全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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$
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-/001-#"""+("!$-!"#$-#"-#&(
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收稿日期$
!"#$+"+#,
&修改稿收到日期$
!"#$+",+!!
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基金项目$国家自然科学基金"
%#(""&&
!
%##"",&
#&甘肃省自然科学基金"
#!",2345!,
#
!!
作者简介$张腾国"
#&*#)
#!男!博士!教授!主要从事抗逆生理及分子生物学研究
6+78/9
$
:;81
<
=>1
<<
?@
!
#%-A@7
白菜型油菜
1%2
基因克隆及功能分析
张腾国!聂亭亭!陈琼琼!毛玉珊
"西北师范大学 生命科学学院!兰州
*%""*"
#
摘
!
要$利用
25B6
技术从(陇油

号)油菜中克隆得到
#
个新的
!"#
"
B+C>
D
>8=E/1F/1
<
G8A=@C
#基因"
H>1I81J
登录
号为
KL&*(&#
#!全长
#"""E
D
!其中包括
$M+NO2##(E
D
!
%M+NO2!(#E
D
!开放阅读框
($E
D
!编码
!#$
个氨基酸!
推测的蛋白质分子量
!%-,JP
!理论等电点为
(-,
在氨基酸序列水平上!该基因与多种植物具有较高的一致性!
其中与萝卜*紫茎泽兰*卷果涩荠和拟南芥的一致性分别为
&%-$Q
*
,%-*Q
*
,#-"Q
*
&-"Q
实时荧光定量
LB2
分析表明!
"#
基因在油菜的茎*叶和下胚轴中均有表达!没有组织特异性&该基因表达受低温*
5I5
*
R
!
S
!
诱导!
T5LKK
抑制剂
N"#!
预处理
#!;
再经低温*
5I5
*
R
!
S
!
诱导!与单独处理结果相比!
!"#
基因表达明显降低!
表明该基因在油菜适应低温*
5I5
*
R
!
S
!
胁迫过程中发挥作用
关键词$油菜&
!"#
基因&分子克隆&表达分析
中图分类号$
U*,$
&
U*,
!!!
文献标志码$
5
$%"&(#"))!*+,-(.,#/(#")"01%21.).0,"2%($33-"$"$4
5
)3#(-3
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BR6VU/@1
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T5SY?0;81
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!
V@C=;\>0=V@C789N1/]>C0/=
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B;/18
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34%(,-(
$
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*
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^
25B6-O;>G?9+9>1
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APV5@G!"#
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#
\80#"""E
D
!
A@1=8/1>F8$M+NO2@G##(E
D
!
8%M+NO2@G!(#
E
D
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81F8($E
D
@
D
>1/1
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C>8F/1
<
GC87>-O;>F>F?A>F
D
C@=>/1\80!#$87/1@8A/F0\/=;7@9>A?98C\>/
<
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D
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X
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*
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2
3
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*
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6%7(57)%&(5$
*
54+&81F2$%845
*
&&,.%7%/%
"
&%-$Q
!
,%-
*Q
!
,#-"Q81F*&-"Q
#
-2O+LB28189
^
0/0C>]>89>F=;8=!"#\>C>>_
D
C>00>F/1=;>0=>70
!
9>8]>0
!
81F;
^
+
D
@A@=
^
90\/=;897@0=1@=/00?>0
D
>A/G/A/=
^
-O;>=C810AC/
D
=9>]>9@G!"#\80/1AC>80>F/1C>0
D
@10>=@A@9F
!
5I581FR
!
S
!
0=C>00-R@\>]>C
!
T5LKK/1;/E/=@CN"#!
D
C>=C>8=7>1=#!;E>G@C>A@9F
!
5I581FR
!
S
!
0=C>00
!
=;>>_
D
C>00/@19>]>9@G!"#\800/
<
1/G/A81=9
^
F>AC>80>FA@7
D
8C>F\/=;=;>0/1
<
9>0=C>00-O;>C>0?9=0
0?
<<
>0=>F=;8=!"#
D
98
^
>F81/7
D
@C=81=C@9>F?C/1
<
A@9F
!
5I581FR
!
S
!
0=C>00/1"9(%)
*
+&,$&-
5.
6
7",!%
$
"$%&&(%(%)
*
+&,$&
&
!"#
<
>1>
&
7@9>A?98CA9@1/1
<
&
>_
D
C>00/@18189
^
0/0
!!
植物为了维持正常的生长和发育!需要不断地
感知和适应外界环境的变化低温是主要的环境胁
迫因素之一!当受到低温胁迫时!绝大多数植物需要
经过一段低温驯化过程以获得对低温的耐受能力
在植物响应低温胁迫的驯化过程中!可引起自身生
理生化和分子水平上的变化+#,!包括细胞和组织结
构的改变*新陈代谢过程以及基因表达水平的变化
等+!,!其中以低温激活或抑制基因的转录最为重要
拟南芥中受低温调节的基因占基因组的
(Q
"
!"Q
+
%
,
!其中有一类低温胁迫响应基因
!:-
"
A@9F
C>0
D
@10/]>
#!其启动子区有干旱反应元件
P26
%
B2O
!拥有共同的核心基序"
BBH5B
#
Z=@AJ/1
<
>C
等+(,从拟南芥中分离得到了能够结合干旱反应元件
P26
%
B2O
的转录因子
P26I#
%
BI`

