick and strong with circular or truncated end. All hyphae in deve-
loped tumors were surround with several layers suberized host cells. The suberized cells stretched out, ar-
ranged in rings and enclosed the hyphae. A suberous layer, constructed of several layers of suberized host cells
and expanded from epidermal cells, could be found just around the tumor in later stage of tumor development.
The results suggested that B. dothidea infection stimulated the production of new host phloem cells and the cell
suberization. The new produced cells together with the mycelia formed the tumors. The suberous layer separa-
ted the tumor tissue from health host cell and resulted in necrosis of tumor and surrounded tissues. The edge of
the necrotic tumor was then lift, like saddle next year and finally peeled off. The observation suggested that
tumor forming and peeling were the results of host defending reaction to the pathogen.
Key words: Botryosphaeria dothidea; apple branch tumor; microanatomy conformation; defence action
文章编号: 0412-0914(2011)01-0098-04
苹 果 轮 纹 病 [ Botryosphaeria dothidea
(Moug. ) Ces. et De Not. ]是富士苹果的主要病
害,该病在环渤海湾和黄河故道苹果产区已严重影
响苹果生产。 据 2008 年调查,国内苹果枝干轮纹
病总体发病率达 77. 6% [1],因轮纹病一般年份苹
果果实损失 20% ~ 30% ,严重年份损失 70% 以
上[2]。 目前,对于苹果果实轮纹病主要采取套袋
或连续喷药保护的防治策略,而对枝干轮纹病尚无
有效的防控措施。
苹果轮纹病菌主要通过皮孔侵染枝干[3],病
菌侵染后诱发症状需要较长时间。 对于轮纹病菌
的侵染过程和致病机制,病菌在寄主组织内生长扩
展部位,以及杀菌剂能否对病菌的生长扩展有效控
制等问题,目前还不清楚。 本文通过组织切片观
察,了解轮纹病菌的侵染过程和致病机制,以及病
原菌在寄主组织内的生长扩展部位,以期为苹果轮
1 期 张高雷,等:苹果轮纹病瘤组织形态研究
纹病的防治提供参考。
1 材料与方法
1. 1 组织固定液、保存液及染色液的配制
1. 1. 1 组织固定液 1)称取 4 g 多聚甲醛加入
50 mL 蒸馏水,60℃水浴溶解后用 NaOH 调节 pH
至 7. 0; 2)加入 50 mL 0. 2 mol / L磷酸缓冲液(pH
7. 0),摇匀; 3)加 1 mL 50%戊二醛,混匀后室温
避光保存。
1. 1. 2 组织保存液 称取 NaCl 4. 672 g,蔗糖
60 g,叠氮化钠 80 mg,加入 0. 2 mol / L磷酸缓冲液
(pH 7. 0)定容至 400 mL,室温避光保存。
1. 1. 3 染色液 组织切片用 0. 1%苯胺蓝乳酚油
染色,配方为乳酸 20 mL、甘油 40 mL、苯酚
20 mL、苯胺蓝 100 mg,用蒸馏水定容至 100 mL。
1. 2 病原菌接种
2008 年从山东省莱阳市水沐头村的生产果园
内,采集 1 年生富士苹果轮纹病枝条,通过病瘤组
织分离获得轮纹病菌的单孢分离菌株,保存备用。
接种前,活化菌种,用富士苹果的幼果繁殖分生孢
子[4],用于枝条接种;或继代培养 5 d,用直径 1. 2
cm的打孔器从菌落边缘打取菌饼,直接用于枝条
接种。
2009 年 6 ~ 7 月,选取富士苹果 30 ~ 60 cm 长
的当年生营养枝,采用 2 种方法接种:1)将轮纹病
菌的分生孢子配制成浓度为 106 个 / mL 孢子悬浮
液,喷雾接种整个枝条,接种后迅速套塑料袋密封,
保湿 24 h后解去塑料袋;2)取直径 1. 2 cm菌饼贴
在当年生富士枝条中部,菌丝面贴近枝条,随后用
4 ~ 5 cm宽的塑料条将菌饼包扎在枝条上,每个枝
条接种 5 个点,3 d 后解去塑料条。 接种试验在青
岛农业大学实验果园内 3 年生的矮化富士上进行。
1. 3 取样、制片与观察
轮纹病菌接种 30 d后,每隔 10 ~ 20 d,以接种
枝中部或接种部位的皮孔或形成的病瘤为中心,用
刀片切取 2 ~ 4 mm 见方的皮层组织,置于组织固
定液中固定 12 h,然后转入保存液中长期保存。 同
时在田间切取典型的轮纹病瘤,固定并保存,用于
组织切片观察。
切片时,取出保存皮层组织,经 4%琼脂糖包
埋后,用冷冻切片机(Microm HM 525)在 -25℃下
冷冻切片,切片厚度为 6 ~ 20 μm,切下的组织片滴
加苯胺蓝染色液,室温染色 10 min,加盖玻片上镜
观察,选取典型视野照相。 组织学观察使用 Leica
DM2500 万能显微镜,以紫外光(UV,波长 340 ~
380 nm)作激发光源进行荧光观察。
1. 4 菌丝鉴定
枝干取样直接切片,厚度 20 μm,切下的组织
片不经固定和染色,直接平展到 2%琼脂平板上,
在显微镜下用挑针剥离出菌丝,转入 PDA中培养,
以此确认组织所观察的菌丝是否为轮纹病菌菌丝。
2 结果与分析
用菌丝接种和分生孢子接种的当年生富士苹
果枝条,分别于接种 60 d和 90 d后,皮孔开始突起
形成典型的轮纹病瘤。 病菌接种 30 d 后,取接种
