全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(２): ２２０￣２２４(２０１５)
收稿日期: ２０１３￣１２￣２７ꎻ 修回日期: ２０１４￣１２￣１４
基金项目: 质检公益性行业科研专项项目(２０１４１００７６)ꎻ福建省自然科学基金资助项目(２０１１Ｊ０１２４２)ꎻ福建出入境检验检疫局科技项目
(ＦＫ２０１１￣０７)
通讯作者: 廖富荣ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植物病原鉴定及检测方法研究ꎻ Ｔｅｌ:０５９２￣３２６９９１６ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｌｆｒ００５＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０２.０１５
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研究简报
火龙果细菌性软腐病菌的分离与鉴定
林武镇１ꎬ ２ꎬ 廖富荣１∗ꎬ 陈细红１ꎬ 陈 青１ꎬ 陈红运１ꎬ 黄蓬英１ꎬ 林石明１
( １厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心ꎬ厦门 ３６１０２６ꎻ ２ 福建农林大学 生物农药与化学生物学教育部重点实验室ꎬ福州 ３５０００２)
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｓｏｆｔ ｒｏｔ ｉｎ Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ ｕｎｄａｔｕｓ　
ＬＩＮ Ｗｕ￣ｚｈｅｎ１ꎬ２ꎬ ＬＩＡＯ Ｆｕ￣ｒｏｎｇ１ꎬ ＣＨＥＮ Ｘｉ￣ｈｏｎｇ１ꎬ ＣＨＥＮ Ｑｉｎｇ１ꎬ ＣＨＥＮ Ｈｏｎｇ￣ｙｕｎ１ꎬ ＨＵＡＮＧ Ｐｅｎｇ￣ｙｉｎｇ１ꎬ
ＬＩＮ Ｓｈｉ￣ｍｉｎｇ１ 　 ( １ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｘｉａｍｅｎ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ
Ｘｉａｍｅｎ ３６１０２６ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎꎬ Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ
Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｆｕｚｈｏｕ ３５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎ ５８７７￣Ａ１ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｒａｇｏｎ ｆｒｕｉｔ (Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ ｕｎｄａｔｕｓ) ｗｉｔｈ ｔｙｐｉｃａｌ ｓｏｆｔ ｒｏｔ
ｓｙｍｐｔｏｍ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｔａｉｗａｎꎬ Ｃｈｉｎａ. Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｎ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍ ｗｅｒｅ ｃｉｒｃｕｌａｒꎬ ｏｙｓｔｅｒ
ｗｈｉｔｅꎬ ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｔꎬ ｓｍｏｏｔｈ ａｎｄ ｍｕｃｏｕｓ. Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ Ｇｒａｍ￣ｎｅｇａｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｈｏｒｔ ｒｏｄ￣ｓｈａｐｅｄ ｉｎ (０.４４￣０.８８)
μｍ×(０.８３￣２.８２) μｍ. Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎｔｏ ｄｒａｇｏｎ ｆｒｕｉｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｙｉｅｌｄｅｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｓｏｆｔ ｒｏｔ
