全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(5): 532-535(2012)
收稿日期: 2011-10-25; 修回日期: 2012-04-15
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(201103037)
通讯作者: 周宗山,副研究员,主要从事果树真菌病害防控和植物病理学研究; Tel:0429-3598268, E-mail:zszhou2000@hotmail. com。
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췍研究简报
蓝莓枝干溃疡病病原鉴定
徐成楠, 周宗山*, 张红军, 吴玉星, 迟福梅
(中国农业科学院果树研究所, 兴城 125100)
Identification of the pathogen causing stem canker of blueberry　 XU Cheng-nan, ZHOU
Zong-shan, ZHANG Hong-jun, WU Yu-xing, CHI Fu-mei　 (Research Institute of Pomology,Chinese Academy of
Agricultural Sciences,Xingcheng 125100,China)
Abstract: A new disease infecting blueberry(Vaccinium) and causing stem canker was investigated in blue-
berry production area of Liaoning Province. The diseased cane samples with typical symptom were collected
from the fields. The fungal isolates were obtained and cultured on media for morphological identification, con-
duct of Koch’s postulates and molecular identification. The results showed that the pathogen was morphologi-
cally identified as Fusicoccum aesculi, the anamorph of Botryosphaeria dothidea. The ITS sequence analysis
confirmed the results. This is the first report of stem canker caused by Botryosphaeria dothidea on blueberry
(Vaccinium ) in China.
Key words: blueberry; stem canker; Fusicoccum aesculi; Botryosphaeria dothidea
文章编号: 0412-0914(2012)05-0532-04
　 　 越橘为杜鹃花科 (Ericaceae) 越橘属 (Vac-
cinium) 小浆果类果树,其中的蓝果类型俗称“蓝
莓”。 自 21 世纪以来,蓝莓这一新兴果树在中国
开始了大面积的产业化生产栽培,据统计,到 2008
年,全国超过 10 个省份开始了商业化栽培,总栽培
面积由 2000 年的 24 hm2 快速发展到 2 000 hm2,
预计未来 10 年内将超过 10 万 hm2。 随着生产面
积的不断扩大,各种病虫害的危害以及如何进行有
效防治的问题显得越来越突出。 然而,我国对蓝莓
病虫害的研究很少,病虫害对于蓝莓产业发展的潜
在威胁随着栽培面积的迅速增加而增大[1]。 蓝莓
枝干溃疡病是近年来在我国辽宁地区发生的一种
为害严重的新病害。 国外许多学者曾对蓝莓枝干
溃疡病进行过研究报道,明确 Botryosphaeria 属真
菌为该病病原,并对其病原学、致病性及发生流行
规律进行了大量研究[2,3],而我国尚未见相关研究
报道。 据此,作者采集病害枝干样品,分离获得病
原菌,通过致病性测定、病原菌培养特性观察并结
合分子生物学研究,旨在明确该病害的症状、病原
菌种类,为其防治提供理论依据。
1　 材料与方法
1. 1　 病害田间症状描述及病原菌分离
2011 年 7 月,于辽宁省营口市、丹东市及兴城
市等地的蓝莓栽植园调查蓝莓枝干溃疡病田间自
然发病情况,并拍照。 根据田间自然发病和人工接
种发病植株,进行症状描述。 采集自然发病植株枝
条 40 个,经组织分离获得病原菌。
1. 2　 致病性测定
室内接种:选取长为 10 cm,直径约 6 ~ 8 mm
的蓝莓健康枝条,冲洗干净后,以 70%酒精进行表
　
