全 文 ：书西北植物学报!
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"
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#$
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!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""($"!&
"
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#
"!("!#&(#"
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#")*+"+
%
,
)-../)#"""($"!&)!"#$)"!)"!#&
收稿日期$
!"#%(#"(#+
&修改稿收到日期$
!"#$("#("!
基金项目$国家自然科学基金"
%#!*!#$0
#&国家自然科学基金"
%#"*#*1*
#&高等学校博士学科点专项科研基金"
!""0%&#&##"""&
#&福建省
科技平台建设项目"
!""12!""#
#
作者简介$陈裕坤"
#01$
#!男!在读博士研究生!助理实验师!主要从事园艺植物生物技术方面的研究
"
通信作者$赖钟雄!博士!研究员!博士生导师!主要从事果树学方面的研究
3(45-6
$
65-78"#
!
#+%)9:4
龙眼胚性愈伤组织
1*23!0$
与
1*23!0%$
基因的克隆及表达分析
陈裕坤!林玉玲!田奇琳!林丽霞!赖瑞联!赖钟雄"
"福建农林大学 园艺植物生物工程研究所!福州
%&"""!
#
摘
!
要$以龙眼松散型胚性愈伤组织为实验材料!采用
;<(=>;
结合
;?>3
法!克隆了植物特异转录调控因子
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
的
9@2?
全长序列和
@2?
序列!并进行生物信息学以及表达分析结果表明$
!"#$%&$
全长
#++1A
B
!开放阅读框"
C;D
#
#!0+A
B
!编码
$%#
个氨基酸"
EF/G5/H
登录号$
I>#!*+1%
#&
!"#$%&&$
全长
!##%A
B
!
C;D#+&0A
B
!编码
&&!
个氨基酸"
EF/G5/H
登录号$
I>#!*+1$
#&
!"#$%&&$
的
@2?
序列在
&J(K<;
含
有
#
个
#&%%A
B
的内含子生物信息学分析表明$
@6E;?L$
和
E;?L&$
是不稳定亲水蛋白!不含信号肽!具有跨
膜结构和
E;?L
家族的保守结构域!亚细胞定位于细胞膜中&与毛果杨(葡萄(蓖麻和可可等具有较高的同源性
系统进化树分析显示!
@6E;?L&$
与拟南芥
?M=?<#
(葡萄
NO=?<#
(毛果杨
=M=?<#
(大豆
E4=?<#
处于同一分
枝&
@6E;?L$
与拟南芥
?ML>P!%
(玉米
Q4L>P!%
处于同一分枝推测
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
是
#$%&
基因家
族的成员
R
=>;
结果表明!
!"#$%&$
在整个发育阶段转录水平呈)
S
*型变化趋势!在球形胚和子叶形胚阶段的
表达量达最大值&
!"#$%&&$
在整个发育阶段的转录水平呈)
T
*型变化趋势!在球形胚和鱼雷形胚阶段表达量达
最大值!表明
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
主要在发育的中晚期起作用外源赤霉素处理后
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
的表达量明显上调!说明
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
对赤霉素处理能做出积极的反应
关键词$龙眼&体细胞胚胎发生&
#$%&
&克隆&生物信息学&实时荧光定量
=>;
中图分类号$
U*1&
&
U*1+
文献标志码$
?
&"(#(
)
*(!+,
-
./00#"(1(*
2
0#0"31*23!0$*(!1*23!0%$
3."4+45.
2
"
)
/(#6&*70"31-4&"$(
5
67*&/
8
$/8"7.9
>V32WXHX/
!
PY2WX6-/
Z
!
!
PY2P-8-5
!
P?Y;X-6-5/
!
P?YQ[:/
Z
8-:/
Z
"
"
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Z^
!
DX
,
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Z
]-9X6MX]F5/_D:]F.M]
^
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^
!
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>[-/5
#
150:.*6:
$
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B
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R
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R
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65/M(.
B
F9-\-9M]5/.9]-
B
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^
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Z
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1
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B
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R
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B
!
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Z
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!
M[F9:4
B
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R
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B
!
F/9:_-/
Z
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R
XF/9F5/56
^
(
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B
-/M]:/)<[F.F
R
XF/9F.:\A:M[/X96F:M-_F.5/_54-(
/:59-_.:\M[FM` :4F4AF]. F`]F[-
Z
[[:4:6:
Z
:X. -`M[M[:.F:\M[FH/:` /#$%&
Z
F/F.-/:M[F].
B
F9-F.)
@6E;?L$5/_@6E;?L&$6:95MF_-/
B
65.454F4A]5/F
&
M[F
^
[5_/:.-
Z
/56
B
F
B
M-_F
!
[5_M]5/.4F4A]5/F
.M]X9MX]F5/_M[FE;?L
B
]:MF-/_:45-/)?/
Z
6-9-7-/
ZB
[
^
6:
Z
F/FM-9M]FF:\E;?L-/
B
65/M.-/_-95MF_M[5M@6(
E;?L&$5/_?M=?<#
!
NO=?<#
!
=M=?<#
!
E4=?<#AF6:/
Z
F_M:M[F.54FA]5/9[
&
@6E;?L$5/_?M(
L>P!%
!
