全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$#"""($"!&
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收稿日期$!"#%(#"(#+ &修改稿收到日期$
!"#$("#("! 基金项目$国家自然科学基金"
%#!*!#$0 #&国家自然科学基金" %#"*#*1* #&高等学校博士学科点专项科研基金" !""0%&#&##"""& #&福建省 科技平台建设项目" !""12!""# # 作者简介$陈裕坤"
#01$#!男!在读博士研究生!助理实验师!主要从事园艺植物生物技术方面的研究 " 通信作者$赖钟雄!博士!研究员!博士生导师!主要从事果树学方面的研究
3(45-6
$65-78"# ! #+%)9:4 龙眼胚性愈伤组织 1*23!0$
与
1*23!0%$基因的克隆及表达分析 陈裕坤!林玉玲!田奇琳!林丽霞!赖瑞联!赖钟雄" "福建农林大学 园艺植物生物工程研究所!福州 %&"""! # 摘 ! 要$以龙眼松散型胚性愈伤组织为实验材料!采用
;<(=>;
结合
;?>3
法!克隆了植物特异转录调控因子
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
的
9@2?
全长序列和
@2?
序列!并进行生物信息学以及表达分析结果表明$!"#$%&$全长 #++1A B !开放阅读框" C;D # #!0+A B !编码$%#
个氨基酸"
EF/G5/H
登录号$I>#!*+1% #& !"#$%&&$全长 !##%A B ! C;D#+&0A B !编码 &&! 个氨基酸" EF/G5/H 登录号$
I>#!*+1$#& !"#$%&&$的 @2? 序列在 &J(K<; 含 有 # 个 #&%%A B 的内含子生物信息学分析表明$
@6E;?L$和 E;?L&$
是不稳定亲水蛋白!不含信号肽!具有跨
膜结构和
E;?L
家族的保守结构域!亚细胞定位于细胞膜中&与毛果杨(葡萄(蓖麻和可可等具有较高的同源性
系统进化树分析显示!
@6E;?L&$与拟南芥 ?M=?<# (葡萄 NO=?<# (毛果杨 =M=?<# (大豆 E4=?<# 处于同一分 枝& @6E;?L$
与拟南芥
?ML>P!%
(玉米
Q4L>P!%
处于同一分枝推测
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
是
#$%& 基因家 族的成员 R =>; 结果表明! !"#$%&$在整个发育阶段转录水平呈) S *型变化趋势!在球形胚和子叶形胚阶段的 表达量达最大值& !"#$%&&$在整个发育阶段的转录水平呈) T *型变化趋势!在球形胚和鱼雷形胚阶段表达量达 最大值!表明 !"#$%&$和 !"#$%&&$主要在发育的中晚期起作用外源赤霉素处理后 !"#$%&$和 !"#$%&&$的表达量明显上调!说明 !"#$%&$和 !"#$%&&$对赤霉素处理能做出积极的反应 关键词$龙眼&体细胞胚胎发生&
#$%& &克隆&生物信息学&实时荧光定量 =>; 中图分类号$
U*1&
&
U*1+
文献标志码$? &"(#( ) *(!+, - ./00#"(1(* 2 0#0"31*23!0$*(!1*23!0%$3."4+45. 2 " ) /(#6&*70"31-4&"$(
5
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XF/9F5/56
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:X. -`M[M[:.F:\M[FH/:` /#$%& Z F/F.-/:M[F]. B F9-F.) @6E;?L$5/_@6E;?L&$6:95MF_-/ B 65.454F4A]5/F & M[F ^ [5_/:.- Z /56 B F B M-_F ! [5_M]5/.4F4A]5/F .M]X9MX]F5/_M[FE;?L B ]:MF-/_:45-/)?/ Z 6-9-7-/ ZB [ ^ 6: Z F/FM-9M]FF:\E;?L-/ B 65/M.-/_-95MF_M[5M@6( E;?L&$5/_?M=?<#
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F_M:M[F.54FA]5/9[
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6:/
Z
5/
&
.:45M-9F4A]
^
:
Z
F/F.-.
