全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$江苏省自然科学基金"
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#&江苏省农业三新工程"
3456

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#&青蓝工程"苏教师
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作者简介$颜志明"
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#!男!博士!副教授!主要从事蔬菜栽培与分子生理研究)
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外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜脯氨酸代谢的影响
颜志明#!!%!冯英娜#!%!韩艳丽#!魏
!
跃#!%!郭世荣!
"
#
江苏农林职业技术学院!江苏镇江
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南京农业大学 园艺学院!南京
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%
江苏现代园艺工程技术中心!江苏镇江
!#!""
#
摘
!
要$为探明外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜脯氨酸代谢的影响!以甜瓜品种*雪美+为材料采用营养液栽培!对盐胁
迫"
#""99?;
,
C
&#
D:6;
#-盐胁迫下添加外源脯氨酸"
#""99?;
,
C
&#
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,
C
&#
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#以及对照
%
种处理后甜瓜幼苗叶片脯氨酸"
FG?
#含量-吡咯啉
($(
羧酸合成酶"
F$63
#-鸟氨酸转氨酶"
IJK
#和脯氨酸脱氢酶
"
FG?LM
#活性进行测定!并对
!"#
和
$%&(
基因进行克隆及半定量表达分析)结果显示$与对照相比较!盐胁迫
条件下甜瓜幼苗叶片内
FG?
含量显著增加!
F$63
活性增幅大于
IJK
活性!
"#
基因表达量大部分时段内没有增
加!
FG?LM
活性下降!
$%&(
基因表达量减少&盐胁迫下添加外源脯氨酸进一步使幼苗叶片内
FG?
含量增加-
IJK
-
FG?LM
活性提高-
F$63
活性降低!并且使
!"#
基因表达量迅速增加-
$%&(
基因表达量先增加后回落)
研究表明!盐胁迫条件下!甜瓜幼苗体内脯氨酸积累主要是通过增强脯氨酸的谷氨酸合成途径和抑制脯氨酸降解
来实现&适量外源脯氨酸可以增强盐胁迫幼苗脯氨酸的鸟氨酸合成途径!但对谷氨酸合成途径有一定的抑制作用&
通过调节合成和降解
!
种代谢途径进一步提高了脯氨酸含量!从而增强甜瓜幼苗耐盐胁迫能力)
关键词$脯氨酸&盐胁迫&甜瓜&谷氨酸途径&鸟氨酸途径
中图分类号$
N7$*)0
&
N)07
!!!
文献标志码$
J
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甜瓜"
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#又名香瓜!为葫芦科一
年生蔓性植物!果实香甜富含糖-淀粉-矿物质及维
生素等营养物质!是一种深受人们喜爱-种植面积较
大瓜果)由于多在温室采用无土栽培技术!易导致
栽培基质中盐分含量增加!而甜瓜是对盐敏感植物!
盐渍化造成的盐胁迫伤害能极大地抑制甜瓜生长!
造成甜瓜产量和品质降低#()研究表明植物受到盐
渍时体内会合成较高含量的脯氨酸"
FG?
#!这些积累
的内源脯氨酸可以减轻盐胁迫对植物的伤害!()植
株体内脯氨酸合成途径主要有两条!分别为谷氨酸
"
5;A
#途径和鸟氨酸"
IG/
#途径!其中吡咯啉
($(
羧酸
合成酶"
F$63
#是谷氨酸途径的关键酶!鸟氨酸转氨
酶"
IJK
#是鸟氨酸途径的关键酶!而脯氨酸脱氢酶
"
FG?LM
#则是脯氨酸降解反应的限速酶%()许多
研究()(表明当植物本身产生的脯氨酸不足以消除
逆境伤害时!可以使用外源脯氨酸来缓解逆境伤害!
外源脯氨酸在增强作物对干旱-盐-高温等逆境胁迫
耐性方面具有重要的作用)
作者曾在
#aM?:
>
;:/X
营养液中培养甜瓜幼
苗!生长正常"图
#
!
J
#!添加
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,
C
&#
D:6;
的
#aM?:
>
;:/X
营养液中的甜瓜幼苗植株矮小-生
长不良!受盐害症状较为严重"图
#
!
1
#!而在添加
图
#
!
%
种情况下甜瓜幼苗生长情况的比较
J*#aM?:
>
;:/X
营养液"
62
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1*
盐胁迫"
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;:/X
营养液
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,
C
&#
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6*
外源脯氨酸处理
"
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营养液
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,
C
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,
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&#
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,
C
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#aM?:
>
;:/X
营养液中的甜瓜幼苗生长基本正常-
受盐害症状明显减轻"图
#
!
6
#)针对这种现象!作
者进一步研究了外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜幼苗生
长-光合作用-光合荧光参数-叶绿素含量及活性氧
物质含量的影响0(#"(!初步探讨了外源脯氨酸缓解
水培甜瓜盐胁迫伤害的生理机制)在以上研究的基
础上!本试验拟探讨盐胁迫下添加外源脯氨酸后甜
瓜幼苗叶片内脯氨酸含量和
F$63
-
IJK
-
FG?LM
活性及相关基因表达的变化!旨在阐明外源脯氨酸
对盐胁迫下甜瓜脯氨酸代谢的影响!进一步了解外
源脯氨酸缓解甜瓜盐胁迫伤害的生理和分子调节机
制!为植物耐盐胁迫研究提供重要信息)
#
!
材料和方法
:*:
!
试验材料及处理
试验于
!"#
年
$
月在江苏农林职业技术学院
园艺试验基地连栋温室内进行!供试甜瓜品种为*雪
美+7()试验以
#aM?:
>
;:/X
营养液为基础!共设
置盐胁迫"
#""99?;
,
C
&#
D:6;
#-外源脯氨酸"
#""
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,
C
&#
D:6;E"*!99?;
,
C
&#
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#
!
个处
理和对照"
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>
;:/X
营养液#!甜瓜幼苗定植于
相应栽植槽中!均采用气泵间歇通气培养!每
!X
换
#
次营养液)分别取各处理和对照植株第
"
-
!
-