部位皮层组织切片,在皮孔下都能清晰地分辨出病
瘤组织和轮纹病菌菌丝,图版 I-2 是轮纹病的早期
病瘤,皮孔还没有突起,外观见不到症状。 图版Ⅰ-
1 和Ⅰ-5 为刚突起病瘤中的菌丝,病瘤中所见菌丝
粗壮,有分隔,直径 8 ~ 12 μm,菌丝顶端钝圆或平
截,以皮孔为中心,向皮层组织内呈放射状生长。
从组织中剥离出与图版Ⅰ-1 中形态相似的菌丝,
在 PDA上培养,长出的菌落为典型的轮纹病菌菌
落,产生的分生孢子为典型的轮纹病菌孢子,以此
可以断定,显微镜下所见粗壮菌丝是轮纹病菌
菌丝。
病瘤发展中期,即病瘤突起后,病瘤中所见菌
丝通常由 1 ~ 5 层寄主细胞包围(图版Ⅰ-3 和Ⅰ-
4),包围菌丝的寄主细胞扁平,细胞壁能发蓝色荧
光,围绕菌丝呈环形排列,与寄主皮层中正常的薄
壁细胞完全不同,但细胞壁所发荧光的颜色与正常
枝条表皮木栓层细胞壁所发荧光的颜色完全相同,
据此推测,包围菌丝的环形细胞的细胞壁已木栓
化,而且病瘤的龄期越长,木栓化程度越高,细胞壁
所发荧光越强。 在木栓化细胞外层,有数层细胞壁
不发荧光,但呈环状排列的组织细胞。
病瘤生长后期,病瘤外围可观察到数层(通常
4 ~ 8 层)细胞壁能发强烈荧光的寄主细胞。 该层
细胞与正常枝条木栓层细胞的结构完全相似,细胞
扁平、层状排列、质地致密,很像是木栓层向下延伸
形成。 这层细胞将病瘤组织与寄主皮层健康组织
隔离开来(图版Ⅰ-6)。
99
植物病理学报 41 卷
Plate Ⅰ Microanatomy conformation of apple branch tumors caused by
Botryosphaeria dothidea
H: Hypha; C: Suberized host cells; T: Tumor.
Fig. 1 Longitudinal section of a newly formed tumor on Fuji apple branches. The B. dothidea hypha was thick and strong with
circular or truncated end.
Fig. 2 Longitudinal section of newly formed tumor, which had not developed to a visual tumor in appearance. The diseased host
cells began to suberification and give out fluorescent light under UV light of 340 - 380 nm. The fluorescent light color
was the same as the color of the fluorescent light given out from host normal epidermal cells.
Fig. 3 A B. dothidea hypha was surrounded suberized host cells. The suberized cells stretched out, arranged in rings, enclosed
the hypha and give out blue fluorescent light under UV light.
Fig. 4 In developed tumors, all hyphae were surrounded by suberification cells.
Fig. 5 B. dothidea hyphae grew radially from the lenticel in cortical tissue in a newly formed tumor.
Fig. 6 A part of longitudinal section of a tumor in later development stage. A suberous layer was formed to separated the tumor
tissue from health host cell.
001
1 期 张高雷,等:苹果轮纹病瘤组织形态研究
3 结论与讨论
用轮纹病菌的菌丝或孢子于 7 月份接种当年
生富士苹果的枝条,于病菌接种 30 d 后,以皮孔或
病瘤为中心取样切片,能见到在皮孔下形成的病瘤
组织,病瘤内的菌丝粗壮,顶端钝圆或平截,以皮孔
为中心,向皮层组织内放射状生长。 在突起的病瘤
内,所观察到的菌丝都被多层扁平,且围绕菌丝呈
环形排列的寄主木栓化细胞包围。 病瘤生长后期,
病瘤外缘能见到由数层扁平、层状排列、质地致密
的木栓化细胞,该层细胞将病瘤与健康寄主组织
隔离。
从组织学的观察结果推断,轮纹病菌在侵染富
士苹果枝条的过程中,能够刺激寄主皮层细胞增
生,并形成木栓化细胞,增生细胞和木栓化细胞都
能抑制轮纹病菌菌丝在寄主组织内生长和扩展。
因此,病瘤组织内的菌丝粗壮,比在 PDA培养基上
生长的菌丝粗 3 ~ 5 倍,且顶端平截。 这表明菌丝
在寄主皮层内的生长和扩展受到很大的阻力,生长
扩展缓慢。 在病瘤的形成过程中,病瘤外围细胞木
栓化,将病组织与健康组织隔离。
本文从组织学证明,苹果枝干轮纹病瘤的形成
是轮纹病菌侵染枝条后刺激寄主皮层细胞增生和
木栓化的结果。 部分病瘤产生 1 年后,病健交界处
开裂,形成“马鞍”翘起,并最终剥离,是因为病瘤
外围细胞木栓化,将病组织与健组织隔离造成的。
本文为苹果轮纹病组织学深入研究提供了基
本的方法,有关轮纹病的侵染机制还需要更深入的
研究。 例如,轮纹病菌的侵入方式、途径、过程,以
及病菌在侵入过程中病菌和寄主的形态变化等,尤
其是轮纹病菌在果实上的侵入过程,目前报道还很
少,而对病菌侵入过程的认识和了解才是制订病害
防治措施的基础。 值得一提的是,前期研究发现,
当枝条受水分协迫时,轮纹病菌能突破寄主防御,
以病瘤或皮孔为中心向外扩展形成坏死病斑,即干
腐病斑。 研究发现,苹果轮纹病菌从 5 月份就能侵
染果实,而果实 8 月份才开始发生轮纹病[2]。 对于
导致轮纹病菌突破寄主防御,使枝条和果实迅速发
病的机制,目前还没有明确的解释。
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责任编辑:于金枝
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