&
#$%& & 96:/-/ Z & A-:-/\:]45M-9. & R =>; & A-:-/\:]45M-9.5/56 ^ 7-/ Z !! E;?L 蛋白家族是一类植物特有的转录调控因 子!氨基酸个数在$""
"
*""
之间
#000
年!根据最
早被发现的
%
个功能成员
#3445$566372%83! 37&57&393:5 " #%3 #($5;$5&&<$)
=
#%#
"
$#% #和 &8%$58$<> " &8$
#而将其命名为
#$%& + #($
,

#$%& 转录因子家族成员众多!在拟南 芥和水稻的基因组中分别鉴定出 %% 个和 &* 个 #$%&
家族成员+&(+,
#$%& 转录因子家族可分成 @3PP? 蛋白( L>; 蛋白( P. 蛋白( V?T 蛋白( =?<# 蛋白( LV; 蛋白和 L>P0 蛋白等 * 个分 支+&(*, E;?L 蛋白家族成员的核苷酸排列顺序和 长度差异较大!变异较大的主要集中在 2 端!其保 守的 > 端具有 & 个明显的结构域!分别是 PaaPP ( PFX9-/FVF B M5_;F B F5M # " PV;Y #( 2PL ( NVYY@ ( PFX9-/FVF B M5_;F B F5M$
"
PV;YY
#(
=DW;3
和
L?S
基序组成!其中最保守的是
NVYY@
序列+#,
大部分
E;?L
蛋白亚细胞定位在细胞核!而
=?<#
则定位在细胞质中+1,
#$%& 在植物的生长和发育过程中具有多种重 要功能!如拟南芥 #%3# 和$#%#
可参与赤霉素信
号转导途径+$!0(##,( 6& 参与侧生分生组织发育+#!(#$,(
矮牵牛花的
V?T
蛋白参与茎尖分生组织维持+#&,(
拟南芥
&?$和 &8$
控制根部生长与发育+!!#+,(拟
南芥
;%9#
和
&86#%
参与光敏色素信号转导途
径+1!#*,此外!
E;?L
蛋白"
L>P
#对雄配子的发育
具有重要的作用+#1,虽然
#$%& 家族成员众多!而 已经进行功能分析的却很有限!并且 #$%&
转录因
子在龙眼体胚的发生过程中作用的研究非常少为
了能更深入地了解
#$%& 基因家族在植物体细胞 胚发生发育过程中的作用!本研究借助龙眼体胚发 生系统!分离和克隆龙眼胚性愈伤组织 !"#$%&$与 !"#$%&&$基因!并通过 R =>; 法研究其在龙眼 体胚发生过程中的表达规律及外源 E? % 处理对 #$%&
基因的表达情况!为探索
#$%& 转录因子在 龙眼体胚发生过程中的分子调控机制奠定基础 # ! 材料和方法 =)= ! 供试材料 龙眼松散型胚性愈伤组织"-红核子.品种 P>! 细胞系#由福建农林大学园艺植物生物工程研究所 提供+#0(!#,按龙眼体胚发生同步化调控的方法!获 得松散型胚性愈伤组织(不完全胚性紧实结构(球形 胚(心形胚(鱼雷形胚和子叶形胚 + 个不同发育阶段 的胚性培养物+!!(!&,!以及 " ( % ( + ( #" ( #! ( !&4 Z % P 赤 霉素" E? % #分别处理 !$[
后的龙眼胚性愈伤组织!
作为实时荧光定量
=>;
的试验材料
=)>
!
方
!
法
=9>9=
!
?@1
提取(
6A@1
合成以及
A@1
提取
!
参
照
P-/
等+!+,(李惠华等+!*,和赖呈纯等+!1,的方法!提
取龙眼体胚发生过程
+
个发育阶段的胚性培养物的
总
;2?
和
E?
%
处理
!$[ 后龙眼 3> 的总 ;2? !分 别用于合成 ;<(=>; 扩增和 R =>; 扩增的 9@2? 龙眼松散型胚性愈伤组织总 @2? 的提取参考王凤 华等+!0,的方法 =9>9> ! 引物设计及 B&? 扩增 ! ! # "开放阅读框 ! C;D "扩增 ! 根据本实验室龙眼转录组数据库以 及 EF/G5/H 数据库中植物 #$%&
相关核酸序列!采
用
@2?T?2+)"
进行核酸序列多重比对后发现这
!
个基因在起始密码子和终止密码子周边的序列高
度保守!设计
C;D
上下游引物用于
C;D
的扩增
!"
%J(;?>3
和
&J(;?>3
!
采用
;?>3
法!根
据已扩增的
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
的核甘酸序
列!分别设计
!
条
%J(;?>3
引物!结合
EF/F;59(
F]
%J=]-4F]
和
EF/F;59F]
%J2F.MF_=]-4F]
引
物!以龙眼松散型胚性愈伤组织
9@2?
为模板!进
行巢式
=>;
反应扩增
%J
末端序列&再分别设计
!
条
&J(;?>3
引物!并结合
EF/F;59F]
&J=]-4F]
和
EF/F;59F]
&J2F.MF_=]-4F]
引物!以龙眼松散型
胚性愈伤组织
9@2?
为模板!进行巢式
=>;
反应
扩增
&J
末端序列
+#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 !% " 9@2? 全长拼接验证和 @2? 序列的获得 将 !"#$%&$与 !"#$%&&$
的
&J
末端(
C;D
和
%J
末
端的序列进行拼接!在
&J
和
%J
末端设计拼接验证引
物!
=>;
验证结果同时以龙眼松散型胚性愈伤组
织的
@2?
为模板!以全长拼接验证的引物进行
=>;
反应!以扩增各成员的
@2?