BI`
是一类
5L!
%
626IL
"
5
D
>=898!
%
>=;
^
9>1>+C>0
D
@10/]> >9>+
7>1=E/1F/1
C@=>/1
#类
PV5
结合蛋白!其一级结
构含有
5L!
%
626IL
的
PV5
结合域!可以和
!:-
基因启动子中顺式作用元件
B2O
%
P26
"
B+C>
D
>8=
%
P>;
^
FC8=/@12>0
D
@10/]>69>7>1=
#相互识别并特异
性结合
!"#
基因家族的
%
个成员可以被低温胁
迫短暂而迅速地诱导+$+,!诱导的
BI`
转录因子可
以结合到
!:-
基因启动子顺式作用元件上!激活
!:-
基因的表达异位表达
BI`#
%
%
可以激活含
有
P26
%
B2O
启动子元件的基因在常温下表达!导
致组成型低温耐受+*+,,
B;/11?087
^
等+&,从拟南芥中分离得到一个组
成型表达的转录因子
WB6#
"
/1F?A>C@GBI` >_
D
C>0+
0/@1#
#!
;!<#
基因编码类似
TYB
的
ER[R
转录
因子!在低温胁迫响应途径中!
WB6#
作为
!"#&
的
上游因子!可特异地结合到
!"#%
启动子的
TYB
作用元件!激活
!"#%
的表达并诱导
BI`
%
P26I#
下游基因的转录表达组成型过量表达
WB6#
可增
强低温驯化过程中
!"#%
*
!"#!
以及
!:-
基因的
表达!提高转基因植株的低温耐受能力
(+#
突变
体可以减弱低温对
!"#%
及受
BI`0
转录因子控制
的
!:-
基因的诱导表达在
(+#
突变体中!大约
("Q
受低温调节的基因和
(Q
受低温调节的转录
因子的表达受到了抑制+%,以上研究表明!由
WB6#
"
BI`
"
BS2
组成的低温响应转录网络在植物低
温驯化过程中发挥着重要的作用
WB6#
转录因子
在植物体内是组成型表达!并定位于细胞核中!但只
有在低温胁迫过程中!
WB6#
才能诱导
!"#&
的表
达!说明
WB6#
要激活下游基因的表达!其本身的活
性还受到低温胁迫诱导的转录后调控+&,有研究表
明!低温胁迫可以诱导
WB6#
的磷酸化+#",然而能
使
WB6#
磷酸化激活的上游激酶是什么!目前并没
有明确的研究结果和
WB6#
"
BI`
"
BS2
低温响
应转录网络一样!植物体内存在的
T5L
激酶级联
途径在响应逆境胁迫过程中同样发挥着重要的作
用+##,拟南芥中的研究表明!转录因子
a2KY$%
在体外可以被
TKK#
激活+#!,
TLK%
%