ｓｙｍｐｔｏｍ. Ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃｅａ ｂｙ Ｂｉｏｌｏｇ Ｇｅｎ ＩＩＩ ａｎｄ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ ｔｅｓｔ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｓｈａｒｅｄ ９９.９％ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ Ｅ. ａｓｂｕｒｉａｅꎬ Ｅ. ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ
ａｎｄ Ｅ. ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｙｒＢ ｇｅｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏꎬ ｂｕｔ
ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅ ｆｒｏｍꎬ Ｅ. ａｓｂｕｒｉａｅ ａｎｄ Ｅ. ｍｏｒｉ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｉｔ ｍａｙｂｅ ａｎ ｕｎｒｅｐｏｒｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ. Ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ. ｉｎ ｄｒａｇｏｎ ｆｒｕｉｔ ｆｒｏｍ Ｔａｉｗａｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓꎻ Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ ｕｎｄａｔｕｓꎻ ｓｏｆｔ ｒｏｔ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０２￣０２２０￣０５
　 　 火龙果(Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ ｕｎｄａｔｕｓ Ｂｒｉｔｔ.ｅｔ Ｒｏｓｅ)属仙
人掌科三角柱属植物ꎬ是集水果、花卉、蔬菜、保健
为一体的热带亚热带果树ꎬ在中美洲、美国南部地
区ꎬ以及以色列、越南、泰国和我国的台湾、海南、广
东、福建等地均有种植ꎮ 近年来ꎬ随着火龙果种植
面积不断扩大ꎬ火龙果病害呈逐渐加重趋势ꎬ严重
威胁火龙果的产业发展ꎮ 火龙果细菌性病害主要
由欧文氏菌 ( Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ.)、阴沟肠杆菌 ( Ｅｎｔｅｒ￣
ｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ)引起[１]ꎮ 本研究经分离纯化、利
用菌落形态特征、扫描电镜观察、致病性测定、
Ｂｉｏｌｏｇ和 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ鉴定ꎬ并结合 １６Ｓ ｒＲＮＡ
基因和 ｇｙｒＢ基因序列ꎬ对来自台湾火龙果上的细
菌分离物进行鉴定ꎬ证实该病原菌为肠杆菌属
(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)中的一个种类ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 病菌的分离与纯化
　 　 试验样品为 ２０１２年来自我国台湾的一批火龙
果种苗ꎮ 选取具有典型软腐症状的火龙果茎
杆样品ꎬ切取病健交界处组织(０.５ ｃｍ×ｌ ｃｍ) ꎬ灭
　
　 ２期 林武镇ꎬ等:火龙果细菌性软腐病菌的分离与鉴定
菌水冲洗一次ꎬ７０％(ｖ / ｖ)酒精浸泡 ２ ｍｉｎꎬ无菌水
漂洗 ３次ꎬ然后移至灭菌培养皿中ꎬ加 １ ｍＬ 无菌
水并捣碎ꎬ用接种环蘸取菌液在营养琼脂培养基
(ＮＡ)平板上划线ꎬ２８℃下培养ꎬ挑取单菌落纯化 ２
次ꎬ置于 ４℃下保存备用ꎮ 取纯化细菌进行革兰氏
染色观察ꎬ扫描电镜(ＴＭ￣１０００ꎬ日立公司)观察菌
体形态ꎮ
１.２　 致病性测定
　 　 纯化的分离物在 ＮＡ 培养基上 ２８℃培养 ２４ ｈ
后ꎬ用无菌水制成约 １×１０８ ＣＦＵ / ｍＬ 的菌悬液ꎬ采
用注射法接种健康火龙果幼苗茎杆的近地面部位ꎬ
并用灭菌脱脂棉蘸无菌水覆盖在伤口处ꎬ套袋ꎬ以
无菌水作为对照ꎮ 接种后置于光照培养箱内ꎬ在温
度为 ２８℃、相对湿度 ８０％、光照 /黑暗 １２ ｈ 条件下
培养ꎬ观察并记载发病情况ꎮ
１.３　 Ｂｉｏｌｏｇ鉴定
　 　 分离纯化后的细菌分离物转接到细菌通用培
养基(ＢＵＧ)上ꎬ３０℃培养 ２４ ｈꎬ按照 Ｂｉｏｌｏｇ操作说
明ꎬ接种到 Ｂｉｏｌｏｇ ＧＥＮ￣ＩＩＩ 微孔板中ꎬ３０℃培养后ꎬ
用 ＭｉｃｒｏＳｔａｔｉｏｎＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ / Ｍｉｃｒｏｌｏｇ ３ ( ５. ２ 版本ꎬ
ＢＩＯＬＯＧꎬ Ｉｎｃ.)进行鉴定ꎬ２次重复试验ꎮ
