全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 534鄄537(2011)
收稿日期: 2010鄄10鄄21; 修回日期: 2011鄄07鄄08
基金项目: 浙江省科技厅资助项目(2008C22002; 2009R50033鄄6)
通讯作者: 路 梅, 工程师, 主要从事植物病理学研究; E鄄mail: lumei@zjnu. cn。
蕛蕛蕛蕛蕛蕛
蕛蕛蕛蕛蕛
蕛
藘 藘
藘
藘
研究简报
佛手采后致病青霉的分离鉴定
李永强, 杨佳妮, 陈文荣, 路 梅*, 郭卫东
(浙江师范大学生化学院, 金华 321004)
Identification of Penicillium species causing post鄄harvest diseases of finger citron
LI Yong鄄qiang, YANG Jia鄄ni, CHEN Wen鄄rong, LU Mei, GUO Wei鄄dong 摇 (College of Chemistry and Life
Science, Zhejiang Normal University, Jinhua 321004, China)
Abstract: Golden Finger citron (Citrusmedica var. sarcodactylis Swingle), one of the traditional specialities
of Jinhua,Zhejiang Province, has high ornamental and medicinal value. Green mould is the major fungus di鄄
sease of Citrus fruits, causing substantial economic losses during the storage of post鄄harvest. To identify the
exact species of the pathogenic fungus, an isolate belonged to genus Penicillium was isolated from the infected
Golden Finger citron. Kochs postulation was completed by wounded鄄inoculation with the conidial suspension
of Penicillium sp. on health Golden Finger. It was identified as Penicillium digitatum based on morphological
characters and internal transcribed spacer ( ITS) analysis. This result would be helpful for controlling post鄄har鄄
vest disease.
Key words: Citrusmedica var. sarcodactylis Swingle; Penicillium species; rDNA鄄ITS
文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0534鄄04
摇 摇 佛手(Citrusmedica var. sarcodactylis Swingle)
又名九爪木、五指橘、佛手柑,为芸香科柑橘属常绿
小乔木。 主产于闽、粤、川、浙等省,其中浙江金华
“金佛手冶最为著名,被称为“果中之仙品,世上之
奇卉冶。 其果形美观、色泽金黄、香味浓郁,具有药
用价值高、贮藏期长的特点[1],是金华地区的传统
特产之一。
在柑橘属果实采后贮藏病害中,以青霉菌引起
的病害最为严重。 据统计,该病害在贮运期间造成
的损失一般为 10 %左右,高的超过 30 % ,每年给
生产和经营者带来很大的损失[2]。 2009 年,研究
人员发现部分金佛手在贮藏过程中出现严重腐烂,
疑似青霉菌引起的腐烂病。 对病害特征典型的果
实进行病原菌的分离与纯化,筛选出 1 株致病真
菌;采用传统真菌形态学分类与 rDNA鄄ITS 分子标
记相结合的方法对所分离到的菌株进行进一步鉴
定,以期为该病害的防治提供参考。
1摇 材料与方法
1. 1摇 供试菌株
供试菌株采自金华市锦林佛手有限公司贮藏
的腐烂佛手果实。 在浙江师范大学分子生物学实
验室,采用单孢分离法进行病原菌分离纯化,PDA
培养基培养,4益保存。
1. 2摇 病原菌的致病性检测
在锦林佛手有限公司种植基地,采集无病症且
大小均匀的佛手果,用 2%次氯酸钠溶液清洗表
皮,自然晾干备用。 将纯化培养 7 d 的青霉孢子用
无菌水刮下稀释,血球计数板计数,配成 1 伊 106
个 / mL的孢子悬浮液,然后用消毒针在果实腰部
针刺打孔,每果接种 10 针,接种深度基本一致,以
摇
摇 5 期 李永强,等:佛手采后致病青霉的分离鉴定