Q4L>P!%AF6:/
Z
F_M:M[F.54FA]5/9[)<[F]F\:]F
!
M[F
^B
XM5M-OF6
^
AF6:/
Z
F_M:E;?L\54-6
^
)
R
=>;
]F.X6M.-/_-95MF_M[5M!"#$%&$.[:` F_5
BB
]:8-45MF6
^
5
)
S
*
9X]OF
!
-MF8
B
]F..F_5MM[F[-
Z
[F.M6FOF6.-/
M[F
Z
6:AX65]F4A]
^
:.5/_9:M
^
6F_:/5]
^
F4A]
^
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BB
]:8-45MF6
^
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B
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^
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ZZ
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Z
M[5M!"2
#$%&$5/_!"#$%&&$
B
65
^
545
,
:]]:6F5MM[F4-__6F5/_65MF_FOF6:
B
4F/M56.M5
Z
F.:\6:/
Z
5/.:45M-9F4(
A]
^
:
Z
F/F.-.)!"#$%&$5/_!"#$%&&$.[:` F_X
B
(]F
Z
X65MF_F8
B
]F..-:/
B
5MMF]/.X/_F]F8:
Z
F/:X.E?
%
M]F5M4F/M.[:` F_M[5MM[F
^
45_FM[F
B
:.-M-OF]F.
B
:/.F -`M[E?
%
M]F5M4F/M)
;/
2
<".!0
$
6:/
Z
5/
&
.:45M-9F4A]
^
:
Z
F/F.-.
&
#$%&
&
96:/-/
Z
&
A-:-/\:]45M-9.
&
R
=>;
&
A-:-/\:]45M-9.5/56
^
7-/
Z
!!
E;?L
蛋白家族是一类植物特有的转录调控因
子!氨基酸个数在
$""
"
*""
之间
#000
年!根据最
早被发现的
%
个功能成员
#3445$566372%83!
37&57&393:5
"
#%3
#(
$5;$5&&<$)
=
#%#
"
$#%
#和
&8%$58$<>
"
&8$
#而将其命名为
#$%&
+
#($
,

#$%&
转录因子家族成员众多!在拟南
芥和水稻的基因组中分别鉴定出
%%
个和
&*
个
#$%&
家族成员+&(+,
#$%&
转录因子家族可分成
@3PP?
蛋白(
L>;
蛋白(
P.
蛋白(
V?T
蛋白(
=?<#
蛋白(
LV;
蛋白和
L>P0
蛋白等
*
个分
支+&(*,
E;?L
蛋白家族成员的核苷酸排列顺序和
长度差异较大!变异较大的主要集中在
2
端!其保
守的
>
端具有
&
个明显的结构域!分别是
PaaPP
(
PFX9-/FVF
B
M5_;F
B
F5M
#
"
PV;Y
#(
2PL
(
NVYY@
(
PFX9-/FVF
B
M5_;F
B
F5M
$
"
PV;YY
#(
=DW;3
和
L?S
基序组成!其中最保守的是
NVYY@
序列+#,
大部分
E;?L
蛋白亚细胞定位在细胞核!而
=?<#
则定位在细胞质中+1,
#$%&
在植物的生长和发育过程中具有多种重
要功能!如拟南芥
#%3#
和
$#%#
可参与赤霉素信
号转导途径+$!0(##,(
6&
参与侧生分生组织发育+#!(#$,(
矮牵牛花的
V?T
蛋白参与茎尖分生组织维持+#&,(
拟南芥
&?$
和
&8$
控制根部生长与发育+!!#+,(拟
南芥
;%9#
和
&86#%
参与光敏色素信号转导途
径+1!#*,此外!
E;?L
蛋白"
L>P
#对雄配子的发育
具有重要的作用+#1,虽然
#$%&
家族成员众多!而
已经进行功能分析的却很有限!并且
#$%&
转录因
子在龙眼体胚的发生过程中作用的研究非常少为
了能更深入地了解
#$%&
基因家族在植物体细胞
胚发生发育过程中的作用!本研究借助龙眼体胚发
生系统!分离和克隆龙眼胚性愈伤组织
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
基因!并通过
R
=>;
法研究其在龙眼
体胚发生过程中的表达规律及外源
E?
%
处理对
#$%&
基因的表达情况!为探索
#$%&
转录因子在
龙眼体胚发生过程中的分子调控机制奠定基础
#
!
材料和方法
=)=
!
供试材料
龙眼松散型胚性愈伤组织"-红核子.品种
P>!
细胞系#由福建农林大学园艺植物生物工程研究所
提供+#0(!#,按龙眼体胚发生同步化调控的方法!获
得松散型胚性愈伤组织(不完全胚性紧实结构(球形
胚(心形胚(鱼雷形胚和子叶形胚
+
个不同发育阶段
的胚性培养物+!!(!&,!以及
"
(
%
(
+
(
#"
(
#!
(
!&4
Z
%
P
赤
霉素"
E?
%
#分别处理
!$[
后的龙眼胚性愈伤组织!
作为实时荧光定量
=>;
的试验材料
=)>
!
方
!
法
=9>9=
!
?@1
提取(
6A@1
合成以及
A@1
提取
!