１.４　 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ鉴定
　 　 按照 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ( 美国布鲁克􀅰道尔顿
公司)要求进行样品制备、点靶以及样品质谱图的
获取ꎬ并运用 ＢｉｏＴｙｐｅｒ 分析软件对所获取的质谱
图进行分析ꎬ通过匹配值的大小对细菌种类鉴定结
果进行判定ꎮ
１.５　 分子生物学鉴定
　 　 利用引物 Ｐ０ｍｏｄ(ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧ)和
ＰＣ５(ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ)进行 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基
因的 ＰＣＲ扩增[２]ꎮ 利用引物 ｇｙｒＢ ０１￣Ｆ (ＴＡＡＲＴ￣
ＴＹＧＡＹＧＡＹＡＡＣＴＣＹＴＡＹＡＡＡＧＴ)和 ｇｙｒＢ ０２￣Ｒ
(ＣＭＣＣＹＴＣＣＡＣＣＡＲＧＴＡＭＡＧＴＴ)进行 ｇｙｒＢ 基
因的 ＰＣＲ 扩增ꎬ利用引物 ｇｙｒＢ ０７￣Ｆ(ＧＴＶＣＧＴＴ
ＴＣＴＧＧＣＣＶＡＧ) 和 ｇｙｒＢ ０８￣Ｒ ( ＣＴＴＴＡＣＧＲＣＧ
ＫＧＴＣＡＴＷＴＣＡＣ)进行测序[３]ꎮ ＰＣＲ 产物由宝生
物工程(大连)有限公司回收纯化后进行直接测
序ꎮ 用 ＢＬＡＳＴ、 Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ ( ｈｔ￣
ｔｐ: / / ｒｄｐ. ｃｍｅ. ｍｓｕ. ｅｄｕ / ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ / ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ. ｊｓｐ) 和
Ｍｅｇａ ５.０５软件进行序列分析ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 细菌的菌落特征及细胞形态
　 　 从发病植物组织中分离到一株编号为 ５８７７￣
Ａ１的细菌分离物ꎬ该分离物在 ＮＡ 培养基上特征
为:菌落圆形、乳白色、突起、表面光滑、粘液状ꎮ 革
兰氏染色为阴性ꎬ菌体短杆状、两端钝圆ꎬ大小为
(０.４４~０.８８) μｍ×(０.８３~２.８２) μｍ(图 １)ꎮ
Ｆｉｇ. １ 　 Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈ ｏｆ ５８７７￣Ａ１ (１００００×)
Ｂａｒ＝ １０ μｍ.
２.２　 致病性测定
　 　 用分离纯化自火龙果的 ５８７７￣Ａ１ 接种火龙果
幼苗ꎬ５ ｄ 后火龙果幼苗茎杆出现明显软腐、倒伏
症状ꎬ其症状与自然发病的症状相似(图 ２￣Ｂ)ꎬ而
用无菌水接种的对照火龙果幼苗未发病 (图 ２￣
Ｃ)ꎮ 从接种发病的组织重新分离细菌ꎬ经分离培
养、 Ｂｉｏｌｏｇ鉴定ꎬ分离到相同的细菌ꎮ
２.３　 Ｂｉｏｌｏｇ鉴定结果
　 　 采用 Ｂｉｏｌｏｇ的 ＧｅｎＩＩＩ微孔板对 ５８７７￣Ａ１ 进行
鉴定ꎬ种类鉴定结果为阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ)ꎮ
其中ꎬ培养 ２４ ｈ 后的相似值(ＳＩＭ)分别为 ０.６５８、
０.６０４ꎻ３６ ｈ后分别为 ０.７０４、０.６６１ꎻ２ 个时间点均未
给出可信值(ＰＲＯＢ)ꎻ革兰氏阴性ꎮ
２.４　 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ鉴定结果
　 　 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ 鉴定结果表明ꎬ５８７７￣Ａ１ 与
数据库中 Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ 的 ３９９２ ＸＭＣＩＱ 菌株和
２ ０１０１２ＸＭＣＩＱ菌株的匹配值最高ꎬ分别为２.３８６
１２２
　
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ２　 Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｏｆｔ ｒｏｔ ｏｎ ｄｒａｇｏｎ ｆｒｕｉｔ
Ａ: Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｄｒａｇｏｎ ｆｒｕｉｔ ｓｅｅｄｉｎｇꎻ Ｂ: Ｓｙｍｐｔｏｍ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ５ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ５８７７￣Ａ１ꎻ Ｃ: ＣＫ.