　 5 期 　 　 徐成楠,等:蓝莓枝干溃疡病病原鉴定
面消毒。 用直径为 4 mm 的打孔器在每个枝条表
面打 3 个圆孔,深度达木质部。 用同样规格的打孔
器在 PDA 上培养 6 d 的菌落边缘打取菌饼,将菌
饼接种到枝条圆孔上,菌丝面贴近枝干受伤组织。
接种后的枝条两端用含无菌水的棉球保湿,置于密
封的保鲜盒内,枝条刺伤和无伤各 10 个,27℃下保
湿培养,接种 PDA 培养基在枝条上作为对照。 每
天观察并记录枝条的发病情况。
田间接种:选取田间自然生长的蓝莓健康枝
条,用 70%酒精进行表面消毒,接种方法同室内接
种,接种后枝条用塑料薄膜缠绕一周,喷雾保湿,自
然发病,枝条刺伤和无伤各 10 个,接种 PDA 培养
基在枝条上作为对照。 每天观察并记录枝条的发
病情况。
1. 3　 病原菌形态学观察
将供试菌株和经致病性测定后再分离获得的
菌株接种到 PDA培养基上,27℃ 12h 光照 / 12h 黑
暗恒温培养 7 d 后,观察菌落培养性状,测量菌落
大小。 待产孢后,通过显微镜观察病原菌分生孢子
形态特征。 根据病菌生长速度、菌落形态特征、产
孢特征与国际上报道的相关病害及其病原菌进行
比较,确定病原菌种类。
1. 4　 病原菌 rDNA-ITS序列分析
从培养皿中刮取足量病原菌菌丝体放入 1. 5
mL灭菌离心管中,用研磨棒研磨菌丝至匀浆, 采
用 CTAB 法提取菌株 DNA,DNA 提取液置于
-20℃长期保存。 用真菌 rDNA-ITS 区段通用引
物 ITS1 和 ITS4 扩增病原菌基因组 DNA。 引物由
上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 PCR
反应体系为 25 μL,包括:10 × PCR buffer 2. 5 μL,
MgCl2(25 mmol·L -1)2. 5 μL ,dNTP(10 mmol·
L -1)0. 5 μL,模板 DNA溶液 1 μL,5U·μL -1 Taq
酶 0. 2 μL,10 pmol·μL -1 ITS1 和 ITS4 引物(由
上海生工合成)各 0. 5 μL,超纯水 17. 3 μL。 反应
程序为:94℃预变性 5 min;94℃变性 40 s,52℃退
火 40 s,72℃延伸 1 min,35 个循环;最后 72℃延伸
10 min。 PCR产物送上海生工生物工程技术服务
有限公司测序。
对测得的供试菌株核糖体 DNA-ITS区段的序
列,运用 GenBank核酸数据库中的 BLAST 工具软
件,在 DNA序列数据库中搜索同源 DNA 序列并
进行比较分析,根据同源性分析、病原菌形态学特
征及致病性测定结果,鉴定蓝莓枝干溃疡病病原菌
归属。
2　 结果与分析
2. 1　 病害症状
蓝莓枝干溃疡病主要为害蓝莓植株的主干和
侧枝。 发病初期枝干表面形成紫红色近圆形小斑
点后逐渐扩展为圆形、椭圆形或梭形大斑,斑点中
央呈灰白色。 病斑通常自发病部位逐渐向上下、环
周扩展。 病斑中部颜色较边缘浅,为灰白色,边缘
呈现紫红色,发病部位凹陷皱缩,病斑长度可达 3
~ 4 cm,病斑表面有纵向裂纹,是该病症的显著特
点(图 1-A)。 发病严重时,许多开裂状病斑成片相
连贯穿整个植株。
2. 2　 致病性测定
为了验证供试病原菌的致病性,对田间及实验
室内的蓝莓健康枝条进行接菌试验。 研究发现,田
间接菌 4 d 后,枝干接菌部位出现紫红色圆形病
斑,且病斑迅速环周及上下呈梭形扩展,接菌 7 d
后病斑中央呈灰白色边缘转为紫红色(图 1-B)。
实验室内接菌与田间接菌发病情况基本一致,发病
时间比田间接种晚 2 d左右,因为田间接菌期间正
值高温多雨天气,田间气候环境更有利于病原菌扩
展。 无伤接菌及对照均未发病。 从发病部位重新
分离病原物,经显微镜观察发现,再次分离获得的
菌系与原接种物在菌落、孢子形态等特征上完全一
致。
2. 3　 病原菌形态特征
从田间自然发病和经致病性测定后发病植株
分离所获得的菌株形态特征一致,在 PDA 培养基
上菌落生长较快,6 d直径达 9 cm,圆形或近圆形,
边缘不规则;气生菌丝棉絮状,菌落颜色初期呈白
色,后逐渐变为灰色或黑色,菌落背面同色(图 2-
A、B);光暗交替培养 15 d 后,菌落上出现颗粒状
物,即分生孢子器,球形或近球形,散生或聚生,暗
褐色至黑色;分生孢子梗缺或不明显,无色,基部分
枝,圆柱形或卵形;产孢细胞全壁芽生单生式产孢,
散生或聚生,无色,光滑(图2-C);分生孢子单胞,
335
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 Symptoms on canes of blueberry naturally infected and
inoculated with Botryosphaeria dothidea
A:Disease cane; B:Inoculated with Botryosphaeria dothidea in field.