参
照
P-/
等+!+,(李惠华等+!*,和赖呈纯等+!1,的方法!提
取龙眼体胚发生过程
+
个发育阶段的胚性培养物的
总
;2?
和
E?
%
处理
!$[
后龙眼
3>
的总
;2?
!分
别用于合成
;<(=>;
扩增和
R
=>;
扩增的
9@2?

龙眼松散型胚性愈伤组织总
@2?
的提取参考王凤
华等+!0,的方法
=9>9>
!
引物设计及
B&?
扩增
!
!
#
"开放阅读框
!
C;D
"扩增
!
根据本实验室龙眼转录组数据库以
及
EF/G5/H
数据库中植物
#$%&
相关核酸序列!采
用
@2?T?2+)"
进行核酸序列多重比对后发现这
!
个基因在起始密码子和终止密码子周边的序列高
度保守!设计
C;D
上下游引物用于
C;D
的扩增
!"
%J(;?>3
和
&J(;?>3
!
采用
;?>3
法!根
据已扩增的
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
的核甘酸序
列!分别设计
!
条
%J(;?>3
引物!结合
EF/F;59(
F]
%J=]-4F]
和
EF/F;59F]
%J2F.MF_=]-4F]
引
物!以龙眼松散型胚性愈伤组织
9@2?
为模板!进
行巢式
=>;
反应扩增
%J
末端序列&再分别设计
!
条
&J(;?>3
引物!并结合
EF/F;59F]
&J=]-4F]
和
EF/F;59F]
&J2F.MF_=]-4F]
引物!以龙眼松散型
胚性愈伤组织
9@2?
为模板!进行巢式
=>;
反应
扩增
&J
末端序列
+#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
!%
"
9@2?
全长拼接验证和
@2?
序列的获得
将
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
的
&J
末端(
C;D
和
%J
末
端的序列进行拼接!在
&J
和
%J
末端设计拼接验证引
物!
=>;
验证结果同时以龙眼松散型胚性愈伤组
织的
@2?
为模板!以全长拼接验证的引物进行
=>;
反应!以扩增各成员的
@2?
序列以上引物
均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成所
有引物的序列(扩增的目的片段大小(退火温度及扩
增用途见表
#

=>;
反应体系和扩增程序参照李惠华等+!&,和
赖呈纯等+!+,的方法!根据扩增不同的目的片段对
=>;
扩增程序进行相应的调整获得目的片段后
切胶回收!
克隆后挑取阳性克隆子的菌液进行
=>;
扩增!将有目的条带的菌液送至华大基因公司
测序
=)>)C
!
生物信息学分析
!
采用
38=?L
^
=]:M(
B
5]54
预测编码蛋白的理化性质&以
=LC;<
进行
亚细胞定位&蛋白质信号肽预测采用
L-
Z
/56=%)"
LF]OF]
&采用
3TG/FMB
]F_
预测蛋白质跨膜结
构&
2FM=[:.!)"
预测蛋白质磷酸化位点&
=]F_-9M(
=]:MF-/
预测蛋白质的功能位点经
Y/MF]=]:L95/
预测蛋白质的保守结构域!以
=LY=;3@
在线软件
预测蛋白质二级结构利用
=65/M>?;3
"
[MM
B
$%%
A-:-/\:]45M-9.)
B
.A)X
Z
F/M)AF
%
F`AM::6.
%
B
65/M95]F
%
[M46
%#软件分析
&J(K<;
内含子的潜在顺式作用元
件经
TF
Z
5&)#"
软件中的
2F-
Z
[A:](b:-/-/
Z
"邻
位相连法!
2b
法#构建核苷酸序列的分子系统进化
树"
=(_-.M5/9F
法#!并用
A::M.M]5
B
法"重复
#"""
次#评估系统进化树
=9>9$
!
龙眼体胚不同发育阶段
1*23!0$
和
1*+
23!0%$
的
D
B&?
分析
!
参照
P-/
等+!+,建立的多基
因内参体系!以检测龙眼胚性愈伤组织
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
在体胚发育不同阶段的表达情况
本试验采用
<5H5]5LWG;38L9]-
B
M
P-
Z
[M>
^
96F]$1"
仪器!以龙眼体胚的
+
个不同发育
阶段稀释后的
9@2?
为模板!根据荧光引物设计的
原则设计
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
上下游引物进
行
R
=>;
扩增
R
=>;
反应体系和扩增程序参照
P-/
等+!+,的方法待反应结束后进行扩增曲线(溶
解曲线"
+"c
"
0&c
#和凝胶电泳分析!检测引物
特异性&每个反应包括
%
个重复!在样品扩增的同
时!将试验中
+
个时期的
9@2?
模板的混合样进行
&
倍梯度系列稀释制作标准曲线从扩增曲线图中
得到
8M
值!并根据标准曲线获得不同阶段
!"2
#$%&$
与
!"#$%&&$
的
4;2?
相对含量!通过内
参基因的校正最终得到目的基因的相对表达量
R
=>;
引物见表
#

根据软件自动分析的
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
表
=
!
基因克隆及
D
B&?
引物序列
<5A6F#
!