刺破果实表皮为宜。 每个伤口接种 20 滋L 病原菌
孢子悬浮液,25益保湿培养,逐日观察并记录发病
症状。
1. 3摇 病原菌的传统形态特征观察
将病原菌孢子稀释后,在 PDA 培养基上划线
培养 7 d,观察菌落形态。 显微镜下观察不同菌株
的形态特征,鉴定分离所得病原菌的种类。
1. 4摇 病原菌 rDNA鄄ITS的扩增和序列分析
1. 4. 1 摇 病原菌 DNA 的提取 摇 DNA 提取参照文
献[3]的方法并稍加改进。
1. 4. 2摇 扩增 rDNA基因簇摇 利用真菌核糖体基因
转录间隔区( ITS)通用引物 ITS1 (5忆鄄TCCGTAG鄄
GTGAACCTGCGG鄄3忆)和 ITS4 (5忆鄄TCCTCCGCT鄄
TATTGATATGC鄄3忆)对病原菌的 ITS 和 5. 8S rD鄄
NA 进行 PCR扩增。 反应条件:25 滋L 反应体系,
包括 10 伊 PCR buffer 2. 5 滋L,2. 5 mmol / L dNTP
2. 0 滋L,5 U / 滋L Taq DNA聚合酶 0. 5 滋L,上游引
物 ITS1 与下游引物 ITS4 均为 20 mmol / L,各取
1郾 0 滋L,DNA模板 2. 0 滋L,ddH2O 16 滋L。 PCR反
应程序:94益预变性4 min,94益变性 30 s,54益退
火 30 s,72益延伸 30 s,36 个循环;72益终延伸 10
min,4益保温。 扩增后的样品产物置于 4益冰箱,
保存备用。
1. 4. 3摇 PCR 产物序列分析和比对 摇 PCR 产物经
琼脂糖凝胶电泳检测后,由上海生工生物工程技术
服务有限公司进行测序,测序结果在 GenBank 数
据库 ( http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov ) 中进行
BLAST比对分析,并下载 9 个菌株的相关 ITS 序
列,用 MEGA4 (Molecular Evolutionary Genetics
Analysis Version 4)软件构建系统发育树,从而获
知病原菌种类。
2摇 结果与分析
2. 1摇 病原菌致病性检测
从佛手发病果实病健交界处分离获得 1 株真
菌菌株。 将该菌株接种健康的佛手果,引起果实腐
烂。 该菌株侵染果实初期,果实表面形成水渍状浅
褐色病斑;发病后快速形成白色菌丝,之后迅速在
果皮表面扩展,边缘不明显,不整齐,最后形成绿色
霉层,并伴有特殊香味(图版玉鄄 淤、于、盂)。 条件
Plate玉摇 Symptoms of Penicillium digitatum on Finger Citron and medium
Fig. 1: Hypha emergence on the fruit surface of Finger Citron after 3 d of inoculation with P. digitatum.
Fig. 2: Symptom on the fruit surface of Finger Citron after 5 d of inoculation.
Fig. 3: The symptom on the fruit surface after 10 d of inoculation are the same with the store Finger Citron.
Fig. 4: Morphological characters of P. digitatum on PDA culture medium.
535
摇
植物病理学报 41 卷
适宜的情况下,果实从发病到全果腐烂只要 7 ~
10 d。 从发病果实上重新分离得到与所接种菌株
培养性状相同的病原菌,依照柯赫氏法则说明分离
得到的病原菌是引起佛手采后腐烂的致病真菌。
2. 2摇 病原菌的形态学鉴定
病原菌菌株在 PDA 培养基上培养,菌落呈绒
状,生长快;菌丝体初为白色,略带黏性,成熟后转
为绿色霉层,菌落呈深绿色,质地薄毡状,具白色边
缘;到后期菌落形成同心轮纹,白色边缘逐渐变小,
直至完全消失,菌落背面观察为淡黄色 (图版
玉鄄 榆)。 镜检观察其分生孢子梗不聚集,无色,较
短,帚状枝不规则,一般一次分枝,分枝顶端产生瓶
状小梗;小梗单胞,无色,中宽,上下稍狭细,呈长纺
锤形(图 1鄄A);小梗上分生孢子串生,单孢,无色,
卵圆形或圆形,大小(5. 0 ~ 6. 5)滋m 伊 (2. 5 ~ 3. 0)
滋m(图 1鄄B)。
2. 3摇 致病菌 rDNA鄄ITS序列分析
用一对真菌通用引物 ITS1 / ITS4 对分离菌株
的 rDNA鄄ITS 进行 PCR 扩增,电泳检测结果得到
大小约 500 bp的片段;经测序分析,确定该片段全
长 526 bp。
将 所 测 得 rDNA鄄ITS 序 列 提 交 NCBI
(HM217150)。 在 GenBank中进行比对分析,发现
所测致病菌属于半知菌类青霉属,与 P. digitatum
(AF455394、AF455420、AY684926)等多个菌株的