通过磷酸
化转录因子
6WV%
"
>=;
^
9>1>+/10>10/=/]>%
#实现对乙
烯信号的调解+#%,
L@
D
>0A?
等+#(,用拟南芥中被特
定
TKK0
激活的
#"
种
TLK
激酶作为探针!与包含
有
!#$,
种蛋白的微阵列芯片杂交!共鉴定出
$*"
种
TLK
磷酸化底物!包括
TYI
*
E4WL0
*
5L!
%
626IL
*
a2KY
转录因子家族在内的大部分转录
因子均受到
TLK
激酶的磷酸化调节水稻
T5L
激酶
IaTK#
通过 磷 酸 化 激 活 转 录 因 子
S0+
626IL#
!从而增强
S0626IL#
与
=-
基因启动子
HBB
元件的结合活性+#$,
IaTK#
还可以通过磷
酸化激活转录因子
S0a2KY%%
!增强
S0a2KY%%
与
=-
基因启动子
a+E@_
元件的结合活性+#,组
成型表达的
WB6#
转录因子是否受
T5L
激酶的磷
酸化激活!进而调控
!"#
*
!:-
的表达!目前还没有
相关报道
油菜是重要的油料作物!白菜型冬油菜新品种
(陇油

号)是一种超强抗寒性品种!适应于极端低
温为
)!"b
"
)%"b
的中国北方旱区*寒区种植!
是目前唯一能在甘肃省中北部与河西地区安全越冬
的冬油菜品种本研究以(陇油

号)为研究材料!
克隆
!"#
基因!在低温*
5I5
*
R
!
S
!
单独处理!以
及结合
T5LKK
专一性抑制剂
N"#!
预处理情况
下!对该基因的表达进行分析!以期对
!"#
基因在
植物抗逆胁迫中的作用机制提供一定参考依据
#
!
材料与方法
8-8
!
实验材料
油菜(陇油

号)和(天油
!
号)种子由甘肃农业
大学提供选取饱满均匀的(陇油

号)和(天油
!
号)油菜种子!用水浸泡
#$7/1
后!种于含有混合营
养土的小塑料盆内!每盆约

"
,
粒种子!培养条件
为
!$b
%
#,b
"昼%夜#*光周期为
#";
%
#(;
"光%
暗#*光照强度为
#%"
#
7@9
-
7
)!
-
0
)#
培养
(
周
左右后挑选长势相同的幼苗用于后续实验
8-9
!
方
!
法
8:9:8
!
油菜
1%2
基因的克隆
!
选取生长良好的
(陇油

号)油菜幼嫩叶片!按照
OC/:@9
试剂说明书
进行总
2V5
提取!提取的
2V5
用
O5K525
公司
LC/7>ZAC/
D
=
OT
2OC>8
<
>1=K/=\/=;
<
PV56C80>C
"
L>CG>A=2>89O/7>
#反转录试剂盒进行反转录得到
相应的
APV5
!放置于
)!"b
冰箱保存备用
从
H>1I81J
下载已克隆的植物
!"#
基因序
列!用
PV50=8C
软件
6F/=0>
X
模块对其编码区进行
序列编辑!
T>
<
59/
<
1
模块进行序列比对!根据比对
结果!设计简并性引物
!"#+N
"
$M+5OH5TBO+
B5OOOOBa2BYOOYOB+%M
#和
!"#+P
"
$M+BO5+
2O55BOBB5a5HZH5Y5B+%M
!
acOd5
!
2c
5dH
!
YcBdO
!
ZcHdB
#以反转录所得的(陇
油

