全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 219-221(2013)
收稿日期: 2012-08-05; 修回日期: 2012-12-10
基金项目: 国家科技支撑计划项目(2012BAD15B04-1)
通讯作者: 高必达,教授,主要从事分子植物病理学研究; Tel:18907315217, Fax:0731-84635136, E-mail:bdgao@yahoo. com. cn。
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■研究简报
湖南首次检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒
赵慧茹, 林振亚, 朱俊子, 张亚东, 高必达∗
(植物疾病控制与利用湖南省高校重点实验室; 植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室; 湖南农业大学, 长沙 410128)
First report of Cucumber green mottle mosaic virus( CGMMV) in Hunan Province
ZHAO Hui-ru, LIN Zhen-ya, ZHU Jun-zi, ZHANG Ya-dong, GAO Bi-da　 (Hunan University Key Laboratory
for Control and Utilization of Plant Diseases, Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and In-
sect Pests, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Abstract: Five leaf samples from watermelon plants with mosaic symptom in Shaoyang County were proved to
be CGMMV-positive by RT-PCR detection using one pair of specific primers. The sequence of RT-PCR product
(CGMMV-SY) was submitted to GenBank and showed identical to those of CGMMV coat protein genes in nu-
cleotide databases after BLAST. The seeds of a rootstock variety widely used from Beijing were also detected
CGMMV-positive and the RT-PCR product (CGMMV-JX) was of the same sequence as CGMMV-SY. They
shared 100% nucleotide identities with some CGMMV isolates of Liaoning and Korea. It suggested that CGM-
MV occurred in watermelon crop in Hunan, might be originally transmitted by grafting with rootstock infected
with CGMMV.
Keywords: Cucumber green mottle mosaic virus ( CGMMV); RT-PCR detection; watermelon; Hunan
Province
文章编号: 0412-0914(2013)02-0219-03
　 　 黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle
mosaic virus,CGMMV)自 1935 年首次报道[1]以
来,已广泛分布于亚洲、欧洲、南美洲的多个国家和
地区,对葫芦科作物的生产造成了严重损失。
CGMMV主要有两种重要的传播途径,一是带毒
种子造成远距离传播,二是授粉、嫁接等农事操作
造成的田间传播[2]。
我国自 2003 年首次在广西农业展览中心观赏
性南瓜上分离到 CGMMV[3]之后,口岸检疫部门
多次在进境葫芦科作物种子中截获到 CGM-
MV[4]。 2006 年和 2007 年此病毒分别被列为全国
农业植物检疫性有害生物和进境植物检疫性有害
生物。 此前,我国已有辽宁、北京、河北、山东、甘
肃、湖北、云南、广西、四川、广东、浙江等省市的多
个地区发现该病毒,但湖南省尚未报告。
2011 年 5 月,湖南邵阳发现疑似 CGMMV 感
染的西瓜植株,对当地西瓜生产构成了威胁。 为核
实病原,笔者通过 RT-PCR方法对病株和一种国内
广泛使用的砧木种子“京欣砧王”进行了检测,并
对 RT-PCR产物序列进行了生物信息学分析。
1　 材料与方法
1. 1　 试验材料
西瓜病叶采自湖南邵阳,具斑驳症状、有浓绿
的凹凸斑,暂命名为 CGMMV-SY,于 - 80℃冰箱
保存。 砧木种子为“京欣砧王”,暂命名为 CGM-
　
植物病理学报 43 卷
MV-JX。 Trizol 试剂、M-MLV 反转录酶购自上海
英骏生物技术有限公司;dNTPs、TaqDNA 聚合酶、
DNA回收试剂盒等购自天根生化科技有限公司;
氯仿、异戊醇等其他试剂均为国产分析纯试剂;
80%乙醇(DEPC 处理水配制)。 研钵用锡纸包裹,
200℃烘烤 4 h 以上。 枪头、离心管等用 0. 1%
DEPC 水浸泡过夜后高压灭菌。
1. 2　 样品总 RNA的提取和 RT-PCR检测
用 Trizol提取总 RNA,具体操作依说明进行。
根据 NCBI核苷酸库中 CGMMV 外壳蛋白基
因序列设计了 1 对特异性引物,正向引物 CGM-
MV-cpF: 5′-TAAGCGGCATTCTAAACC-3′,反向
引 物 CGMMV-cpR: 5′-TCGATTTAAGTGAAC-
GGG3′,由大连宝生物公司(TaKaRa)合成。 以总
RNA为模板,反向引物 CGMMV-cpR 为起始引
物,合成 cDNA第一链。 20 μL 反应体系如下:2. 0
μL总 RNA,4. 0 μL 5 × First strand buffer,2. 0 μL
dNTPs(2. 5 mmol·L -1 ),2. 0 μL 反向引物(10
μmol·L -1),1. 0 μL M-MLV 反转录酶(200U·
μL -1),加入 RNase free H2O 补足 20 μL,室温静
置 10 min,42℃1 h 后,4℃保存。 25 μL PCR 反应