Fig. 2　 Morphology of the pathogen causing stem canker of blueberry
A: Colony on PDA; B: Reverse colony on PDA; C: Conidiogenous cells on PDA; D: Conidia(400 × ) .
纺锤形至梭形,无色透明,含不规则油滴,基部平
截,顶部稍钝,(18. 0 ~ 25. 0)μm × (4. 0 ~ 4. 5)
μm(图 2-D)。 在自然条件和人工培养基上均未发
现有性型。 根据病原菌的培养性状和形态特征,参
考以往文献对该菌描述[4 ~ 6],鉴定该病原菌属于壳
梭孢属真菌七叶树壳梭孢 ( Fusicoccum aesculi
Corda),为葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea
(Moug. ex Fr. ) Ces. & de Not. 的无性阶段。 葡
萄座腔菌 B. dothidea属于子囊菌亚门、子囊菌纲、
格孢腔菌目、葡萄座腔菌科、葡萄座腔菌属。
2. 4　 分子生物学鉴定
选取代表性菌株 F1 对其核糖体 DNA-ITS 区
进行扩增,病原菌基因组 DNA 经通用引物 ITS1-
435
　
　 5 期 　 　 徐成楠,等:蓝莓枝干溃疡病病原鉴定
ITS4 扩增,得到长度为 560 bp 的扩增条带。 通过
与已知序列同源性比较发现,所获得序列与 Gen-
Bank中 B. dothidea 的 ITS 序列同源性为 100% 。
向 GenBank 提交了该序列,得到序列登录号
(JN640755)。 根据同源性比较结果、病原菌形态
学特征及致病性测定结果,最终确认蓝莓枝干溃疡
病病原菌为葡萄座腔菌 Botryosphaeria dothidea。
3　 结论与讨论
由葡萄座腔菌(Botryosphaeria spp. )引起的蓝
莓枝干溃疡病在世界上许多国家发生并有相关研
究报道,美国和加拿大蓝莓种植区是该病发生最严
重的地区[2]。 由于我国蓝莓产业化栽培处于起步
阶段,所以病虫害报道相对较少。 由 Botryospha-
eria属及其相关无性型真菌引起的真菌病害广泛
分布于世界各地,造成生态林木及经济林木生产的
毁灭性后果,该菌也是引起我国落叶果树重要病害
(苹果轮纹病、干腐病及桃树流胶病等)的病原菌
之一。 更为重要的是,Botryosphaeria 属真菌有性
型在实验室和自然发病植株上很难获得,其分类主
要依据无性型形态学及培养学特征[6]。 因此在此
类病害病原菌鉴定过程中,只有将植株发病症状、
病原菌形态学特征及分子生物学手段相结合才能
准确进行病原鉴定。
近年来,我国部分蓝莓种植地区发生枝干溃疡
病,作者多次田间调查发现该病主要为害 2 ~ 3 年
生幼树主干及侧枝,栽培管理条件较好的多年生植
株未见该病发生。 发病率较高的蓝莓种植区域附
近均有苹果、梨以及杨树等其他葡萄座腔菌(B.
dothidea)寄主植物,这表明蓝莓溃疡病初侵染的
菌源有可能来自于此。 据此,作者正在进行该病病
原菌寄主范围研究。 作者从病原学、致病力及分子
生物学等方面进行研究,鉴定我国蓝莓枝干溃疡病
为葡萄座腔菌(B. dothidea)及其无性型壳梭孢属
真菌七叶树壳梭孢(F. aesculi Corda)侵染所致,
蓝莓作为葡萄座腔菌(B. dothidea)的新寄主植物
在我国属于首次报道。 根据国外研究学者对蓝莓
枝干溃疡病的研究,该病可以对蓝莓植株造成毁灭
性影响,故应积极开展病害发生规律及防治措施的
深入研究。
致谢:感谢大连民族学院吕国忠教授协助鉴定该病
原菌。
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责任编辑:曾晓葳
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