号)油菜
APV5
为模板!按照
LC>7/_6_O8
X
$&#
#"
期 张腾国!等$白菜型油菜
!"#
基因克隆及功能分析
PV5L@9
^
7>C80>
操作说明书"宝生物工程公司#进
行
LB2
扩增
LB2
反应体系为$预混酶
#!-$
#
[
!
!"#+N#
#
[
!
"#+P#
#
[
!模板
#
#
[
!加灭菌去离
子水至总体积
!$
#
[
扩增条件为$
&(b
预变性
%
7/1
&
(b
变性
#7/1
!
#b
退火
#7/1
!
*!b
延伸
!
7/1
!
%$
个循环&
*!b
延伸
#"7/1
扩增产物按照
680
^
L?C>U?/AJH>96_=C8A=/@1K/=
回收试剂盒"离
心柱型!购自全式金公司#回收!连入
D
OH#&+O
载
体反应体系与反应条件为$缓冲液
"-$
#
[
*
D
OH#&+O
载体
"-$
#
[
*
O
(
PV5
连接酶
"-$
#
[
*回
收产物
%-$
#
[

(b
过夜连接连接产物转化大肠
杆菌
OC810$
$
感受态细胞!
%*b
过夜培养!蓝白斑
筛选后挑取白斑!经菌液
LB2
检测后!挑选阳性克
隆!送华大基因公司测序
将
OC/:@9
法提取的(陇油

号)油菜总
2V5
按
T52O>C
OT
25B6APV557
D
9/G/A8=/@1K/=
方法修
饰后用试剂盒内特异性引物反转录!再分别进行
%M+
25B6
和
$M+25B6
扩增根据扩增到的油菜
!"#
基因中间片段序列!设计
%M+25B6
上游特异性引物
!"#%M N#
"
$M+BHBB5O5HBBBOBBHOH+
HB555OB+%M
#!试剂盒中自带的
0;@C=
D
C/7>C
作
为匹配的下游引物!以反转录得到的
APV5
为模
板!进行
LB2
扩增!得到预期大小的片段!切胶回
收!连接
D
OH#&+O
载体!转化大肠杆菌
OC810$
$
!蓝
白斑筛选阳性克隆*测序根据扩增到的油菜
!"#
基因中间片段序列!设计
$M+25B6
下游特异性引物
!"#$MP#
"
$M+55B55HHOBHHB5OBBBH55+
B5OHH5B+%M
#!试剂盒自带的
0;@C=
D
C/7>C
作为匹
配的上游引物!以反转录得到的
APV5
为模板!进
行
LB2
扩增!得到预期大小的片段切胶回收!连接
D
OH#&+O
载体!转化大肠杆菌
OC810$
$
感受态细
胞!过夜培养!蓝白斑筛选阳性克隆*测序根据
%M+
25B6
和
$M+25B6
测序结果!设计
#
对引物扩增
!"#
全 长 基 因
LB2
产 物 纯 化 回 收 后!连 接
D
OH#&+O
载体!转化大肠杆菌
OC810$
$
!
%*b
过夜
培养蓝白斑鉴定筛选阳性克隆测序
8:9:9
!
油菜
*;<
预测蛋白的生物信息学分析
!
应
用
PV50=8C
软件
LC@=>81
模块进行氨基酸组成成
分*蛋白基本特征分析!
B9?0=89
方法进行以氨基酸
序列为基础的序列比对用在线工具
ZSLT5
预
测蛋白质的二级结构&根据生物信息学软件
O@
D
+
LC>F
"
;==
D
$%%
0>C]/A>0-AE/E-N+E@CF>8?_!-GC
%
D
/0>
%
O@
DD
C>F-;=7#
#在线分析蛋白的亲水%疏水性
8:9:=
!
油菜
1%2
基因实时荧光定量
>*?
!
用
O8K828
公司的
ZYI2LC>7/_6_O8
X
OT定量分析
不同组织和不同处理条件下
!"#
基因表达水平的
变化从(陇油