和 ２.２７５ꎬ蛋白质谱图与数据库中的 ３９９２ ＸＭＣＩＱ
菌株匹配高度符合ꎮ 根据 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ 对细
菌种类的判定依据(匹配值在 ２.３￣３之间)ꎬ可以把
５８７７￣Ａ１分离物鉴定为阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ)ꎮ
２.５　 分子鉴定
２.５.１　 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列分析 　 利用通用引物
进行 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列的 ＰＣＲ扩增ꎬ经双向测序
后得到 １ ４４９ ｂｐ 的核苷酸序列(ＧｅｎＢａｎｋ 登录号:
ＫＦ９３２２６４)ꎮ 经 Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ对该序
列进行分析ꎬ其分类地位为:肠杆菌科(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ￣
ｔｅｒｉａｃｅａｅ)、肠杆菌属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)ꎮ 序列分析表
明ꎬ该序列与肠杆菌属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ.)的 １６Ｓ
ｒＲＮＡ基因序列相似性最高ꎬ在 ９５.２％ ~ ９９.９％之
间ꎮ 其中ꎬ该分离物序列与阿式肠杆菌(Ｅ. ａｓｂｕｒｉ￣
ａｅ ＪＣＭ６０５１)、生癌肠杆菌(Ｅ. ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ ＬＭＧ
２６９３) 、霍氏肠杆菌(Ｅ. ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ ＣＩＰ １０３４４１)的
序列同源性最高ꎬ均达到 ９９.９％ꎻ与路德维希肠杆
菌(Ｅ. ｌｕｄｗｉｇｉｉ ＥＮ￣１１９Ｔ)的序列同源性为 ９９.７％ꎻ
与溶解肠杆菌(Ｅ. ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ ＬＭＧ ２６８３)的同源性
为 ９９.２％ꎻ与阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ ＡＴＣＣ１３０４７)、
阴沟肠杆菌亚种(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ. ｃｌｏａｃａｅ ＡＴＣＣ
１３０４７ )、 日 本 肠 杆 菌 (Ｅ. ｋｏｂｅｉ ＣＩＰ １０５５６６) 、
Ｅ. ｓｏｌｉ ＬＦ７的同源性均为 ９８.９％ꎮ
２.５.２　 ｇｙｒＢ基因序列分析　 对扩增的 ｇｙｒＢ基因进
行直接测序ꎬ得到 ９７４ ｂｐ 的核苷酸序列(ＧｅｎＢａｎｋ
登录号 ＫＦ８７１１１５)ꎮ 序列分析表明ꎬ该序列与肠杆
菌属 (Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)的 ｇｙｒＢ 基因序列同源性在
８２.９％~ ９６.５％之间ꎮ 其中ꎬ与桑树肠杆菌(Ｅ. ｍｏｒｉ
ＬＭＧ ２５７０６)的序列同源性最高ꎬ为９６.５％ꎻ与阿式肠
杆菌 (Ｅ. ａｓｂｕｒｉａｅ ＤＳＭ １７５０６)的序列同源性为
９５.８％ꎻ与阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ ＡＴＣＣ１３０４７)、霍
氏肠杆菌(Ｅ. ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ ＣＣＵＧ ２７１２６)、日本肠杆
菌(Ｅ. ｋｏｂｅｉ ＤＳＭ １３６４５)、路德维希肠杆菌(Ｅ. ｌｕｄ￣
ｗｉｇｉｉ ＬＭＧ ２３７６８)的序列同源性分别为 ９４. ２％、
９４.１％、９４. １％、 ９３. ７％ꎻ与阴沟肠杆菌溶解亚种
(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ. ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ)的 ＳＤＭ、ＬＭＧ ２６８３
菌株序列同源性分别为 ９３.９％、９３.８％ꎮ
　 　 根据 ｇｙｒＢ基因进行系统发育分析表明ꎬ植物
病原细菌主要分布于 ３个类群中ꎬ而 ５８７７￣Ａ１属于
阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ)、阴沟肠杆菌溶解亚种
(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ. ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ ) 和 桑 树 肠 杆 菌
(Ｅ. ｍｏｒｉ)所在类群ꎬ且与桑树肠杆菌(Ｅ. ｍｏｒｉ)的
ＬＭＧ ２５７０６菌株显示出最近的亲缘关系(图 ３)ꎮ
２２２
　
　 ２期 林武镇ꎬ等:火龙果细菌性软腐病菌的分离与鉴定
Ｆｉｇ. ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｙｒＢ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ ２６ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ ａｎｄ ５８７７￣Ａ１ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ ａｌｏｎｇ ｔｈｅ ｂｒａｎｃｈｅｓ ａｒｅ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ １０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ.
