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Genetics and molecular markers of resistance to Rice black-streaked dwarf virus in maize (Zea mays L.)

玉米抗粗缩病遗传及分子标记研究



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  44(6): 713 ̄717(2014)
收稿日期: 2013 ̄03 ̄28ꎻ 修回日期: 2013 ̄09 ̄09
基金项目: 河北省自然科学基金(玉米抗粗缩病基因分子标记的建立)(C2009001328)ꎻ 国家科技重大专项(2011ZX08003 ̄001)
通讯作者: 邸垫平ꎬ 副研究员ꎬ主要从事植物病毒研究ꎻ Tel: 0312 ̄5915683ꎬ E ̄mail: chmrdv@163.com
苗洪芹ꎬ 研究员ꎬ主要从事植物病毒研究ꎻ Tel: 0312 ̄5915683ꎬ E ̄mail: miao5058345@163.comꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2014.06.021
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研究简报
玉米抗粗缩病遗传及分子标记研究
杨 菲ꎬ 邸垫平∗ꎬ 苗洪芹∗ꎬ 路银贵ꎬ 张爱红ꎬ 田兰芝
(河北省农林科学院植物保护研究所ꎬ河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心ꎬ
农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室ꎬ 保定 071000)
Genetics and molecular markers of resistance to Rice black ̄streaked dwarf virus in
maize (Zea mays L.)   YANG Feiꎬ DI Dian ̄pingꎬ MIAO Hong ̄qinꎬ LU Yin ̄guiꎬ ZHANG Ai ̄hongꎬ
TIAN Lan ̄zhi  (Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciencesꎬ IPM Center of Hebei
Provinceꎬ Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North Chinaꎬ Ministry of Agricultureꎬ
Baoding 071000ꎬ China)
Abstract: Maize rough dwarf disease caused by Rice black ̄streaked dwarf virus (RBSDV) is transmitted by
planthopper in China. Identification and development of resistant hybrids are complicated because of the
inconsistencies in viral disease pressure every year. Marker ̄assisted selection can provide means for main ̄
taining virus resistance alleles even in the absence of disease. In this paper a F2 segregation population was
constructed to identity the molecular markers linked to the resistance gene using a cross between a resistant and
a susceptible parents (Qi319×Ye107) . Fifteen ̄day ̄old seedlings of F2 population were exposed to small brown
planthoppers carrying RBSDV for 3 days in specific inoculation chamber. The inoculated plants were
transplanted to screenhouse after removing the insects completely. In plant maturity stage the disease resistance
of all the individuals were visually assessed. The results showed that 17ꎬ 8ꎬ 11ꎬ 51 and 122 plants were scaled
from 0 ̄4 respectivelyꎬ in which 0 means no symptoms and 4 represents highly susceptible. Chi ̄square test
demonstrated that the segregation ratio of phenotype was 1∶15 ( resistant: susceptible) or 1 ∶ 6 ∶ 9( resistant ∶
moderate ∶ susceptible) in the F2 populationꎬ indicating RBSDV resistance of maize was controlled by two
recessive genes. The F2 individuals DNA were extracted and 261 SSR ( simple sequence repeat) primers
derived from maize genome ten chromosomes were selected from maize GDB database to construct genetic
linkage map. The linkage map consisted of 71 polymorphic SSR markersꎬ spanning a genetic distance of 996.
6 cM with an average interval of 14.0 cM between adjacent markers. The resistant and susceptible gene pools
were set up for BSA (bulked segregant analysis) and 6 polymorphism markers were obtained with BSA ̄SSR
method between the two pools. The F2 individuals were further analyzed with 6 polymorphism markers.
Chi ̄square test showed that phi 051ꎬ umc1407 and umc1432ꎬ mapped on chromosome 7 and 10ꎬ exhibited
segregation distortion significantly and very significantly in susceptible individuals. These three SSR markers
were identified as potential markers linked to the resistant loci.