号)油菜的茎*叶*下胚轴提取总
2V5
!反转录后用实时荧光定量
LB2
检测
!"#
基
因组织特异表达
低温处理$选取培养
(
周!长势良好的(陇油

号)和(天油
!
号)油菜幼苗!
(b
低温诱导!分别在
处理
"
*
#!
*
%
和
(,;
后提取幼嫩叶片总
2V5

5I5
处理$培养
(
周的油菜幼苗喷洒
#""
#
7@9
%
[
5I5
溶液于植株叶面!喷到叶片滴水为止!分别在
处理
"
*
#
*
,
和
#!;
后提取幼嫩叶片总
2V5

R
!
S
!
处理$用
R@8
<
981F
营养液配制的不同浓度
R
!
S
!
溶液"*
$
*
#"
和
#$77@9
%
[
#!浸泡培养
(
周
的油菜幼苗
!(;
!剪取幼嫩叶片直接用于
2V5
提
取
T5LKK
抑制剂
N"#!
预处理后再逆境处理$
将培养
(
周的油菜幼苗用蒸馏水清洗!放入水中
!;
以抵消损伤胁迫!然后放入
#"
#
7@9
%
[T5LKK
专
一抑制剂
N"#!
溶液中预处理
#!;
!再转入上述各
种逆境处理!提取不同处理条件下幼嫩叶片总
2V5
以上不同处理后提取的总
2V5
!经反转录
得到
APV5
作为实时荧光定量
LB2
模板分别以
5A=/1`
"
$M+OHOHBB55OBO5BH5HHHOOO+%M
#
和
5A=/12
"
$M+OOOBBBHBOBOHBOHOOHO+%M
#为管
家基因引物!
!"#>?+N#
"
$
)
+O55HOHHHOHO+
HOH5HHOH5HH+%M
#和
!"#>?+P#
"
$M+OH5H+
HB5HHBHH5OOOH+%M
#为
!"#
引物!进行荧光
定量
LB2
扩增!每个样品做
%
个重复扩增体系
为$
ZYI2LC>7/_6_O8
X
OT
#!-$
#
[
!上*下游引物
"
#"
#
7@9
%
[
#各
"-$
#
[
!
APV5!
#
[
!
FFR
!
S&-$
#
[
扩增程序为$
&$b
预变性
%"0
&
$b
变性
$0
!
"b
退火
!"0
!
("
个循环&
$$
"
&$b
每
%"0
渐进升
高
"-$b
!
,#
个循环采用
!
)
%%
B=方法分析数据!确
定基因相对表达量
!
!
结果与分析
9:8
!
油菜
1%2
基因的克隆
根据
H>1I81J
上已知的植物
!"#
基因序列!设
计简并引物!以(陇油

号)油菜中提取的总
2V5
反
转录产物为模板!扩增得到约
$"E
D
大小的单一条
带"图
#
#!此条带和预期大小相符!将其测序结果与其
他植物的
!"#
基因进行序列比对分析!发现与拟南
芥
2,!"##
基因具有较高的一致性!为
,(-"Q
因
此!初步判断扩增产物为油菜
!"#
基因片段
%M+25B6
扩增产物大小在
$""
"
*$"E
D
之间
&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
"图
!
!
5
#!与预期扩增片段大小相符测序结果与
前面扩增得到的油菜
!"#
基因片段进行序列比对
分析!发现重叠部分核苷酸序列完全相同!说明
%M+
25B6
得到片段与克隆得到的
!"#
基因片段属于
同一条基因
$M+25B6
扩增产物大小在
$""
"
*$"
E
D
之间"图
!
!
I
#!与预期扩增片段大小相符!测序
结果经序列比对!与前面扩增得到的基因片段中重
叠部分核苷酸序列完全相同!说明
$M+25B6
获得的
片段与前面克隆得到的中间片段属于同一条基因
将简并引物扩增得到的中间片段序列和
25B6
扩增得到的
$M
和
%M
端序列进行拼接!得到一条
#"""
E
D
基因序列!包含
#
个
($E
D
开放阅读框"
S2`
#!
起始密码子
5OH
前
$M+NO2##(E
D
!终止密码子
O5H
后
%M+NO2!(#E
D
!包含
%"E
D
的
D
@9
^
5
该
基因编码
!#$
个氨基酸"图
%
#!分子量为
!%-,JP
!
等电点为
(-,
为了进一步确认油菜
!"#
基因拼
接序列!根据
%M+25B6
和
$M+25B6
扩增序列设计
引物进行
LB2
扩增!获得的片段与拼接序列的核苷
酸组成完全相同
9:9
!
油菜
1%2
推导氨基酸序列与其他植物氨基酸
序列比对分析
!!
从
H>1I81J
中下载已知植物
!"#
基因序列!
利用
PV5Z=8C
软件!将所有基因的
BPZ
区导入
T>
<
89/
<
1
模块!用
B9?0=89a
方法进行氨基酸序列
的比对"图
(
#结果表明!油菜
!"#
预测蛋白符合
BI`
家族蛋白的特征!含有
BI`
家族蛋白特征序列
(
LKK
%
2L5H2eK` e6O2RL
)和(
PZ5a2
)"图
(
#与多种植物的
BI`
蛋白有较高的一致性!其中
与萝卜
20BI`#
"
HU,&**
#*紫茎泽兰
58BI`%
"
K` ,"(#(,
#*卷果涩荠
T0BI`%
"
3U,*#%,
#和拟南
芥
5=BI`#
"
5ON**%*,
#的一致性分别为
&%-$Q
*
,%-*Q
*
,#-"Q
和
*&-"Q