-
+
-
0
天真叶进行各项指标的测定!试验
%
次重复)
幼苗嫩叶于液氮中速冻保存用于总
bDJ
提取)
KG-=?;
试剂盒-
LD:.HS
分别为美国
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>
H/
和
1S(
F86
公司产品!
Z(ZCc
反转录酶-
]
ZL#7(K
载体-
#1
2
酶等为
K:2:b:
公司产品!
LDJ
纯化试剂盒-宿
主菌大肠杆菌
KIF
#"
购自天根生化科技公司)
:;<
!
脯氨酸含量和
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!
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!
./"AB
活性测定
脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定##()
F$63
活性测定参照
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>
等#!(方法!以
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"
J
"
,
>
&#
,
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&#为一个酶活力单位"
#T
#)
IJK
活性测定参照
2-9
等#%(方法!以
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"
J
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,
@
&#为一个酶
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#T
#)
FG?LM
活性测定参照赵福庚
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"
J
+""
,
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,
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力单位"
#T
#)
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
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!
,!5
!
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基因的克隆及表达分析
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!
,!5
!
6(&78
基因的克隆
!
以
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>
(
;:/X
营养液培养"对照#的甜瓜幼苗嫩叶为材料!采
用
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试剂盒按照说明书提取总
bDJ
!
LDJ.HS
处理去除基因组
LDJ
!再以
I;-
>
?
"
XK
#为反转录引
物
Z(ZCc
反转录酶合成单链
BLDJ
)根据已报道
的甜 瓜
!"#
序 列 "
5H/1:/`
登 录 号 为
4Z
.
""0+!))
#和
$%&(
序列"
5H/1:/`
登录号为
4Z
.
""0+#!!
#利用
FG-9HGFGH9-HG$*"
软件分别
设计引物"表
#
#!
F6b
反应体系均为
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#
C
-
上下游引物"
#"
#
9?;
,
C
&#
#各
#
#
C
-
#"a A^WWHG
!*$
#
C
-
XDKF#
#
C
-
#1
2
酶
"*!
#
C
!加
XXM
!
I
至
!$
#
C
)
!"#
扩增反应参数为$
7d
预变性
%9-/
&
7d
变性
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!
$"*)d
退火
%".
!
)!d
延伸
#9-/
!
共
%$
个循环&最后
)!d
延伸
#"9-/
!
d
保存!目
的片段长度为
+7"^
]
&
$%&(
退火温度为
$!*0
d
!其余扩增参数相同!目的片段长度为
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]
)
F6b
产物以
#e
的琼脂糖凝胶电泳检测和分离!目
的片段用
LDJ
纯化试剂盒纯化后连接到
]
ZL#7(
K
载体中!转化到
KIF
#"
感受态细胞)挑取单菌落
放大培养!相同条件下进行
F6b
扩增检测!挑取阳
性克隆由上海生工生物工程有限公司完成序列测
定!在
D61S
网站进行
1CJ3K
比对)
:;C;<
!
,!5
!
6(&78
基因表达分析
!
分别从盐胁
迫处理-外源脯氨酸处理和对照第
"
-
!
-