序列以上引物
均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成所
有引物的序列(扩增的目的片段大小(退火温度及扩
增用途见表
#

=>;
反应体系和扩增程序参照李惠华等+!&,和
赖呈纯等+!+,的方法!根据扩增不同的目的片段对
=>;
扩增程序进行相应的调整获得目的片段后
切胶回收!
克隆后挑取阳性克隆子的菌液进行
=>;
扩增!将有目的条带的菌液送至华大基因公司
测序
=)>)C
!
生物信息学分析
!
采用
38=?L
^
=]:M(
B
5]54
预测编码蛋白的理化性质&以
=LC;<
进行
亚细胞定位&蛋白质信号肽预测采用
L-
Z
/56=%)"
LF]OF]
&采用
3TG/FMB
]F_
预测蛋白质跨膜结
构&
2FM=[:.!)"
预测蛋白质磷酸化位点&
=]F_-9M(
=]:MF-/
预测蛋白质的功能位点经
Y/MF]=]:L95/
预测蛋白质的保守结构域!以
=LY=;3@
在线软件
预测蛋白质二级结构利用
=65/M>?;3
"
[MM
B
$%% A-:-/\:]45M-9.) B .A)X Z F/M)AF % F`AM::6. % B 65/M95]F % [M46 %#软件分析 &J(K<; 内含子的潜在顺式作用元 件经 TF Z 5&)#" 软件中的 2F- Z [A:](b:-/-/ Z "邻 位相连法! 2b 法#构建核苷酸序列的分子系统进化 树" =(_-.M5/9F 法#!并用 A::M.M]5 B 法"重复 #""" 次#评估系统进化树 =9>9$
!
龙眼体胚不同发育阶段
1*23!0$和 1*+ 23!0%$
的
D
B&?
分析
!
参照
P-/
等+!+,建立的多基
因内参体系!以检测龙眼胚性愈伤组织
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
在体胚发育不同阶段的表达情况
本试验采用
<5H5]5LWG;38L9]-
B
M
P-
Z
[M>
^
96F]$1" 仪器!以龙眼体胚的 + 个不同发育 阶段稀释后的 9@2? 为模板!根据荧光引物设计的 原则设计 !"#$%&$与 !"#$%&&$上下游引物进 行 R =>; 扩增 R =>; 反应体系和扩增程序参照 P-/ 等+!+,的方法待反应结束后进行扩增曲线(溶 解曲线" +"c " 0&c #和凝胶电泳分析!检测引物 特异性&每个反应包括 % 个重复!在样品扩增的同 时!将试验中 + 个时期的 9@2? 模板的混合样进行 & 倍梯度系列稀释制作标准曲线从扩增曲线图中 得到 8M 值!并根据标准曲线获得不同阶段 !"2 #$%&$与 !"#$%&&$的 4;2? 相对含量!通过内 参基因的校正最终得到目的基因的相对表达量 R =>; 引物见表 # 根据软件自动分析的 !"#$%&$与 !"#$%&&$表 = ! 基因克隆及 D B&? 引物序列 <5A6F# ! =]-4F].X.F_-/ Z F/F96:/-/ Z 5/_ R =>; 引物名称 =]-4F]/54F 引物序列 =]-4F].F R XF/9F " &J(%J # 产物大小 =]:_X9M.-7F % A B 退火温度 <4 % c 用途 @F.9]- B M-:/ !"#$%&$(D !"#$%&$(;
?<<>?E?E><>>?>??<
<>??<>EE?>EE>>??
#!0+ +"
C;D
扩增
?4
B
6-\-95M-:/:\C;D
!"#$%&$%JEL=#
!"#$%&$%JEL=!
>?EE?E>?E<E?E<EEE<>EEE<< $$+ %$$
+"
+"
%J(;?>3
!"#$%&$&JEL=#
!"#$%&$&JEL=!
<<>><>>?E<
?<EE<
0$0 *"+ &1 &+ &J(;?>3 !"#$%&$(WQ(D !"#$%&$(WQ(; >???>?>?E>??>>E?<<>< EE??E<???<E>E<>>>< #&%% ! #&%% &$
拼接验证(
@2?
序列扩增
L
B
6-9FOF]-\-95M-:/
!
54
B
6-\-95M-:/:\@2?
!"#$%&$(
R
D
!"#$%&$(
R
;
E<>?>E?>>E<?EE
?><>>?>>E#$1 +# 荧光定量 =>; R =>; !"#$%&&$(D !"#$%&&$(;
???E>?<>?>?<>?>
<>?><<>>?>E>E>?#+&0 &1
C;D
扩增
?4
B
6-\-95M-:/:\C;D
!"#$%&&$%JEL=#
!"#$%&&$%JEL=!
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E>><><>???>?E??>?>
E>>>??E>E??E
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拼接验证(
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序列扩增
L
B
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!
54
B
6-\-95M-:/:\@2?