图
#
!
油菜
!"#
基因片段
2O+LB2
扩增
T-P[!"""
&
#-!"#
/`
<
-#
!
2O+LB287
D
9/G/A8=/@1@G!"#GC8
<
7>1=
/1"9(%)
*
+&,$&
图
!
!
!"#
基因
%M+25B6
和
$M+25B6LB2
扩增结果
T-P[!"""
&
5-%M+25B6
&
I-$M+25B6
/`
<
-!
!
%M+25B681F$M+25B6LB2
D
C@F?A=@G!"#
图
%
!
!"#
基因
APV5
序列及预测氨基酸序列
/`
<
-%
!
O;>APV50>
X
?>1A>81FF>F?A>F87/1@8A/F0>
X
?>1A>@G"9(%)
*
+&,$&!"#
<
>1>
*&#
#"
期 张腾国!等$白菜型油菜
!"#
基因克隆及功能分析
图
(
!
油菜
BI`
与部分植物
BI`
氨基酸序列比对
下划线序列为
BI`
家族蛋白特征序列
BI` -
油菜&
58BI`%
"
K` ,"(#(,
#
-
紫茎泽兰&
RCBI`
"
6` $"!"((
#
-
沙棘&
5=BI`#
"
5ON**%*,
#*
5=BI`!
"
5` "*("#
#*
5=BI`%
"
5` "!&!$
#
-
拟南芥&
S
D
BI`#
"
3`(&#!((
#
-
无苞芥&
B0BI`#
"
PU**,&&
#
-
黄瓜&
BEBI`
"
5Y&&(#!*
#
-
高山离子芥&
[
D
BI`%
"
K` !,%&&!
#
-
抱茎独行菜&
T0BI`%
"
3U,*#%,
#
-
卷果涩荠&
20BI`#
"
HU,&**
#
-
萝卜
/`
<
-(
!
59/
<
17>1=@G=;>"9(%)
*
+&,$&BI` \/=;BI` GC@7@=;>C
D
981=0
D
>A/>0
O;>?1F>C9/1>F0>
X
?>1A>08C>BI` G87/9
^D
C@=>/1A;8C8A=>C0>
X
?>1A>0
BI` -"$%&&(%(%)
*
+&,$&
&
58BI`%
"
K` ,"(#(,
#
-2
3
+$%,/%%4+/5
*
.5$%
&
RCBI`
"
6` $"!"((
#
-@
**
5
*
.%+$.%)/54+&
&
5=BI`#
"
5ON**%*,
#!
5=BI`!
"
5` "*("#
#!
5=BI`%
"
5` "!&!$
#
-2$%845
*
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&
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BI`#
"
3`(&#!((
#
-:7)%$%845
*
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*
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&
B0BI`#
"
PU**,&&
#
-!0(0)&&%,10&
&
BEBI`
"
5Y&&(#!*
#
-!.5$&
*
5$%80/
3
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&
[
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BI`%
"
K` !,%&&!
#
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*
40)
*
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&
T0BI`%
"
3U,*#%,
#
-6%7(57)%&(5$
*
54+&
&
20BI`#
"
HU,&**
#
--%
*
.%/0&&%,10&
!!
油菜
BI`
预测蛋白的疏水性在线分析表明!
BI`
为亲水性蛋白油菜
BI`
蛋白二级结构在线
预测结果显示!油菜
BI`
蛋白包含
%"-,(Q
$
+
螺
旋*
#"-*$Q
延伸链*
%-!*Q
&
+
转角和
$$-#(Q
不规
则卷曲由预测结果知油菜
BI`
蛋白主要以不规
则卷曲和
$
+
螺旋为主!这种均衡的
$
+
螺旋和无规则
卷曲二级结构的存在是
5L!
类转录因子的基本
特征
9:=
!
油菜
1%2
基因表达分析
提取(陇油