“∗” ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ.
２.６　 种的鉴定结果
　 　 从腐烂的火龙果茎杆上分离的 ５８７７￣Ａ１ 接种
火龙果幼苗后表现出强致病性ꎬ在 ＮＡ培养基上具
有肠杆菌属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)典型的生长特征ꎬ革兰
氏阴性ꎬ菌体短杆状ꎬＢｉｏｌｏｇ 和 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ
鉴定为阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ)ꎬ１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序
列分析结果显示与肠杆菌属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)的植物
病原菌种类具有很近的亲缘关系ꎬ而 ｇｙｒＢ 基因序
列分析结果则显示与植物致病菌桑树肠杆菌
(Ｅ. ｍｏｒｉ)和非致病菌阿式肠杆菌(Ｅ. ａｓｂｕｒｉａｅ)亲
缘关系最近ꎬ但独立形成一个小分支ꎮ 综合以上结
果ꎬ把分离自火龙果茎杆上的 ５８７７￣Ａ１鉴定为肠杆
菌属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ)中的一个种类ꎬ具体的分类地
位还需要进一步试验证实ꎮ
３　 讨论
　 　 肠杆菌属与植物相关的细菌主要有两类:一类
为植物致病菌ꎬ如生癌肠杆菌(Ｅ. ｃａｎｃｅｒｏｇｅｎｕｓ)、
阴沟肠杆菌 (Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ)、 阴 沟 肠 杆 菌 溶 解
亚种(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ ｓｕｂｓｐ. ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ)、超压肠杆菌
３２２
　
植物病理学报 ４５卷
(Ｅ. ｎｉｍｉｐｒｅｓｓｕｒａｌｉｓ)、梨形肠杆菌(Ｅ. ｐｙｒｉｎｕｓ)、中间
肠杆菌(Ｅ. ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ)和桑树肠杆菌(Ｅ. ｍｏｒｉ)ꎻ另
一类为非致病菌ꎬ如成团肠杆菌(Ｅ. ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ)、
水稻肠杆菌(Ｅ. ｏｒｙｚａｅ)、阿式肠杆菌(Ｅ. ａｓｂｕｒｉａｅ)、
路德维希肠杆菌 (Ｅ. ｌｕｄｗｉｇｉｉ)、水稻肠杆菌 (Ｅ.
ｏｒｙｚａｅ ) 和 Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｃｉｎｃｉｔａｎｓꎮ Ｍａｓｙａｈｉｔ
等[１]报道阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ)可引起火龙果细
菌性软腐病ꎬ果园发病率可达 ３６％ꎮ 本研究经过培
养特征、扫描电镜观察、致病性测定、Ｂｉｏｌｏｇ 和
ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ 鉴定ꎬ并结合 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因和
ｇｙｒＢ基因序列分析ꎬ证实了从台湾火龙果茎杆上分
离的ꎬ引起软腐病的病原菌为肠杆菌属(Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ￣
ｔｅｒ)中的一个种类ꎮ
　 　 Ｂｉｏｌｏｇ和ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ是 ２种基于不同原
理的微生物鉴定方法ꎬ这 ２种方法均可以把所分离
的 ５８７７￣Ａ１ 细菌分离物鉴定到种的水平ꎮ 采用
Ｂｉｏｌｏｇ的 ＧｅｎＩＩＩ 微孔板把 ５８７７￣Ａ１ 分离物鉴定为
阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ)ꎬ但是 ２４ 和 ３６ ｈ 后的相
似值比较低ꎬ且 ２ 个时间点均未给出可信值
(Ｐｒｏｂ)ꎮ 而ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ鉴定结果中的匹配值
也比较低ꎬ刚好处于种类判定的阈值附近(略大于
２.３)ꎮ 因此ꎬ该 ２ 种方法对 ５８７７￣Ａ１ 种类鉴定结果
的可信度比较低ꎬ预示该分离物只是阴沟肠杆菌比
较接近的一个种类ꎬ而并非阴沟肠杆菌ꎮ
　 　 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列是细菌分类的重要依据ꎬ
Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ 等提出的种水平划分标准为: １６Ｓ
ｒＲＮＡ基因序列总长在 １ ３００ ｂｐ以上ꎬ且连续匹配相
似度在 ９８.７％以上[４]ꎮ 在本研究所比较的 ２８ 种肠