!"#$%&&$(
R
D
!"#$%&&$(
R
;
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E>???>1* +"
荧光定量
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R
=>;
EF/F;59F]
(%J=]-4F]
EF/F;59F]
(%J2F.MF_
E>??>E?E>EE
>E>EEE>??E%J(;?>3
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EF/F;59F]
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>E?>?>E?EE?>?>EE?>?>?&J(;?>3
*#!
!
期
!!!!!!!
陈裕坤!等$龙眼胚性愈伤组织 !"#$%&$与 !"#$%&&$基因的克隆及表达分析 标准曲线的斜率可得 =>; 扩增效率" 3 #! 5d#" " # % .6: B F #利 用 389F6 和 Z F2C;T " OF].-:/ %)& # + %" ,软件进行数据分析 =9>9% ! 外源 E1 C 处理后 1*23!0$
和
1*23!0%$的表达分析 ! 参照 P-/ 等+!+,建立的多基因内参体 系!以检测龙眼胚性愈伤组织 !"#$%&$与 !"2 #$%&&$在不同浓度"( % ( + ( #" ( #! ( !&4 Z % P #赤霉 素处理 !$[
后的表达情况试验方法同
=)>)$! ! 结果与分析 >9= ! 龙眼胚性愈伤组织 1*23!0$
与
1*23!0%$6A@1 全长序列与 A@1 序列获得 以龙眼松散型胚性愈伤组织 9@2? 为模板!扩 增 !"#$%&$与 !"#$%&&$开放阅读框序列!获得 与预期目标片段相符的单一片段!测序结果显示片 段大小分别为 #!0+A B 和 #+&0A B 将核苷酸序列 分别在 EF/G5/H 上经 G65.M 和 G65.M/ !与其它植物 的 !"#$%&$与 !"#$%&&$具有较高的一致性!初 步推断龙眼胚性愈伤组织 !"#$%&$与 !"#$%&&$的开放阅读框 根据 C;D 序列设计 %J(;?>3 和 &J(;?>3 引 物!采用 ;?>3 法扩增 !"#$%&$与 !"#$%&&$的 &J 和 %J 末端序列!经二轮 =>; 后均可扩增出与预期 相符的片段测序结果表明$
!"#$%&$%J(;?>3
片段大小为
%$$A
B
!
&J(;?>3
片段大小为
*"+A
B
&
!"#$%&&$%J(;?>3
片段大小为
&1*A
B
!
&J(;?>3
片段大小为
&!#A
B
经
@2?T?2+)"
软件拼接!
#$%&$
与
#$%&&$9@2?
全长分别为
#++1A
B
和
!##%A
B
设计特异引物进行
9@2?
序列拼接验证
和
@2?
序列扩增!测序结果显示$
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
拼接验证的序列分别为
#&%%A
B
和
!"#0A
B
!核苷酸序列与长度均与拼接结果相同"图
#
#以龙眼胚性愈伤组织的
@2?
为模板!
!"2
#$%&$
与
!"#$%&&$
的
@2?
序列经测序长度分
别是
#&%%A
B
和
%&&!A
B
!结果显示
!"#$%&$
没
有内含子!
!"#$%&&$&J(K<;
部分含有一个
#&%%
A
B
的内含子!其剪切位点符合真核生物的)
E<(
?E
*规则
>9>
!
龙眼胚性愈伤组织
1*23!0$
与
1*23!0%$
的序列分析
!"#$%&$
全长
#++1A
B
!开放阅读框"
C;D
#
#!0+A
B
!编码
$%#
个氨基酸!
&J(K<;
为
!##A
B
!起
始密码子为
?!
%J(K<;
为
#+#A
B
!终止密码子
为
!
=:6
^
?
尾巴为
!$A B & !"#$%&&$
全长
!##%A
B
!
C;D#+&0A
B
!编码
&&!
个氨基酸!
&J(
K<;
为
!#0A
B
!起始密码子为
?!
%J(K<;
为
!%&A
B
!终止密码子为
!
=:6
^
?
尾巴为
%%A
B

将龙眼
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
的核苷酸序列在
2>GY
的
EF/G5/H
数据库中在线进行
G65.M
!
!"2
#$%&$
的核甘酸序列与毛果杨和蓖麻的一致性达
1#e
!
!"#$%&&$
的核甘酸序列与毛果杨的一致性
达
*0e
&
!"#$%&$
推导的氨基酸序列与毛果杨的
一致性达
0"e
!
!"#$%&&$
推导的氨基酸序列与可
可 (葡萄和毛果杨的一致性分别达
*0e
(
*1e
和
图
#
!
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
的
=>;
扩增
T)@!"""@2?65__F]
&
T
"
)&""A
B
@2?65__F]45]HF]
&
?)!"#$%&$(
开放阅读框&
G)!"#$%&$(%J(;?>3
&
>)!"#$%&$(&J(;?>3
&
@)!"#$%&$(
拼接验证&
3)!"#$%&&$(
开放阅读框&
D)!"#$%&&$(%J(;?>3
&
E)!"#$%&&$(&J(;?>3
&
V)!"#$%&&$(
拼接验证&
Y)!"#$%&&$@2?