-
+
-
0
天的
甜瓜幼苗嫩叶中提取总
bDJ
!经
L/:.HS
处理去除
基因组
LDJ
!再以
I;-
>
?
"
XK
#为反转录引物
Z(
ZCc
反转录酶合成单链
BLDJ
)以甜瓜
$%&
3
-0-4
基因"
5H/1:/`
登录号为
JO!7!%0+
#为内参基因!
根据序列设计
#
对引物"表
#
#!扩增反应参数为$
7
d
预变性
%9-/
&
7d
变性
%".
!
$!d
退火
%".
!
)!
d
延伸
%".
!共
%$
个循环&最后
)!d
延伸
#"9-/
!
d
保存!目的片段长度为
%++^
]
)
F6b
扩增产物
用
#e
琼脂糖凝胶电泳检测!根据扩增结果调整
BL(
DJ
模板浓度)分别以表
#
中
!"#
-
$%&(
引物
进行
F6b
扩增!反应体系和扩增参数同
#*%*#
!进
行半定量
F6b
表达分析)
表
:
!
甜瓜
,!5
!
6(&78
和内参
6(&
9
-*-/
基因的
.>D
引物
K:^;H#
!
F6b
]
G-9HG.?W!"#
!
$%&(:/XGHWHGH/BH$%&
3
-0-4
>
H/H.-/9H;?/
"
)*+*,-.,/0&C*
#
基因
5H/H
正向引物
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]
G-9HG
"
$f
#
%f
# 反向引物
bHYHG.H
]
G-9HG
"
$f
#
%f
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!"# JJK6KKKJKJ5J56J655K5J6 J5JK6JJKKK66J56J6JK6
$%&( 65J5KK5KKK65K5JK5K55KK J6J55K66JJJK556JK5KJKK
$%&
3
-0-4 5K65K556JJ5KKKJ65K 66JJ566KKK6JJ6JJK6
:*E
!
数据分析
试验数据结果采用
3J3
软件进行统计分析)
!
!
结果与分析
<*:
!
外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜幼苗叶片脯氨酸
含量的影响
!!
脯氨酸是一种重要的渗透调节剂!其含量的增
加对提高逆境下植物细胞液浓度-降低细胞水势-增
强吸水功能等起着重要的促进作用!逆境胁迫下植
株常通过增加脯氨酸含量提高渗透势以缓解胁迫引
起的伤害#$()图
!
显示!盐胁迫处理"
K
#
#甜瓜幼苗
叶片脯氨酸含量随处理时间呈现先上升后稍下降趋
势!并在处理
X
时达到最大值"
##)*!
#
>
%
>
#!且
在处理期间"
!
$
0X
#脯氨酸含量始终极显著高于对
照"
62
#!增幅分别为
%%*#e
-
+$*0e
-
+"*+e
和
%0*"e
&在盐胁迫下添加脯氨酸"
K
!
#进一步提高了
甜瓜幼苗叶片脯氨酸含量!也同样随处理时间呈现
先上升后稍下降变化趋势!在处理
+X
时达到最大
图
!
!
外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜幼苗叶片脯氨酸含量的影响
62*
对照"
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>
;:/X
营养液#&
K
#
*
盐胁迫"
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>
;:/X
营养液
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外源脯氨酸处理"
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C
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K@H.:9H:. H^;?[*
)%"!
#"
期 颜志明!等$外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜脯氨酸代谢的影响
值"
#%!*)%
#
>
%
>
#且各时期含量均始终高于同期
K
#
处理!升 幅 分 别 为
!0*#e
-
#!*#e
-
!!*)e
和
!7*!e
!其中第
!
-
+
-
0
天差异达到显著水平)以上
结果表明盐胁迫下甜瓜叶片内会产生较高含量的脯
氨酸以缓解逆境胁迫!盐胁迫下添加适量外源脯氨
酸能进一步增加植株内脯氨酸含量!从而增强植株
抗盐胁迫能力)
<;<
!
外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜幼苗叶片
.=>5
!
?6@
!
./"AB
活性的影响
!!
图
%
!
J
显示!甜瓜幼苗叶片
F$63
活性在
K
#
处理下随时间延长呈现先上升后稍下降的变化趋
势!在处理
X
时活性达最高"
0*#)T
#!其在处理
期间"
!
$
0X
#均极显著高于对照!增幅分别为
$7*
)e
-
0)*7e
-
$+*+e
和
7*"e
&
F$63
活性在
K
!
处
理下随时间延长也呈现先上升后稍下降的相似变化
趋势!也在处理
X
时活性达最高值"
+*7%T
#!其在
处理期间"
!
$
0X
#均低于同期
K
#
处理!其中第