=]-4F].X.F_-/
Z
F/F96:/-/
Z
5/_
R
=>;
引物名称
=]-4F]/54F
引物序列
=]-4F].F
R
XF/9F
"
&J(%J
#
产物大小
=]:_X9M.-7F
%
A
B
退火温度
<4
%
c
用途
@F.9]-
B
M-:/
!"#$%&$(D
!"#$%&$(;
?<<>?E?E><>>?>??<
<>??<>EE?>EE>>??
#!0+ +"
C;D
扩增
?4
B
6-\-95M-:/:\C;D
!"#$%&$%JEL=#
!"#$%&$%JEL=!
>?EE?E>?E<E?E<EEE<>EEE<<$$+
%$$
+"
+"
%J(;?>3
!"#$%&$&JEL=#
!"#$%&$&JEL=!
<<>><>>?E<
?<EE<
0$0
*"+
&1
&+
&J(;?>3
!"#$%&$(WQ(D
!"#$%&$(WQ(;
>???>?>?E>??>>E?<<><
EE?>E<>>><
#&%%
!
#&%% &$
拼接验证(
@2?
序列扩增
L
B
6-9FOF]-\-95M-:/
!
54
B
6-\-95M-:/:\@2?
!"#$%&$(
R
D
!"#$%&$(
R
;
E<>?>E?>>E<?EE
?><>>?>>E#$1 +#
荧光定量
=>;
R
=>;
!"#$%&&$(D
!"#$%&&$(;
???E>?<>?>?<>?>
<>?><<>>?>E>E>?#+&0 &1
C;D
扩增
?4
B
6-\-95M-:/:\C;D
!"#$%&&$%JEL=#
!"#$%&&$%JEL=!
>E<<>?<
>>?<?
1%0
&1*
&+
&+
%J(;?>3
!"#$%&&$&JEL=#
!"#$%&&$&JEL=!
<?>?<>><<>><
E?><>>?<
**#
&!#
&+
+"
&J(;?>3
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E>><><>???>?E??>?>
E>>>??E>E??E
!"#0
!
%&&! &*
拼接验证(
@2?
序列扩增
L
B
6-9FOF]-\-95M-:/
!
54
B
6-\-95M-:/:\@2?
!"#$%&&$(
R
D
!"#$%&&$(
R
;
>E>E??E?>?E
E>???>1* +"
荧光定量
=>;
R
=>;
EF/F;59F]
(%J=]-4F]
EF/F;59F]
(%J2F.MF_
E>??>E?E>EE
>E>EEE>??E%J(;?>3
EF/F;59F]
(&J=]-4F]
EF/F;59F]
(&J2F.MF_
>E?>?>E?EE?>?>EE?>?>?&J(;?>3
*#!
!
期
!!!!!!!
陈裕坤!等$龙眼胚性愈伤组织
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
基因的克隆及表达分析
标准曲线的斜率可得
=>;
扩增效率"
3
#!
5d#"
"
#
%
.6:
B
F
#利 用
389F6
和
Z
F2C;T
"
OF].-:/
%)&
#
+
%"
,软件进行数据分析
=9>9%
!
外源
E1
C
处理后
1*23!0$
和
1*23!0%$
的表达分析
!
参照
P-/
等+!+,建立的多基因内参体
系!以检测龙眼胚性愈伤组织
!"#$%&$
与
!"2
#$%&&$
在不同浓度"(
%
(
+
(
#"
(
#!
(
!&4
Z
%
P
#赤霉
素处理
!$[
后的表达情况试验方法同
=)>)$

!
!
结果与分析
>9=
!
龙眼胚性愈伤组织
1*23!0$
与
1*23!0%$
6A@1
全长序列与
A@1
序列获得
以龙眼松散型胚性愈伤组织
9@2?
为模板!扩
增
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
开放阅读框序列!获得
与预期目标片段相符的单一片段!测序结果显示片
段大小分别为
#!0+A
B
和
#+&0A
B
将核苷酸序列
分别在
EF/G5/H
上经
G65.M
和
G65.M/
!与其它植物
的
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
具有较高的一致性!初
步推断龙眼胚性愈伤组织
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
的开放阅读框
根据
C;D
序列设计
%J(;?>3
和
&J(;?>3
引
物!采用
;?>3
法扩增
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
的
&J
和
%J
末端序列!经二轮
=>;
后均可扩增出与预期
相符的片段测序结果表明$
!"#$%&$%J(;?>3
片段大小为
%$$A
B
!
&J(;?>3
片段大小为
*"+A
B
&
!"#$%&&$%J(;?>3
片段大小为
&1*A
B
!
&J(;?>3
片段大小为
&!#A
B
经
@2?T?2+)"
软件拼接!
#$%&$
与
#$%&&$9@2?
全长分别为
#++1A
B
和
!##%A
B
设计特异引物进行
9@2?
序列拼接验证
和
@2?
序列扩增!测序结果显示$
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
拼接验证的序列分别为
#&%%A
B
和
!"#0A
B
!核苷酸序列与长度均与拼接结果相同"图
#
#以龙眼胚性愈伤组织的
@2?
为模板!
!"2
#$%&$
与
!"#$%&&$
的
@2?