序列扩增
D-
Z
)#
!
=>;54
B
6-\-95M-:/:\!"#$%&$5/_!"#$%&&$
T)@!"""@2?65__F]
&
T
"
)&""A
B
@2?65__F]45]HF]
&
?)!"#$%&$(C;D
&
G)!"#$%&$(%J(;?>3
&
>)!"#$%&$2&J(;?>3
&
@)!"#$%&$(.
B
6-9FOF]-\-95M-:/
&
3)!"#$%&&$(C;D
&
D)!"#$%&&$(%J(;?>3
&
E)!"#$%&&$(&J(;?>3
&
V)!"#$%&&$(.
B
6-9FOF]-\-95M-:/
&
Y)?4
B
6-\-95M-:/:\!"#$%&&$@2?.F
R
XF/9F
1#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 **e 说明所得片段为 #$%&
基因家族成员!
EF/(
G5/H
登录号分别为
I>#!*+1%
和
I>#!*+1$!"#$%&&$&JK<; 的 #&%%A B 内含子的潜在 顺式作用元件预测结果可知!除了含有大量核心启 动子元件 ?<?(A:8<br和 >??<(A:8 外!还存在大 量对光信号响应的元件 G:8Y ( G:8$
(
E(G:8
(
<><(
4:M-(
E?(4:M-(
E?E(4:M-(
P?T=(F6F4F/M
&而且
具有
!
个赤霉素应答元件
=(A:8
等
>)C
!
生物信息学分析
利用
38=?L
^
=]:M
B
5]54
预测
@6E;?L$与 @6E;?L&$
的理化性质"表
!
#
L-
Z
/56=%)"LF]OF]
软件预测可知
@6E;?L$和 @6E;?L&$
不含信号
肽!不属于分泌蛋白经
=LC;<
亚细胞定位预测
@6E;?L$与 @6E;?L&$
均定位于细胞膜!不是核
定位蛋白经
3TG/FMB
]F_
预测
@6E;?L$和 @6E;?L&$
均含有跨膜螺旋&
2FM=[:.!)"
软件预
测结果显示
@6E;?L$蛋白含有 #1 个蛋白磷酸化 位点" LF]$
#%
!
<[]
$& ! < ^ ]$
"
#!
@6E;?L&$含有 %0 个蛋白磷酸化位点" LF]$
!0
!
<[]
$% ! < ^ ]$
*
#&经
=]F(
_-9M=]:MF-/
预测其它功能位点可知!
@6E;?L$含有 & 个 2( 酰基化位点( ! 个 2( 糖基化位点( + 个酪蛋白 激酶 YY 磷酸化位点( * 个蛋白激酶 > 磷酸化位点( # 个酪氨酸激酶磷酸化位点和 # 个酰胺化位点& @6( E;?L&$
含有
&
个
2(
酰基化位点(
&
个
2(
糖基化位
点(
1
个酪蛋白激酶
YY
磷酸化位点(
&
个蛋白激酶
>
磷酸化位点(
!
个酪氨酸激酶磷酸化位点(
!
个
9?T=
与
9ET=
依赖性蛋白激酶磷酸化位点和
#
个酰胺化位点&经
Y/MF]=]:L95/
程序预测
@6E;?L$与 @6E;?L&$
均含有
E;?L
转录因子家族的保守
结构域"图
!
#采用
=LY=;3@
在线软件预测蛋白
质的二级结构!
@6E;?L$由$+)!e
%
(
螺旋(
##)$e & ( 折叠和$!)&e
不规则卷曲组成!
@6E;?L&$由 %*)#e % ( 螺旋( 1)0e & ( 折叠和 &$e
不规则卷曲组
成使用
@2?T?2+)"
软件对
@6E;?L$和 @6( E;?L&$
与其它植物
E;?L
家族的氨基酸序列进
行多重比对!发现
@6E;?L$和 @6E;?L&$
具有
E;?L
转录因子保守序列$PV;Y ( NVYY@ ( PV;YY ( =DW;3 ( ;N3;V3 和 L?S 基序!其中最保守的序 列是 NVYY@ 序列!而在其他的一些保守序列中特别 保守的一些氨基酸也能够在 @6E;?L$
和
@6(
E;?L&$蛋白序列中发现"图 % #!证明了 @6E;?L$
和
@6E;?L&$都属于典型的 E;?L 转录因子家族 成员 为了研究 E;?L 的进化关系!用 TF Z 5&)#" 软 件的邻近相邻法" 2b 法#构建 E;?L 家族的系统进 化树"图$
#!结果显示
@6E;?L&$与拟南芥 ?M( =?<# (葡萄 NO=?<# (毛果杨 =M=?<# (大豆 E4( =?<# 聚在一起!因此 @6E;?L&$
属于
=?<#
亚家
族&
@6E;?L$与拟南芥 ?ML>P!% (玉米 Q4L>P!% 具有较近的亲缘关系!并且与 L>; 蛋白聚在一起! 因此 @6E;?L$
属于
L>;
亚家族的成员
>9$! 龙眼体胚不同发育阶段中 1*23!0$
与
1*23!0%$的转录水平分析 选用 53@$
!