天
时差异达到显著水平!但其在整个处理期间始终极
显著高于同期对照!增幅分别为
$*!e
-
$7*%e
-
#*)e
和
+*+e
)这表明盐胁迫下甜瓜幼苗叶片
内
F$63
活性会明显增加!能通过增强谷氨酸途径
促进
FG?
合成!但盐胁迫下添加外源脯氨酸对叶片
F$63
活性和谷氨酸途径具有一定抑制作用)
由图
%
!
1
可知!甜瓜幼苗叶片
IJK
活性在
K
#
处理下随时间延长呈现上升
(
小幅回落
(
再上升趋
势!并始终显著高于同期对照水平!增幅分别为
!!*%e
-
!*"e
-
#7*e
和
%#*%e
!但增幅小于
F$63
&叶片
IJK
活性在
K
!
处理下进一步提高!随
时间的变化趋势与
K
#
处理相同!但处理期间"
!
$
0X
#
IJK
活性均明显高于
K
#
处理!与
K
#
相比增幅
分别为
#0*"e
-
!)*$e
-
!*%e
和
#+*)e
!其中第

-
+
天时差异达到显著水平)可见!盐胁迫诱导甜瓜
幼苗叶片内
IJK
活性增强!在促进脯氨酸合成中
鸟氨酸途径也发挥重要作用&盐胁迫下添加脯氨酸
能更加明显提高叶片
IJK
活性-进一步增强鸟氨
酸途径促进脯氨酸合成)
由图
%
!
6
可以看出!甜瓜幼苗叶片
FG?LM
活
性在
K
#
处理
!X
后就迅速下降!在胁迫
X
时达到
最低"
$*7#T
#随后略有所回升!但各处理时期"
!
$
0X
#
FG?LM
活性与对照相比均极显著降低!降幅分
别为
*+e
-
)*$!e
-
#*7!e
和
"*%%e
&与对照
相比较!处理时期"
!
$
0X
#
K
!
处理幼苗叶片中
FG?LM
活性也显著降低但降幅均小于
K
#
处理!其
中处理第
!
和