序列经测序长度分
别是
#&%%A
B
和
%&&!A
B
!结果显示
!"#$%&$
没
有内含子!
!"#$%&&$&J(K<;
部分含有一个
#&%%
A
B
的内含子!其剪切位点符合真核生物的)
E<(
?E
*规则
>9>
!
龙眼胚性愈伤组织
1*23!0$
与
1*23!0%$
的序列分析
!"#$%&$
全长
#++1A
B
!开放阅读框"
C;D
#
#!0+A
B
!编码
$%#
个氨基酸!
&J(K<;
为
!##A
B
!起
始密码子为
?!
%J(K<;
为
#+#A
B
!终止密码子
为
!
=:6
^
?
尾巴为
!$A
B
&
!"#$%&&$
全长
!##%A
B
!
C;D#+&0A
B
!编码
&&!
个氨基酸!
&J(
K<;
为
!#0A
B
!起始密码子为
?!
%J(K<;
为
!%&A
B
!终止密码子为
!
=:6
^
?
尾巴为
%%A
B

将龙眼
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
的核苷酸序列在
2>GY
的
EF/G5/H
数据库中在线进行
G65.M
!
!"2
#$%&$
的核甘酸序列与毛果杨和蓖麻的一致性达
1#e
!
!"#$%&&$
的核甘酸序列与毛果杨的一致性
达
*0e
&
!"#$%&$
推导的氨基酸序列与毛果杨的
一致性达
0"e
!
!"#$%&&$
推导的氨基酸序列与可
可 (葡萄和毛果杨的一致性分别达
*0e
(
*1e
和
图
#
!
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
的
=>;
扩增
T)@!"""@2?65__F]
&
T
"
)&""A
B
@2?65__F]45]HF]
&
?)!"#$%&$(
开放阅读框&
G)!"#$%&$(%J(;?>3
&
>)!"#$%&$(&J(;?>3
&
@)!"#$%&$(
拼接验证&
3)!"#$%&&$(
开放阅读框&
D)!"#$%&&$(%J(;?>3
&
E)!"#$%&&$(&J(;?>3
&
V)!"#$%&&$(
拼接验证&
Y)!"#$%&&$@2?
序列扩增
D-
Z
)#
!
=>;54
B
6-\-95M-:/:\!"#$%&$5/_!"#$%&&$
T)@!"""@2?65__F]
&
T
"
)&""A
B
@2?65__F]45]HF]
&
?)!"#$%&$(C;D
&
G)!"#$%&$(%J(;?>3
&
>)!"#$%&$2&J(;?>3
&
@)!"#$%&$(.
B
6-9FOF]-\-95M-:/
&
3)!"#$%&&$(C;D
&
D)!"#$%&&$(%J(;?>3
&
E)!"#$%&&$(&J(;?>3
&
V)!"#$%&&$(.
B
6-9FOF]-\-95M-:/
&
Y)?4
B
6-\-95M-:/:\!"#$%&&$@2?.F
R
XF/9F
1#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
**e
说明所得片段为
#$%&
基因家族成员!
EF/(
G5/H
登录号分别为
I>#!*+1%
和
I>#!*+1$

!"#$%&&$&JK<;
的
#&%%A
B
内含子的潜在
顺式作用元件预测结果可知!除了含有大量核心启
动子元件
和
>??<(A:8
外!还存在大
量对光信号响应的元件
G:8Y
(
G:8$
(
E(G:8
(
<><(
4:M-(
E?(4:M-(
E?E(4:M-(
P?T=(F6F4F/M
&而且
具有
!
个赤霉素应答元件
=(A:8
等
>)C
!
生物信息学分析
利用
38=?L
^
=]:M
B
5]54
预测
@6E;?L$
与
@6E;?L&$
的理化性质"表
!
#
L-
Z
/56=%)"LF]OF]
软件预测可知
@6E;?L$
和
@6E;?L&$
不含信号
肽!不属于分泌蛋白经
=LC;<
亚细胞定位预测
@6E;?L$
与
@6E;?L&$
均定位于细胞膜!不是核
定位蛋白经
3TG/FMB
]F_
预测
@6E;?L$
和
@6E;?L&$
均含有跨膜螺旋&
2FM=[:.!)"
软件预
测结果显示
@6E;?L$
蛋白含有
#1
个蛋白磷酸化
位点"
LF]
$
#%
!
<[]
$
&
!
<
^
]
$
"
#!
@6E;?L&$
含有
%0
个蛋白磷酸化位点"
LF]
$
!0
!
<[]
$
%
!
<
^
]
$
*
#&经
=]F(
_-9M=]:MF-/
预测其它功能位点可知!
@6E;?L$
含有
&
个
2(
酰基化位点(
!
个
2(
糖基化位点(
+
个酪蛋白
激酶
YY
磷酸化位点(
*
个蛋白激酶
>
磷酸化位点(
#
个酪氨酸激酶磷酸化位点和
#
个酰胺化位点&
@6(
E;?L&$
含有
&
个
2(
酰基化位点(
&
个
2(
糖基化位
点(
1
个酪蛋白激酶
YY
磷酸化位点(
&
个蛋白激酶
>
磷酸化位点(
!