(
5@2#
!
和
@&!
为内参基因一起来
平衡化
R
=>;
的数据+!+,!以校正
!"#$%&$
与
!"2
表
>
!
AE?1F$和 AE?1F%$
理化性质
<5A6F!
!
=[
^
.-9:9[F4-956
B
]:
B
F]M-F.:@6E;?L$5/_@6E;?L&$
项目
YMF4 @6E;?L$@6E;?L&$
总氨基酸数
2:):\54-/:59-_.
$%# &&! 分子量 T:6F9X65] F`- Z [M % HX$* $$!)" +!#0!)# 分子式 D:]4X65 > !#"" V %%%+ 2 &*$ C +$! L #* > !*$# V $!%$ 2 *&" C 1$$
L
%#
等电点
B
Y &)&! &)+$不稳定系数 Y/.M5A-6-M ^ -/_F8 &+)!" &#)&# 带正电氨基酸 =:.-M-OF6 ^ 9[5] Z F_]F.-_XF.$" &!
带负电氨基酸
2F
Z
5M-OF6
^
9[5]
Z
F_]F.-_XF.
&! +&
总亲水性值
E;?NW
")##0 ")%**
图
!
!
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
保守结构域
D-
Z
)!
!
<[F9:/.F]OF__:45-/:\!"#$%&$5/_!"#$%&&$
0#!
!
期
!!!!!!!
陈裕坤!等$龙眼胚性愈伤组织 !"#$%&$与 !"#$%&&$基因的克隆及表达分析 #$%&&$在龙眼体胚发育过程中的相对表达量分 别设计 # 对特异引物用于龙眼体胚发生过程中的 R =>; 扩增结果显示! !"#$%&$在整个发育过程 中的表达量都比较高!呈现出) S *型变化趋势$从松
散型胚性愈伤组织到不完全胚性紧实结构阶段
!"2
#$%&$
表达量略有下降&当进一步发育到球形胚阶
段时!
!"#$%&$
的表达量急速增加!达到整个发育
阶段的最高峰&随后的心形胚和鱼雷形胚阶段!
!"2
#$%&$
的表达量虽有所下降!但还是松散型胚性愈
伤组织阶段的
!
倍以上&从鱼雷形胚到子叶形胚阶
段的表达量又急速增加!达到整个发育阶段的又一
峰值&说明
!"#$%&$
的高表达!有利于龙眼不完全
胚性紧实结构进一步发育成球形胚!有利于龙眼鱼
雷形胚进一步发育成子叶形胚
!"#$%&&$4;2?
转录水平呈现出)
T
*型变化趋势$从松散型胚性愈 伤组织到球形胚阶段的表达量先逐渐升高!进一步 发育到球形胚阶段时的表达量达到峰值!是松散型 胚性愈伤组织阶段的 1)0 倍&从球形胚到心形胚阶 段 !"#$%&&$的表达量降低&而从心形胚到鱼雷形 胚阶段的表达量又急速增加!并在鱼雷形胚阶段达 图 % ! !"#$%&$和 !"#$%&&$与其它物种 #$%&
家族氨基酸序列的多重比对
图中物种
E;?L
家族蛋白名称同图
$& 6?$3
(
:?33!
(
6?$33 ( ;@A$5
(
$5:$?5
及
&%>
是
#$%& 家族保守的羟基末端 D- Z )% ! ?6- Z /4F/M:\54-/:59-_.F R XF/9F.:\!"#$%&$5/_!"#$%&&$-`M[#$%&\]:4:M[F].
B
F9-F.
<[F/54F.:\:M[F]E;?L
B
]:MF-/.9:]]F.
B
:/_M:M[:.F-/D-
Z
)$& 6?$3
!
:?33!
!
6?$33 ! ;@A$5
!
$5:$?5
5/_&%>5]FM[F9:/.F]O5M-OF95]A:8
^
6MF]4-/56:\#$%&\54-6 ^ "!! 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
图
$! #$%&
系统进化树
图中分支点的数字表示
G::M.M]5
B
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度的百分比
D-
Z
)$! =[ ^ 6: Z F/FM-9M]FF:\#$%&
<[F/X4AF]5MM[F/:_F.]F
B
]F.F/M.M[F]F6-5A-6-M
^B
F]9F/M:\A::M.M]5
B
O56XF.A5.F_:/#"""]F
B
6-95M-:/.
图
&
!
龙眼体胚发生过程
!"#$%&$
和
!"#$%&&$4;2?
的相对表达量
#)
松散型胚性愈伤组织&
!)