Key words: Rice black ̄streaked dwarf virusꎻ SSR markersꎻ resistance genetics
 
植物病理学报 44卷
文章编号: 0412 ̄0914(2014)06 ̄0713 ̄05
    玉米粗缩病在我国玉米产区流行甚广ꎬ危害持
续严重ꎬ培育和应用抗病品种是防治该病害最经济
高效的措施ꎮ 玉米粗缩病的抗性表现为数量性状
遗传特征ꎬ采用传统育种方法进行抗病品种选育是
一项繁琐而复杂的工作ꎮ 分子标记辅助选择
(Maker Assisted SelectionꎬMAS) 不受环境因素的
影响ꎬ可以进行早期选择和对隐性基因的选择ꎬ从
而可以减少大量的田间试验工作ꎬ促进抗病基因的
合理、快速利用ꎬ特别是对于易流行又难以接种鉴
定的病害更有事半功倍之效ꎮ 目前已鉴定和筛选
了玉米抗粗缩病基因的 RAPD、SSR、STS、SCAR
等数个 DNA标记[1]ꎬ但仍然难以满足抗病育种的
需要ꎬ开发更多与抗病基因紧密连锁的实用、高效
分子标记对于促进抗粗缩病育种具有重要意义ꎮ
本文采用人工接种方法对 F2群体进行抗病性鉴
定ꎬ分析玉米抗粗缩病遗传规律ꎬ检测与抗病基因
连锁的分子标记ꎬ为玉米抗粗缩病分子辅助育种提
供依据ꎮ
1  材料与方法
1. 1  试验材料
    在抗粗缩病性鉴定研究的基础上ꎬ以抗病自交
系齐 319为母本与父本感病自交系掖 107 杂交获
得 F1代ꎬF1代自交获得 F2群体ꎮ
1. 2  试验方法
1. 2. 1   抗性遗传分析   在温度 25 ±1°C、光照
14L ∶ 10D、湿度 70±5%的条件下ꎬ人工饲养繁殖无
毒灰飞虱ꎬ在感染 RBSDV的小麦绿矮病株上饲毒
3 dꎬ而后转至健康小麦上饲养度过循回期ꎮ 25 d
后参照 Di等[2]报道的方法接种 F2群体ꎬ抽雄孕穗
期按照 0~4级标准[3]调查每株病情ꎬ统计 F2群体
中抗、感病个体数ꎬ用 χ2检验方法分析遗传分离比
例ꎮ
1. 2. 2  基因型分析和遗传作图   利用 CTAB 法
分别提取亲本、F1代和 F2群体单株叶片基因组
DNAꎮ 从 Maize GDB 数 据 库 ( http: / / www.
maizegdb.org / ssr.php)选取覆盖玉米基因组 10 条
染色体的 261 对 SSR 引物ꎬ以亲本、F1和 F2群体
DNA为模板进行 PCR 扩增ꎬ反应产物经 6%非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳ꎬ银染法检测ꎬ分析记录基
因型ꎮ 利用作图软件 MAPMAKER / EXP 3.0 进行
遗传作图ꎬ运行WinQTLCart绘制连锁图ꎮ
1. 2. 3  玉米抗粗缩病 BSA ̄SSR 分析  分别选取
10株 F2群体抗性表型为 0 级和 4 级植株的 DNAꎬ
等量混合组成抗、感基因池ꎬ筛选在抗、感池间存在
多态性的 SSR 引物ꎮ 利用抗、感池间表现多态的
SSR引物检测 F2群体中 2 ~ 4 级病株的基因型ꎬ统
计分离比例ꎬ进行 χ2适合度检验ꎬ筛选出在 F2感病
群体中表现为偏分离的分子标记ꎬ并对照亲本基因
型确定与抗粗缩病基因紧密连锁的 SSR标记ꎮ
2  结果与分析
2. 1  齐 319×掖 107 F2群体抗性鉴定及遗传分析
    采用人工接种方法准确鉴定了 209 株 F2群体
植株抗病性ꎬ其中 17 株没有症状ꎬ为 0 级ꎬ即抗玉
米粗缩病ꎻ其他 192 株均表现典型玉米粗缩病症
状ꎬ其中 1、2、3 级病株数分别为 8、11、51ꎬ合计 70
株ꎬ4级病株数为 122ꎮ χ2适合度检验表明 F2群体
分离比例为 1∶15(抗病:感病) (χ2 = 1.27<χ20.05(1)
= 3.84)和 1∶6∶9(抗病:感病:高感)(χ2 = 2.25<χ20.05
(2)= 5.99)(表 1)ꎬ推断玉米粗缩病抗性由 2 对隐
性主基因控制ꎮ
2. 2  多态性引物筛选和遗传作图
    从 261对 SSR引物中筛选获得 152 对双亲间
多态性引物ꎬ多态性频率为 58.24%ꎮ 选择标记带
型清晰、差异明显的76对引物检测随机选取的
Table 1  Resistance evaluation and segregation for F2 population of Qi319×Ye107
No. of resistant individuals No. of moderate individuals No. of susceptible individuals Segregation ratio c2
17 70 122 1: 6: 9 2.25
17 192 1 ∶ 15 1.27
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  6期 杨 菲ꎬ等:玉米抗粗缩病遗传及分子标记研究
Fig. 1  Genetic linkage map for SSR markers
Note: _ indicates that the locations of markers were different from those in IBM2 Neighbors Map 2008. ∗ and ∗∗ indicate
that markers showed segregation distortion (P<0.05) and significant segregation distortion (P<0.01) respectively.