个酪氨酸激酶磷酸化位点(
!
个
9?T=
与
9ET=
依赖性蛋白激酶磷酸化位点和
#
个酰胺化位点&经
Y/MF]=]:L95/
程序预测
@6E;?L$
与
@6E;?L&$
均含有
E;?L
转录因子家族的保守
结构域"图
!
#采用
=LY=;3@
在线软件预测蛋白
质的二级结构!
@6E;?L$
由
$+)!e
%
(
螺旋(
##)$e
&
(
折叠和
$!)&e
不规则卷曲组成!
@6E;?L&$
由
%*)#e
%
(
螺旋(
1)0e
&
(
折叠和
&$e
不规则卷曲组
成使用
@2?T?2+)"
软件对
@6E;?L$
和
@6(
E;?L&$
与其它植物
E;?L
家族的氨基酸序列进
行多重比对!发现
@6E;?L$
和
@6E;?L&$
具有
E;?L
转录因子保守序列$
PV;Y
(
NVYY@
(
PV;YY
(
=DW;3
(
;N3;V3
和
L?S
基序!其中最保守的序
列是
NVYY@
序列!而在其他的一些保守序列中特别
保守的一些氨基酸也能够在
@6E;?L$
和
@6(
E;?L&$
蛋白序列中发现"图
%
#!证明了
@6E;?L$
和
@6E;?L&$
都属于典型的
E;?L
转录因子家族
成员
为了研究
E;?L
的进化关系!用
TF
Z
5&)#"
软
件的邻近相邻法"
2b
法#构建
E;?L
家族的系统进
化树"图
$
#!结果显示
@6E;?L&$
与拟南芥
?M(
=?<#
(葡萄
NO=?<#
(毛果杨
=M=?<#
(大豆
E4(
=?<#
聚在一起!因此
@6E;?L&$
属于
=?<#
亚家
族&
@6E;?L$
与拟南芥
?ML>P!%
(玉米
Q4L>P!%
具有较近的亲缘关系!并且与
L>;
蛋白聚在一起!
因此
@6E;?L$
属于
L>;
亚家族的成员
>9$
!
龙眼体胚不同发育阶段中
1*23!0$
与
1*23!0%$
的转录水平分析
选用
53@$
!
(
5@2#
!
和
@&!
为内参基因一起来
平衡化
R
=>;
的数据+!+,!以校正
!"#$%&$
与
!"2
表
>
!
AE?1F$
和
AE?1F%$
理化性质
<5A6F!
!
=[
^
.-9:9[F4-956
B
]:
B
F]M-F.:@6E;?L$5/_@6E;?L&$
项目
YMF4 @6E;?L$ @6E;?L&$
总氨基酸数
2:):\54-/:59-_.
$%# &&!
分子量
T:6F9X65] F`-
Z
[M
%
HX
$*$$!)" +!#0!)#
分子式
D:]4X65
>
!#""
V
%%%+
2
&*$
C
+$!
L
#*
>
!*$#
V
$!%$
2
*&"
C
1$$
L
%#
等电点
B
Y &)&! &)+$
不稳定系数
Y/.M5A-6-M
^
-/_F8
&+)!" &#)&#
带正电氨基酸
=:.-M-OF6
^
9[5]
Z
F_]F.-_XF.
$" &!
带负电氨基酸
2F
Z
5M-OF6
^
9[5]
Z
F_]F.-_XF.
&! +&
总亲水性值
E;?NW
")##0 ")%**
图
!
!
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
保守结构域
D-
Z
)!
!
<[F9:/.F]OF__:45-/:\!"#$%&$5/_!"#$%&&$
0#!
!
期
!!!!!!!
陈裕坤!等$龙眼胚性愈伤组织
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
基因的克隆及表达分析
#$%&&$
在龙眼体胚发育过程中的相对表达量分
别设计
#
对特异引物用于龙眼体胚发生过程中的
R
=>;
扩增结果显示!
!"#$%&$
在整个发育过程
中的表达量都比较高!呈现出)
S
*型变化趋势$从松
散型胚性愈伤组织到不完全胚性紧实结构阶段
!"2
#$%&$
表达量略有下降&当进一步发育到球形胚阶
段时!
!"#$%&$
的表达量急速增加!达到整个发育
阶段的最高峰&随后的心形胚和鱼雷形胚阶段!
!"2
#$%&$
的表达量虽有所下降!但还是松散型胚性愈
伤组织阶段的
!
倍以上&从鱼雷形胚到子叶形胚阶
段的表达量又急速增加!达到整个发育阶段的又一
峰值&说明
!"#$%&$
的高表达!有利于龙眼不完全
胚性紧实结构进一步发育成球形胚!有利于龙眼鱼
雷形胚进一步发育成子叶形胚
!"#$%&&$4;2?
转录水平呈现出)
T
*型变化趋势$从松散型胚性愈
伤组织到球形胚阶段的表达量先逐渐升高!进一步
发育到球形胚阶段时的表达量达到峰值!是松散型
胚性愈伤组织阶段的
1)0
倍&从球形胚到心形胚阶
段
!"#$%&&$
的表达量降低&而从心形胚到鱼雷形
胚阶段的表达量又急速增加!并在鱼雷形胚阶段达
图
%
!