不完全胚性紧实结构&
%)
球形胚&
$) 心形胚& ) 鱼雷形胚& +) 子叶形胚 D- Z )& ! ;F65M-OFF8 B ]F..-:/.:\!"#$%&$5/_ !"#$%&&$5M_-\\F]F/M.M5 Z F.:\6:/ Z 5/L3 #)<[F\]-5A6F(F4A] ^ : Z F/-9956X. & !)Y/9:4 B 6FMF9:4 B 59M B ]:(F4A] ^ : Z F/-99X6MX]F. & %)E6:AX65]F4A] ^ :. &$)VF5]M
F4A]
^
:.
&
)<:
B
F_:F4A]
^
:.
&
+)>:M
^
6F_:/5]
^
F4A]
^
:.
到整个发育阶段的最高峰&随后!从鱼雷形胚到子叶
形胚阶段
!"#$%&&$
的表达量又迅速下降"图
&
#
说明
!"#$%&&$
的高表达有利于球形胚和鱼雷形
胚的进一步发育从以上结果可以看出!在龙眼体
胚发育过程中!
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
的转录水
平呈现出一定的组织特异性!对龙眼体胚的生长和
发育可能具有多种调控功能
>9%
!
外源
E1
C
处理龙眼
+&
后
1*23!0$与 1*+ 23!0%$
的表达分析
参考
P-/
等+!+,对龙眼内参基因的筛选结果!以
53@$! ( 5@2# ! 和 @&! 为内参基因!检测在赤霉素 图 + ! 外源 E? % 处理后 !"#$%&$和 !"#$%&&$相对表达量 D- Z )+ ! ;F65M-OFF8 B ]F..-:/:\!"#$%&$5/_ !"#$%&&$5M_-\\F]F/M9:/9F/M]5M-:/:\E? % 处理 !$[
后龙眼
3>
的
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
定量表达情况试验结果表明!在赤霉素处理下!
!"#$%&$
表达量相对稳定!
%4
Z
%
P
时表达量最
大!
+4
Z
%
P
时次之!随着浓度升高表达量降低!
!&
4
Z
%
P
时与对照表达水平相当在赤霉素处理下!
!"#$%&&$
表达量上升剧烈!
%4
Z
%
P
时表达量达
到峰值!
+4
Z
%
P
时表达量下降!随后表达量又随赤
霉素浓度升高而增加!在
#!4
Z
%
P
时表达量达到最
大值!
&4
Z
%
P
时表达量又有所下降
%
和
#!4
Z
%
P
时表达量最高!对赤霉素响应最强烈"图
+
#说
明一定浓度外源
E?
%
对
!"#$%&$
与
!"#$%&&$
基因表达具有一定促进作用!
!"#$%&$
与
!"2
#$%&&$
基因对外源
E?
%
的响应存在差异!
!"2
#!!
!
期
!!!!!!!
陈裕坤!等$龙眼胚性愈伤组织 !"#$%&$与 !"#$%&&$基因的克隆及表达分析 E;?L$
在
E?
%
浓度
%4
Z
%
P
时响应最剧烈!而
!"2
#$%&&$
基因在
E?
%
浓度
%
和
#!4
Z
%
P
时响应最
剧烈
%
!
讨
!
论
C9=
!
龙眼胚性愈伤组织
1*23!0$和 1*23!0%$
功能的推测
生物信息学分析结果表明!
@6E;?L$和 @6( E;?L&$
均是不稳定的亲水蛋白!不含信号肽!具有
跨膜结构和典型的
E;?L
家族保守结构域&
@6(
E;?L$与 @6E;?L&$
定位于细胞膜!而不是细胞
核定位蛋白!这与
G:6F
等的研究结果一致+1,二
者均有明显的
E;?L
转录因子特有的保守序列$PV;Y ( NVYY@ ( PV;YY ( =DW;3 和 L?S 基序!其中 最保守的序列是 NVYY@ 序列!因而推测 @6E;?L$
和
@6E;?L&$属于典型的 E;?L 转录因子家族成 员!具有转录因子活性 系统进化树分析结果表明! @6E;?L&$
与拟南
芥
?M=?<#
(葡萄
NO=?<#
(毛果杨
=M=?<#
(大豆
E4=?<#
聚在一起!这与
PFF
等+%#,研究结果相同!
将其称为
=?<#
亚家族
G:6F
等+1,研究表明!
=?(
缺失会导致拟南芥光敏色素信号转导途径异常!
即在远红外线诱导下叶绿素
?
%
G
结合蛋白基因
"
8%4
#与查耳酮合成酶基因"
8?&
#的表达明显下
降!同时下胚轴伸长!但在其它光照条件下正常!在
光敏色素
?
光感受体突变体中也存在此现象!证明
=?<#
特异性地参与拟南芥中光敏色素
?