天时分别比同期
K
#
处理显著高出
!"*"e
和
!%*)e
)可见!盐胁迫能显著地降低甜瓜
幼苗叶片
FG?LM
活性-抑制
FG?
的降解!而添加外
源脯氨酸可使盐胁迫幼苗叶片
FG?LM
活性增加!
这可能是叶片内脯氨酸含量增加引起反馈调节)
图
%
!
外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜幼苗叶片
F$63
-
IJK
和
FG?LM
活性的影响
Q-
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!
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!
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基因克隆及
D@F.>D
半定量表
达分析
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!
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!
./"AB
基因的克隆
!
反转录单链
BLDJ
后进行
F6b
扩增!分别获得与
!"#
-
$%&(
预期长
度相吻合片段"图

#!参考黄志等!+(
6/$$)7
基因
序列设计引物但未能扩增出
$$)7
片段)测序后在
D61S
网站进行
1CJ3K
比对!其中!
+7"^
]
片段与
甜 瓜
!"#
基 因 "
5H/1:/`
登 录 号 为
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.
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#只有
#
个碱基不同!相似性达
77*0+e
"图

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片段与甜瓜
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基因"
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登录号为
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#有
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相似性达到
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"图

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1
#)表明克隆到的均为
目的基因片段)
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!
,!5
和
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表达分析
!
如图
$
所示!对
照幼苗叶片中
!"#
-
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基因在
"
$
0X
阶段的
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卷
图

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$
!
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#)
K
#
处理幼苗
叶片
!"#
表达量在盐胁迫
!
$
+X
与处理前"
X
#
基本相同!直到处理
0X
时表达量才明显增加&而其
叶片
$%&(
表达量在处理
!X
就降低!于处理
X
时表达量最小!虽在处理
+
-
0X
时表达量有所回升
但仍然小于处理前"图
$
!
1
#)
K
!
处理幼苗叶片
!"#
表达量在添加脯氨酸后能迅速增加!在处理
!
$
0X
的
!"#
表达量均明显高于处理前&而其相
应的
$%&(
表达量随处理时间呈现先升后降趋
势!并在处理
!X
时表达量最大值!此后表现为逐步
减少!处理
+
-
0X
时表达量与处理前基本相同"图
$
!
6
#)可见!甜瓜幼苗叶片中
$%&(
基因在盐胁迫
下转录受到抑制!脯氨酸的降解在转录水平上受到
调控!而盐胁迫下添加脯氨酸能迅速增强
!"#
转录)
图
$
!
!"#
-
$%&(
在对照"
62
#-盐胁迫"
K
#
#和盐胁迫添加脯氨酸"
K
!
#处理甜瓜叶片中的表达
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#
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!
讨
!
论
许多研究表明!逆境胁迫下植物体可以通过积
累脯氨酸来增强其抗逆性)脯氨酸是一种重要的渗
透保护剂!不但能够防止水分散失!而且还可提高抗
氧化酶活性-清除盐胁迫产生的活性氧保护细胞膜
结构#+(#0()本试验也表明盐胁迫下甜瓜幼苗叶片内
会产生较高含量的脯氨酸以缓解逆境胁迫!盐胁迫
下添加适量外源脯氨酸能进一步增加植株内脯氨酸
含量从而增强植株抗盐胁迫能力!这与石榴-樱
桃#7(-草坪草!"(-黄瓜!#(-大豆$(和菊花!!(等结果
较为一致)
有学者!%(认为植物体内游离脯氨酸积累量的
变化在一定程度上可以反映植物抵抗逆境胁迫的能
力!盐胁迫下游离脯氨酸多集中于植物代谢旺盛的
光合器官叶片和生殖器官!其含量是其他部位的数
倍到数十倍!()因此本试验以甜瓜叶片为试验材
料较能集中反映盐胁迫下甜瓜脯氨酸的代谢调节
规律)
本试验中!盐胁迫"
K
#
处理#甜瓜幼苗叶片内脯
氨酸含量显著增加!同时
F$63
活性增幅显著!而
IJK
活性增幅相对较小!
!"#
表达量在大部分处
理时段里没有增加!因此推断在盐胁迫开始阶段甜
瓜幼苗体内脯氨酸积累主要途径是谷氨酸合成途
径!这与
CH-