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
与其它物种
#$%&
家族氨基酸序列的多重比对
图中物种
E;?L
家族蛋白名称同图
$
&
6?$3
(
:?33!
(
6?$33
(
;@A$5
(
$5:$?5
及
&%>
是
#$%&
家族保守的羟基末端
D-
Z
)%
!
?6-
Z
/4F/M:\54-/:59-_.F
R
XF/9F.:\!"#$%&$5/_!"#$%&&$ -`M[#$%&\]:4:M[F].
B
F9-F.
<[F/54F.:\:M[F]E;?L
B
]:MF-/.9:]]F.
B
:/_M:M[:.F-/D-
Z
)$
&
6?$3
!
:?33!
!
6?$33
!
;@A$5
!
$5:$?5
5/_&%>5]FM[F9:/.F]O5M-OF95]A:8
^
6MF]4-/56:\#$%&\54-6
^
"!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
#$%&
系统进化树
图中分支点的数字表示
G::M.M]5
B
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度的百分比
D-
Z
)$
!
=[
^
6:
Z
F/FM-9M]FF:\#$%&
<[F/X4AF]5MM[F/:_F.]F
B
]F.F/M.M[F]F6-5A-6-M
^B
F]9F/M:\A::M.M]5
B
O56XF.A5.F_:/#"""]F
B
6-95M-:/.
图
&
!
龙眼体胚发生过程
!"#$%&$
和
!"#$%&&$4;2?
的相对表达量
#)
松散型胚性愈伤组织&
!)
不完全胚性紧实结构&
%)
球形胚&
$)
心形胚&
)
鱼雷形胚&
+)
子叶形胚
D-
Z
)&
!
;F65M-OFF8
B
]F..-:/.:\!"#$%&$5/_
!"#$%&&$5M_-\\F]F/M.M5
Z
F.:\6:/
Z
5/L3
#)<[F\]-5A6F(F4A]
^
:
Z
F/-9956X.
&
!)Y/9:4
B
6FMF9:4
B
59M
B
]:(F4A]
^
:
Z
F/-99X6MX]F.
&
%)E6:AX65]F4A]
^
:.
&
$)VF5]M
F4A]
^
:.
&
)<:
B
F_:F4A]
^
:.
&
+)>:M
^
6F_:/5]
^
F4A]
^
:.
到整个发育阶段的最高峰&随后!从鱼雷形胚到子叶
形胚阶段
!"#$%&&$
的表达量又迅速下降"图
&
#
说明
!"#$%&&$
的高表达有利于球形胚和鱼雷形
胚的进一步发育从以上结果可以看出!在龙眼体
胚发育过程中!
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
的转录水
平呈现出一定的组织特异性!对龙眼体胚的生长和
发育可能具有多种调控功能
>9%
!
外源
E1
C
处理龙眼
+&
后
1*23!0$
与
1*+
23!0%$
的表达分析
参考
P-/
等+!+,对龙眼内参基因的筛选结果!以
53@$
!
(
5@2#
!
和
@&!
为内参基因!检测在赤霉素
图
+
!
外源
E?
%
处理后
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
相对表达量
D-
Z
)+
!
;F65M-OFF8
B
]F..-:/:\!"#$%&$5/_
!"#$%&&$5M_-\\F]F/M9:/9F/M]5M-:/:\E?
%
处理
!$[
后龙眼
3>
的
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
定量表达情况试验结果表明!在赤霉素处理下!
!"#$%&$
表达量相对稳定!
%4
Z
%
P
时表达量最
大!
+4
Z
%
P
时次之!随着浓度升高表达量降低!
!&
4
Z
%
P
时与对照表达水平相当在赤霉素处理下!
!"#$%&&$
表达量上升剧烈!
%4
Z
%
P
时表达量达
到峰值!
+4
Z
%
P
时表达量下降!随后表达量又随赤
霉素浓度升高而增加!在
#!4
Z
%
P
时表达量达到最
大值!
&4
Z
%
P
时表达量又有所下降
%
和
#!4
Z
%
P
时表达量最高!对赤霉素响应最强烈"图
+
#说
明一定浓度外源
E?
%
对
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
基因表达具有一定促进作用!
!"#$%&$
与
!"2
#$%&&$
基因对外源
E?
%
的响应存在差异!
!"2
#!!
!
期
!!!!!!!
陈裕坤!等$龙眼胚性愈伤组织
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
基因的克隆及表达分析
E;?L$
在
E?
%
浓度
%4
Z
%
P
时响应最剧烈!而
!"2
#$%&&$
基因在
E?
%
浓度
%
和
#!4
Z
%
P
时响应最
剧烈
%
!
讨
!
论
C9=
!
龙眼胚性愈伤组织
1*23!0$
和
1*23!0%$
功能的推测
生物信息学分析结果表明!