体系如下:2. 0 μL 反转录产物,3. 0 μL 10 × Reac-
tion buffer,4. 0 μL dNTPs(2. 5 mmol·L -1),0. 5
μL Taq DNA 聚合酶(5 U·μL -1),0. 5 μL CGM-
MV-cpR(10 μmol·L -1 ),0. 5 μL CGMMV-cpF
(10 μmol·L -1 ),加入 RNase free H2O 补足 25
μL。 反应程序为 94℃变性 3 min; 94℃ 30 s,53℃
30 s,72℃ 45 s,30 个循环;最后 72℃延伸 10 min。
1. 3　 PCR产物的测定及分析
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳进行分离,将
目的条带用 DNA 回收试剂盒进行纯化回收后保
存于 -20℃。 测序工作由北京六合华大基因有限
公司完成。 利用 BLAST进行序列比对和分析。
2　 结果
2. 1　 RT-PCR检测
以 5 个西瓜病株叶片样本总 RNA为模板进行
RT-PCR扩增,产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳后,均
清晰可见一条与预期产物一致的约 600 bp 的特异
性扩增片段。 引物对 CGMMV-SY 有很好的特异
性,仅能从感病西瓜叶片总 RNA 中扩增出预期目
的片段,而以健康西瓜叶片总 RNA 为模板则没有
扩增到(图 1-A)。
砧木种子分 A、B、C、D四组,每组 10 个样品,
分别提取 3 粒种子、单粒种子、单粒种皮、单粒种仁
的总 RNA 为模板进行 RT-PCR 检测,产物经 1%
的琼脂糖凝胶电泳后,每组中同样可见与预期产物
一致的约 600 bp的特异性扩增片段(图 1-B)。
Fig. 1　 RT-PCR products obtained from infected leaves (A) and rootstock
seeds (B) with primer CGMMV-cpF and CGMMV-cpR
(A) Lane M: DL2 000 DNA marker; Lane1: Negative control; Lane 2, 3, 4, 5, 6 are CGMMV-SY infected leaves.
(B) Lane M: DL2 000 DNA marker; Lane1: Negative control; Lane 2: CGMMV-SY infected leaves; Lane 3, 4, 5,
6 are 3 seeds, 1 seeds, 1 seed coat, 1 seed kernel respectively.
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　 2 期 　 　 赵慧茹,等:湖南首次检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒
2. 2　 序列分析
PCR 产物纯化测序后, 在 NCBI 中进行
BLAST比对发现:采自湖南邵阳西瓜病叶的
CGMMV-SY分离物和 “京欣砧王”砧木种子的
CGMMV-JX分离物同源率达到 100% ,且与 Zhang
等[5]2010 年报道的 CGMMV 辽宁分离物 CGM-
MV-LHP(GenBank 登录号:DQ997778), Ryu 等
1999 年递交的 CGMMV 韩国分离物 CGMMV-NS
(GenBank登录号:AJ243831) 以及 Lee等 2011 年
递交的 CGMMV 韩国分离物 CGMMV-Byungchun
(GenBank 登录号: JF838188 ) 的同源率达到
100% 。
3　 结论与讨论
本研究首次从分子水平上证明湖南省发生了
黄瓜绿斑驳花叶病毒。 湖南省邵阳县植保站后来
将病叶送中国检验检疫科学研究院检测也证实了
本研究的检测结果。
研究中对“京欣砧王”砧木种子的检测采用了
直接从种子中提取 RNA的方法 [5],结果证明设计
的引物特异性好。 对 3 粒种子,单粒种子,单粒种
皮,单粒种仁的检测不但证明砧木种子的种皮、种
仁均携带 CGMMV,也表明可以直接用 RT-PCR方
法检测砧木种子带毒,为砧木种子的检测节约时
间。
在对邵阳分离物和“京欣砧王”分离物 CP 基
因分析时发现,两者同源率达到 100% ,且与辽宁
和韩国报道的分离物同源率也达到 100% 。 据悉,
“京欣砧王”是在辽宁育种,而辽宁最早确认该病,
据此我们推测该病毒先从韩国传入我国辽宁,然后
随带毒种子尤其是砧木种子调运传到湖南省。 笔
者认为检疫部门直接用种子做检材来检测 CGM-
MV,可为我国 CGMMV 疫情的控制提供有效帮
助。
参考文献
[1] 　 Anisworth G C. Mosaic disease of the cucumber [J] .
Annals of Applied Biology, 1935, 22(1): 55 -67.
[2] 　 Wu Y H, Li L M, Zhao X X, et al. Pest risk analysis
of invasion and spreading of Cucumber green mottle
mosaic virus in China ( in Chinese) [J] . Plant Protec-
tion (植物保护), 2010, 36(1): 33 -36.
[3] 　 Qin B X, Cai J H, Liu Z M, et al. Preliminary identi-
fication of a Cucumber green mottle mosaic virus infec-
ting pumpkin ( in Chinese) [J] . Plant Quarantine (植
物检疫), 2005, 19(4): 198 -200.
[4] 　 Chen J, Li M F. A new invasive pest-Cucumber green
mottle mosaic virus ( in Chinese) [ J] . Plant Quaran-
tine (植物检疫), 2007, 21(2): 94 -96.
[5] 　 Zhang Y J, Ma H, Li G F, et al. Detection Cucumber
green mottle mosaic virus in three cucurbitaceae crops
germplasm sources ( in Chinese) [ J] . Seed (种子),
2008, 27(10): 41 -43.
责任编辑:曾晓葳
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