134株 F2群体单株ꎬ获得 77个多态性标记ꎬ其中引
物 p ̄bnlg1037检测到 2 个标记ꎬ不存在共分离现
象ꎬ分别记为 bnlg1037 和 bnlg103aꎮ χ2分析显示
11个标记在 F2群体中表现为偏分离(P<0.05)ꎮ
利用 71 个分子标记构建了包含 12 个连锁群的遗
传连锁图(图 1)ꎬ覆盖玉米基因组的 39.9%ꎬ12 个
连锁群分别定位到 1~8、10 号染色体上ꎬ每条染色
体定位的标记数为 4 ~ 12 个ꎬ标记间平均距离为
14.0 cMꎬ总长 996.6 cMꎮ 标记在连锁群中的位置
及排序与已发表的数据基本一致ꎮ
2. 3  玉米抗粗缩病基因分子标记的筛选
    用构建连锁图的分子标记检测抗、感池ꎬ其中
bnlg1662、 umc2162、 phi123、 phi051、 umc1407 和
umc1432 等 6 个标记在 F2抗、感池之间表现出多
态性ꎮ 分别用这 6 个多态性标记分析 122 株 2 ~ 4
级 F2感病单株ꎬ经 χ2适合度检验表明 phi051、
umc1407、umc2162和 umc1432标记在 F2感病群体
中显著或极显著偏离共显性理论分离比例(表 2)ꎮ
标记 phi051、umc1407和 umc1432的抗病基因池电
泳带型与抗病亲本齐319带型一致 (图2 ) ꎬ而
Fig. 2  The results detected between F2
resistant and susceptible gene pools with
SSR markers linked to the resistant loci
1: phi051ꎻ 2: umc1407ꎻ 3: umc1432ꎻ P1 : Qi319ꎻ P2 :
Ye107ꎻ R: Rresistant gene poolꎻ S: Susceptible gene pool.
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植物病理学报 44卷
Table 2  Segregation of polymorphic SSR markers in susceptible individuals of F2 population
Marker Chr. Genotype
Disease grade
2 3 4
Sum Total χ2
phi051 7
A 0 11 33 44
B 0 9 19 28
H 2 8 40 50
122 8.16∗
umc1407 7
A 0 10 32 42
B 0 9 18 27
H 1 9 38 48
117 7.26∗
umc1432 10
A 0 5 16 21
B 0 4 19 23
H 2 19 57 78
122 9.54∗∗
bnlg1662 2
A 0 0 32 32
B 2 10 20 32
H 0 15 36 51
115 1.47
umc2162 6
A 0 3 18 21
B 0 10 28 38
H 2 9 27 38
97 10.51∗∗
phi123 6
A 0 6 19 25
B 1 3 15 19
H 1 12 31 44
88 0.82
Note:∗at 0.05 significant levelꎻ ∗∗ at 0.01 significant level.
umc2162标记抗病基因池带型与感病亲本掖 107
一致ꎬ因此 phi051、umc1407 和 umc1432 与抗玉米
粗缩病基因连锁ꎮ
3  讨论
    玉米粗缩病田间发病时空分布很不均匀ꎬ基于
田间自然发病的表型筛选需要多年多点抗性鉴定ꎬ
分子标记辅助筛选可以提高选择的效率ꎮ Michel ̄
more等[4]在莴苣抗病性研究中提出了群体分离分
析法(BSA)ꎬ该方法从近等基因系分析法演化而
来ꎬ是快速获得与目标基因连锁分子标记的有效方
法ꎮ 本文采用 BSA ̄SSR方法获得 3个抗粗缩病基
因分子标记 phi051、umc1407 和 umc1432ꎬ并且分
别检测了 16个玉米自交系ꎬ标记基因型与性状值
相符合的比例分别为 62.50%、43.75%和 81.25%
(未发表)ꎬ因此标记 phi051、umc1432 可以用于分
子标记辅助筛选ꎬ促进抗粗缩病品种的选育ꎮ
Luan等[5]利用自交系 90110 鉴定的 2 个抗病基因
位点位于 bin 7.02 和 bin 10.05 区域ꎬ与本文获得
的抗性基因标记位于相同染色体的临近区域ꎬ二者
可能为相同抗病位点ꎬ但因材料和标记密度不同而
存在差异ꎬ在抗病基因区域构建高密度分子标记连
锁图ꎬ精细定位抗粗缩病基因ꎬ可以提高分子标记
辅助育种的可靠性ꎮ
    玉米粗缩病抗性为数量遗传性状ꎬ因而近 200
份玉米自交系 2年田间自然鉴定的病情指数表现为
2.47%(沈 137) ~87.32%(8902)连续变异(未发表)ꎮ
本文采用的亲本材料齐 319、掖 107、F1代杂交组合
田间自然鉴定平均病情指数分别为 6. 74%、
72.14%、21.70%ꎬ杂交组合病株多表现为 0 ~ 3 级ꎬ
但 F2群体接种鉴定显示玉米粗缩病抗性具有质量
性状特征ꎬ表明抗性遗传中存在主效基因ꎬ玉米粗
缩病抗性遗传模型需要进一步验证分析ꎮ
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  6期 杨 菲ꎬ等:玉米抗粗缩病遗传及分子标记研究
参考文献
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责任编辑:杨爱东
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