@6E;?L$
和
@6(
E;?L&$
均是不稳定的亲水蛋白!不含信号肽!具有
跨膜结构和典型的
E;?L
家族保守结构域&
@6(
E;?L$
与
@6E;?L&$
定位于细胞膜!而不是细胞
核定位蛋白!这与
G:6F
等的研究结果一致+1,二
者均有明显的
E;?L
转录因子特有的保守序列$
PV;Y
(
NVYY@
(
PV;YY
(
=DW;3
和
L?S
基序!其中
最保守的序列是
NVYY@
序列!因而推测
@6E;?L$
和
@6E;?L&$
属于典型的
E;?L
转录因子家族成
员!具有转录因子活性
系统进化树分析结果表明!
@6E;?L&$
与拟南
芥
?M=?<#
(葡萄
NO=?<#
(毛果杨
=M=?<#
(大豆
E4=?<#
聚在一起!这与
PFF
等+%#,研究结果相同!
将其称为
=?<#
亚家族
G:6F
等+1,研究表明!
=?(
缺失会导致拟南芥光敏色素信号转导途径异常!
即在远红外线诱导下叶绿素
?
%
G
结合蛋白基因
"
8%4
#与查耳酮合成酶基因"
8?&
#的表达明显下
降!同时下胚轴伸长!但在其它光照条件下正常!在
光敏色素
?
光感受体突变体中也存在此现象!证明
=?<#
特异性地参与拟南芥中光敏色素
?
的信号
转导途径
@6E;?L$
与拟南芥
?ML>P!%
(玉米
Q4L>P!%
具有较近的亲缘关系!并且与
L>;
蛋白
聚为一大簇!属
L>;
蛋白亚家族的成员根据
#$%&&$&JK<;
的
#&%%A
B
内含子潜在顺式作用
元件预测可知!其中含有大量的光信号转导应答元
件!预测其能参与植物的光信号转导途径
L>;
是
细胞皮层和内皮层不对称分裂不可缺少的物质!在
茎的顶端分生组织和叶的维管束中表达!有利于干
细胞维持在未分化的状态+!,!
L>;
缺失会导致下胚
轴(花干细胞和气生组织等的含量减少+%!,
E]FA
等+#%,敲除拟南芥
6%&
基因!发现
6%&
的缺失造成
侧芽不能萌发!证实了
%B6%&
在腋下分生组织发
育中的作用因此!
@6E;?L&$
属于叶绿体基质中
的
;%9#
类转录因子!可能参与光敏色素
?
的信号
转导途径的调控&
@6E;?L$
属于线粒体基质中的
&8$
类转录因子!可能参与调节龙眼体细胞胚发生
过程
此外!
@6E;?L$
和
@6E;?L&$
具有极其丰富
的蛋白磷酸化位点和其它多种功能位点!可能通过
各种各样的磷酸化方式改变酶活性和蛋白构象!或
利用其蛋白质功能结合位点参与调控龙眼体细胞胚
的发生发育过程
C9>
!
龙眼体胚发生过程中
1*23!0$
和
1*23!0%$
的表达模式
了解龙眼体胚发育过程中
#$%&
的表达规律
及推测其可能功能!对于探索体胚发生发育的分子
机理有重要的价值+%%,
#$%&
家族是一类植物特
有的转录调控因子!在植物的整个生长发育过程中
都起着重要的调控作用!因此
#$%&
转录因子的表
达分布在不同发育时期和不同组织之间目前!关
于植物体胚发生的机理普遍认为!体胚发生过程就
是细胞内基因差别表达的结果在本研究中!对
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
进行定量分析表明!在龙
眼体胚发生过程中
!"#$%&$
的转录水平呈现)
S
*
状的趋势!在球形胚和子叶形胚时期转录水平达到
峰值!
!"#$%&$
在这
!
个时期的表达比较活跃!为
龙眼分生组织的生长发育奠定基础
!"#$%&&$
的转录水平呈现出)
T
*状趋势!在球形胚时期和鱼
雷形胚时期的转录水平达到峰值!
!"#$%&&$
在这
!
个时期转录水平比较活跃推测这
!
个基因是与
胚胎发生相关性的基因!这些基因的表达对体胚发
生具有诱导和促进作用
>[X
Z
[
等+%$,的研究认为!
在众多基因中!信号转导相关基因是控制体胚发生
发育的九类关键基因之一
!"#$%&&$
为与
;%9#
同源的基因!参与光敏色素
?
的信号转导途径!可
能是龙眼体胚发生的关键基因之一因此!推测
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在体胚发生过程中的差异
表达与龙眼体胚的发生发育过程相关
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花和果实发育等诸多方面具有重要的影响+%&,
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蛋白具有核定位信号!可通
过与转录因子的互作调节下游基因的表达!对
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信号转导途径起负调节作用!从而抑制植物的生长
发育+%+,而
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蛋白定位于细胞膜!在植物的光
敏色素信号转导途径中起正调节作用+1!#*,不同浓
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通过调节拟南芥中具有
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和
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中
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和
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在龙眼体胚发生过程
中的表达是否受到
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的调控还有待进一
步的研究
当然!植物体内的每一个生理生化现象的机理
是十分复杂的!同时
#$%&
又是一个成员众多的基
因家族!每一个家族成员的表达具有一定的时空顺
序性!表达量和表达调控过程都具有特异性!要探索
其分子调控机制!还需要克隆其它成员并进行基因
功能研究等后续工作
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