号)油菜茎*叶和下胚轴
72V5
反
转录得到的
APV5
为模板!进行实时荧光定量
LB2
!分析
!"#
基因在油菜不同组织的表达结果
表明!
"#
基因在油菜茎*叶和下胚轴中均有表达!
没有组织特异性在下胚轴中相对表达量最为丰
富!其次是茎!叶中最弱"图
$
#
(b
低温处理结果表明! 种油菜中
!"#
基因
表达受
(b
低温胁迫诱导!随着处理时间的增加!
!"#
基因表达整体上呈先升高后降低趋势在(陇
油

号)中!其增长幅度比(天油
!
号)更明显!表明
!"#
基因在(陇油

号)中受低温胁迫诱导程度更
强!与(陇油

号)比(天油
!
号)抗寒性更强的生理
特性一致
T5LKK
抑制剂
N"#!
预处理
#!;
后
再
(b
低温处理!结果显示!与各自单独
(b
低温处
理相比! 种油菜中
!"#
基因转录水平整体变化趋
势一致!但表达量均有不同程度下降"图

!
5
#说
明
T5LKK
抑制剂
N"#!
预处理抑制了
(b
低温
胁迫对油菜
!"#
基因的诱导!造成其转录水平
降低
外源
5I5
处理结果表明!(陇油

号)中!喷洒
#""
#
7@9
%
[5I5
溶液处理
#;
和
,;
时!与
";
相
,&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
比!
"#
基因表达没有明显变化!处理
#!;
时!表
达量为对照的
&
倍(天油
!
号)中!
"#
基因表达
各处理与
";
没有明显变化"图

!
I
#
T5LKK
抑
制剂
N"#!
预处理
#!;
后
5I5
处理结果显示!与
各自单独
5I5
处理结果相比! 种油菜中
!"#
基
因转录水平整体变化趋势一致!但表达量均有不同
程度下降
R
!
S
!
处理结果表明! 种油菜同时在不同浓度
R
!
S
!
溶液"*
$
*
#"
和
#$77@9
%
[
#处理
!(;
!(陇油

号)
!"#
基因表达呈先升高后下降趋势!相对于
"
77@9
%
[
!整体呈现上升趋势!在
$77@9
%
[
处理条
件下达到最大(天油
!
号)中!
"#
基因表达也较
"77@9
%
[
有不同程度增强!呈先升高后降低趋势!
在
#"77@9
%
[
达到最大
T5LKK
抑制剂
N"#!
预处理
#!;
后
R
!
S
!
处理结果显示!与各自单独
R
!
S
!
处理结果相比! 种油菜中
!"#
基因整体变
化趋势基本一致!但表达量均有不同程度下降"图