!$
(和曹芳!+(结论相同)同时!盐胁迫
降低了甜瓜幼苗叶片内
FG?LM
活性!减少
$%&(
表达量!从而使脯氨酸降解受到抑制!这也导致植株
体内脯氨酸进一步积累!与段九菊!#(对黄瓜的研究
结果较为相似)
许多研究表明当植物本身产生的脯氨酸不足以
消除逆境伤害时!可以使用外源脯氨酸清除活性
氧!)(和保护酶活性+!0(以缓解逆境伤害)作者前
期研究表明在盐胁迫下添加
"*!99?;
,
C
&#外源脯
氨酸能够缓解甜瓜幼苗的盐伤害7(#"(!本研究结果
7%"!
#"
期 颜志明!等$外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜脯氨酸代谢的影响
进一步说明这与叶片内脯氨酸含量增加有关)本试
验中外源脯氨酸降低了盐胁迫下甜瓜幼苗叶片
F$63
活性的增幅!说明外源脯氨酸可以在一定程
度上抑制
F$63
活性和谷氨酸合成途径&同时!叶片
IJK
活性进一步增加!
"#
表达量也迅速增加!又
表明外源脯氨酸可以促进鸟氨酸合成途径!这可能
与外源脯氨酸能够保护
IJK
有关0()
另外!也有研究表明施用过高浓度外源脯氨酸!
不但不能缓解胁迫危害!反而会抑制植物的生长!对
植物造成伤害)如在绿豆细胞培养基中加入
!"
$
%%99?;
,
C
&#脯氨酸可以减缓
D:6;
胁迫引起的不
良反应!当浓度达到
$"99?;
,
C
&#或者更高时!细
胞生长反而受到抑制!7(&在苜蓿愈伤组织培养过程
中!
#"99?;
,
C
&#的外源脯氨酸对于缓解盐胁迫的
效果明显!但当浓度过高超过
%"99?;
,
C
&#时则抑
制愈伤组织生长甚至有毒害作用%"()因此!外源脯
氨酸作为抗逆增强剂使用须慎重!须先做预备试验
确定施用浓度范围避免发生伤害)盐胁迫下甜瓜叶
片内脯氨酸浓度始终都受合成和降解
!
种代谢途径
共同调节!使脯氨酸浓度保持在一定适宜范围内避
免过高浓度的脯氨酸可能造成的伤害)在本试验盐
胁迫条件下添加外源脯氨酸提高了甜瓜幼苗叶片
FG?LM
活性和阶段性增加
$%&(
表达量!促进了
体内脯氨酸的降解!正是这种代谢调节的体现)
综上所述!盐胁迫条件下甜瓜幼苗体内主要是
通过增强脯氨酸的谷氨酸合成途径和抑制脯氨酸降
解以增加脯氨酸含量从而缓解盐胁迫!添加适量外
源脯氨酸可增强鸟氨酸合成途径进一步增加脯氨酸
含量!从而提高甜瓜幼苗耐盐胁迫能力)下一步将
继续对盐胁迫下添加脯氨酸对脯氨酸代谢关键基因
的互作-时空表达等影响进行研究!并对盐胁迫下甜
瓜植株生长保护剂进行进一步试验和发掘)
参考文献"

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现代植物生理学实验指南
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