杆菌属模式种菌株中ꎬ１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列同源性在
９５.２％~ ９９.８％ꎬ多个种类之间的序列同源性高于
９８.７％ꎬ难以区分这些序列同源性很高的种类ꎮ 本研
究所分离的 ５８７７￣Ａ１分离物与阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａ￣
ｃａｅ ＡＴＣＣ１３０４７ )、 阿 式 肠 杆 菌 (Ｅ. ａｓｂｕｒｉａｅ
ＪＣＭ６０５１)等 ９种模式菌株的 １６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列同
源性均高于 ９８.７％ꎬ而没有办法对种类进行准确的
鉴定ꎮ 在肠杆菌科中ꎬｇｙｒＢ 基因可以把 １６Ｓ ｒＲＮＡ
基因序列无法明确区分的肠杆菌、柠檬酸菌和克雷
伯氏菌种类进行明显区分[５]ꎮ 根据各模式菌株的
ｇｙｒＢ基因序列分析结果ꎬ本研究所分离的 ５８７７￣Ａ１
处于一个大分支中ꎬ包括阴沟肠杆菌(Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ)、
阿式肠杆菌(Ｅ. ａｓｂｕｒｉａｅ)、桑树肠杆菌(Ｅ. ｍｏｒｉ)、霍
氏肠杆菌(Ｅ. ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ)、日本肠杆菌(Ｅ. ｋｏｂｅｉ)、
路德维希肠杆菌(Ｅ. ｌｕｄｗｉｇｉｉ)ꎮ 其中ꎬ与桑树肠杆菌
(Ｅ. ｍｏｒｉ)和阿式肠杆菌(Ｅ. ａｓｂｕｒｉａｅ)构成一个小分
支ꎬ显示出最近的亲缘关系ꎬ但相对独立为一个分
支ꎮ 暗示所分离的 ５８７７￣Ａ１很可能为肠杆菌属中的
一个新的种类ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｍａｓｙａｈｉｔ Ｍꎬ Ｓｉｊａｍ Ｋꎬ Ａｗａｎｇ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｏｆｔ ｒｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｎ ｄｒａｇｏｎ ｆｒｕｉｔ (Ｈｙｌｏｃｅｒｅｕｓ
ｓｐｐ.) ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ｉｎ ｐｅｎｉｎｓｕｌａｒ
Ｍａｌａｙｓｉａ [ Ｊ] . Ｉｎｔ. Ｊ. Ａｇｒｉｃ. Ｂｉｏｌ. ꎬ ２００９ꎬ １１: ６５９－
６６６.
[２] 　 Ｗｉｌｓｏｎ Ｋ Ｈꎬ Ｂｌｉｔｃｈｉｎｇｔｏｎ Ｒ Ｂꎬ Ｇｒｅｅｎｅ Ｒ Ｃ. Ａｍｐｌｉｆｉ￣
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ １６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｍｅｒ￣
ａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣
ｇｙꎬ １９９０ꎬ ２８(９): １９４２－１９４６.
[３] 　 Ｂｒａｄｙ Ｃꎬ Ｃｌｅｅｎｗｅｒｃｋ Ｉꎬ Ｖｅｎｔｅｒ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ
ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ｐｌａｎｔｓꎬ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ (ＭＬＳＡ) [Ｊ] . Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ ３１(６): ４４７－４６０.
[４] 　 Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ Ｅꎬ Ｅｂｅｒｓ Ｊ. Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｒｅｖｉｓｉ￣
ｔｅｄ: ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ [ Ｊ ] . Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙꎬ ２００６ꎬ ３３(４): １５２.
[５] 　 Ｄａｕｇａ Ｃ. Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｙｒＢ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ: ａ ｍｏｄｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ [ Ｊ ] . Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
２００２ꎬ ５２(２): ５３１－５４７.
责任编辑:于金枝
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