!
B
#说明
T5LKK
抑制剂
N"#!
预处理抑制了
R
!
S
!
对油菜
!"#
基因转录的诱导!造成其转录水
平的降低
图
$
!
!"#
基因不同组织中的表达
/`
<
-$
!
O;>>_
D
C>00/@1@G!"#
<
>1>/1F/GG>C>1==/00?>0
图

!
不同处理下
!
种油菜中
!"#
基因的表达
/`
<
-
!
O;>>_
D
C>00/@1@G!"#
<
>1>@G"9(%)
*
+&,$&?1F>CF/GG>C>1==C>8=7>1=0
&&#
#"
期 张腾国!等$白菜型油菜
!"#
基因克隆及功能分析
%!
讨
!
论
本研究从(陇油

号)油菜中克隆得到了含完整
编码序列的
!"#
基因!序列分析表明油菜
!"#
基
因和其他植物中已克隆得到的
!"#
基因同源性很
高
BI`
是植物所特有的转录因子!由低温*干旱
及高盐等逆境胁迫诱导表达后!可激活依赖
P26
%
B2O
顺式作元件的抗逆功能基因的表达!从而增强
植物对干旱*低温及高盐等逆境的抗性拟南芥中
!"##
*
!"#!
*
!"#%
基因的表达受到低温胁迫短暂
而强烈的诱导+#*,大豆中
B)>-<"%
%
!"#%
基因
的表达受低温胁迫的诱导!过表达
B)>-<"%
%
!"#%
可以提高转基因植物对低温*干旱和高盐胁
迫的耐受性+#,,本研究表明!
!"#
基因在油菜茎*
叶和下胚轴中均有表达!但没有组织特异性另外!
!"#
的表达受低温胁迫的诱导!(陇油

号)中
!"#
基因受低温诱导程度比(天油
!
号)强!这与(陇油

号)比(天油
!
号)更具抗寒性的生理特性相符
!"#
基因的表达除了受到低温*干旱*高盐胁迫的
诱导!
5I5
对
BI`
转录水平也有一定影响如拟
南芥
!"#(
的表达受干旱和
5I5
处理的诱导!但
不受低温胁迫的影响+#&,大豆中
B)>-<"(
的表
达受
5I5
*干 旱 和 高 盐 胁 迫 的 诱 导+!",葡 萄
C1!"##
*
C1!"#!
+
!#
,
!大麦
@1!"#%
的表达也可
受到
5I5
的诱导+!!,本研究表明!(陇油

号)在
5I5
处理
#!;
后
!"#
基因表达量有明显的升高!
而(天油
!
号)油菜中
5I5
处理下
!"#
基因表达
量与
";
相比没有明显变化
T8C?=8
等+!%,的研究
结果表明!植物叶绿体中清除
R
!
S
!
的关键酶
5Lf
活性被抑制后!
"##
基因的转录水平会受到抑制!
而外源
R
!
S
!
处理对
!"#
表达的影响目前还没有
相关报道本研究结果表明!外源
R
!
S
!
处理下!油
菜
!"#
基因的转录水平与对照相比有不同程度的
提高!其调控机理还需要进一步研究
WB6#
是
!"#
基因的正调控因子!能直接作用于
!"#
基因
的启动子上!
WB6#
转录因子在植物体内是组成型表
达!在低温胁迫诱导下
WB6#
被磷酸化激活后才能
诱导
BI`0
的表达+&,!本研究用
T5LKK
抑制剂
N"#!
预处理后再进行低温*
5I5
*
R
!
S
!
胁迫时!
发现油菜
!"#
基因的转录水平与单独胁迫处理相
比明显降低!说明
T5LKK
抑制剂
N"#!
预处理
抑制了逆境胁迫对油菜
!"#
基因转录的表达!表明
由
T5LKKK
*
T5LKK
*
T5LK
构成的
T5L
激酶
信号传导途径与
BI`
的表达有相关性推测
T5LK
有可能是
WB6#
转录因子的上游磷酸化激
酶关于
T5L
激酶信号传导途径与
WB6#
*
BI`
*
BS2
构成的低温响应转录网络是否关联!需要进一
步的研究
参考文献!
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#
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!
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