的信号
转导途径
@6E;?L$与拟南芥 ?ML>P!% (玉米 Q4L>P!% 具有较近的亲缘关系!并且与 L>; 蛋白 聚为一大簇!属 L>; 蛋白亚家族的成员根据 #$%&&$&JK<; 的 #&%%A B 内含子潜在顺式作用 元件预测可知!其中含有大量的光信号转导应答元 件!预测其能参与植物的光信号转导途径 L>; 是 细胞皮层和内皮层不对称分裂不可缺少的物质!在 茎的顶端分生组织和叶的维管束中表达!有利于干 细胞维持在未分化的状态+!,! L>; 缺失会导致下胚 轴(花干细胞和气生组织等的含量减少+%!, E]FA 等+#%,敲除拟南芥 6%& 基因!发现 6%& 的缺失造成 侧芽不能萌发!证实了 %B6%& 在腋下分生组织发 育中的作用因此! @6E;?L&$
属于叶绿体基质中
的
;%9#
类转录因子!可能参与光敏色素
?
的信号
转导途径的调控&
@6E;?L$属于线粒体基质中的 &8$
类转录因子!可能参与调节龙眼体细胞胚发生
过程
此外!
@6E;?L$和 @6E;?L&$
具有极其丰富
的蛋白磷酸化位点和其它多种功能位点!可能通过
各种各样的磷酸化方式改变酶活性和蛋白构象!或
利用其蛋白质功能结合位点参与调控龙眼体细胞胚
的发生发育过程
C9>
!
龙眼体胚发生过程中
1*23!0$和 1*23!0%$
的表达模式
了解龙眼体胚发育过程中
#$%& 的表达规律 及推测其可能功能!对于探索体胚发生发育的分子 机理有重要的价值+%%, #$%&
家族是一类植物特
有的转录调控因子!在植物的整个生长发育过程中
都起着重要的调控作用!因此
#$%& 转录因子的表 达分布在不同发育时期和不同组织之间目前!关 于植物体胚发生的机理普遍认为!体胚发生过程就 是细胞内基因差别表达的结果在本研究中!对 !"#$%&$和 !"#$%&&$进行定量分析表明!在龙 眼体胚发生过程中 !"#$%&$的转录水平呈现) S * 状的趋势!在球形胚和子叶形胚时期转录水平达到 峰值! !"#$%&$在这 ! 个时期的表达比较活跃!为 龙眼分生组织的生长发育奠定基础 !"#$%&&$的转录水平呈现出) T *状趋势!在球形胚时期和鱼 雷形胚时期的转录水平达到峰值! !"#$%&&$在这 ! 个时期转录水平比较活跃推测这 ! 个基因是与 胚胎发生相关性的基因!这些基因的表达对体胚发 生具有诱导和促进作用 >[X Z [ 等+%$,的研究认为!
在众多基因中!信号转导相关基因是控制体胚发生
发育的九类关键基因之一
!"#$%&&$
为与
;%9#
同源的基因!参与光敏色素
?
的信号转导途径!可
能是龙眼体胚发生的关键基因之一因此!推测
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
在体胚发生过程中的差异
表达与龙眼体胚的发生发育过程相关
C9C
!
外源
E1
C
促进
1*23!0$和 1*23!0%$
的表达
赤霉素是植物生长发育过程中一种重要的调节
激素!对种子萌发(茎的伸长(叶的伸展(根的生长及
花和果实发育等诸多方面具有重要的影响+%&,
E;?L
家族的
@3PP?
蛋白具有核定位信号!可通
过与转录因子的互作调节下游基因的表达!对
E?
信号转导途径起负调节作用!从而抑制植物的生长
发育+%+,而
=?<#
蛋白定位于细胞膜!在植物的光
敏色素信号转导途径中起正调节作用+1!#*,不同浓
度外源
E?
%
处理龙眼胚性愈伤组织后!
!"#$%&$
和
!"#$%&&$
基因的表达量与对照相比明显上调!
尤其是
!"#$%&&$
基因!说明目的基因能对赤霉素
处理做出积极的反应!这可能是由于
!"#$%&&$&J
!!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 K<; 的内含子中有 ! 个赤霉素应答元件 =(A:8 !初 步推测一定浓度的外源 E? % 能促进龙眼 3> 中 !"2 #$%&$和 !"#$%&&$基因的表达!进而对龙眼体 胚的生长发育过程进行调控 此外!一些 #$%&
家族基因的表达受
4-9]:(
;2?#*#
的调控!如
4-;#*#
通过调节拟南芥中具有
E;?L
功能域转录因子家族
L>P+(
$( L>P+( 和 L>P+( ( 来控制花的发育和根系的发育+%*,本研究 中 !"#$%&$和 !"#$%&&$在龙眼体胚发生过程 中的表达是否受到 4-9]:;2? 的调控还有待进一 步的研究 当然!植物体内的每一个生理生化现象的机理 是十分复杂的!同时 #$%&
又是一个成员众多的基
因家族!每一个家族成员的表达具有一定的时空顺
序性!表达量和表达调控过程都具有特异性!要探索
其分子调控机制!还需要克隆其它成员并进行基因
功能研究等后续工作
参考文献!
+
#
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=WLV
!
P@
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