ITS序列同源性高达 99. 62% 。 根据 GenBank 中 9
个菌株的相关 ITS 序列,用 MEGA 4 软件构建了
系统发育树 (图 2 )。 金佛手青霉致病菌株
HM217150 与 3 个 P. digitatum 菌株(AF033471、
EU664461、AY373910)以 boots trap 100%的水平
类聚在一起 (图 2)。 ITS 序列分析结果,支持
HM217150 菌株与 P. digitatum同属一种真菌。 根
据病原菌的形态特征、ITS序列同源性及系统发育
树分析结果,确定佛手采后致病青霉菌的有性阶段
属真菌界(Eumycetes )中的双核亚界(Dikarya )、
子囊菌门(Ascomycota )、子囊菌亚门(Ascomyco鄄
tina )、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eu鄄
rotiales )、散囊菌科(Eurotiaceae )、青霉属(Peni鄄
cillium);无性阶段属半知菌类(Deuteromycotina)、
丝胞纲(Hyphomycetes)、丝胞目(Moniliales)、丛梗
胞科(Monilialeae)、青霉属(Penicillium)。
Fig. 1摇 Morphological characters of Penicillium digitatum on the artificial culture
A: Conidiophores of P. digitatum ( 伊400); B: Conidia of P. digitatum ( 伊400) .
635
摇
摇 5 期 李永强,等:佛手采后致病青霉的分离鉴定
Fig. 2摇 Phylogenetic tree based on rDNA鄄ITS sequence homology of the pathogenic strain
(HM217150) causing green mould of Citrusmedica var. sarcodactylis (Swingle) with
that of the other related fungi from GenBank
3摇 讨论
摇 摇 果实腐烂是佛手贮藏期间常见的病害特征,造
成极大的经济损失。 本文首次对导致金佛手果实
腐烂的病原菌进行分离鉴定,明确了其形态特征和
分类归属,为今后进一步研究病害的防治技术提供
科学依据。
青霉属传统形态鉴定的主要依据是病原菌在
查氏培养基上的菌落形态、分生孢子形态、大小、分
生孢子梗等性状。 但是,由于培养性状的可变性及
形态特征的交叉,使得这些分类依据并不可靠,而
且用时较长,难以做到病原菌的快速鉴定。 分子生
物学方法在真菌性病害的病原鉴定及其分类地位
确立等方面的发展和应用,弥补了传统病原形态学
的不足。 rDNA鄄ITS 是介于 18S rDNA、5. 8S rDNA
和 28S rDNA之间的区域,已有研究表明 ITS 在真
菌的种间存在着丰富的变异,而在种内不同菌株间
却高度保守[4, 5],可以为真菌的系统发育和分类鉴
定提供丰富的遗传信息。 本文将 rDNA 的 ITS 序
列和形态学特征结合对病原菌进行鉴定,形态鉴定
与分子技术鉴定的结果完全一致。 有研究发现,引
起柑橘采后致病的青霉菌株有 P. italicum、P. digi鄄
tatum、P. expansum、P. polonicum、P. chrysogenum
等多种病原菌,本研究只分离鉴定了 1 种病原真
菌,因此,不排除还有其他种类的病原微生物也可
导致佛手贮藏期果实发生腐烂。
参考文献
[1] 摇 Zhou C L, Guo W D. The research of Bergamot
germplasm ( in Chinese)[J] . Shaanxi Journal of Agri鄄
cultural Sciences (陕西农业科学), 2005, ( 3 ):
89 -92.
[2] 摇 Min X F, Deng B X, Chen L F, et al. Molecular
identification of Penicillium species causing post鄄har鄄
vest diseases of Citrus fruits ( in Chinese) [ J] . Jour鄄
nal of Fruit Science(果树学报), 2007, 24(5): 653
-656.
[3] 摇 Yang L Y, Huang H P, Tang F R, et al. Rapid mo鄄
lecular identification and detection of Colletotrichum
musae with species鄄specific primers based on the inter鄄
nal transcribed spacer ( ITS) ( in Chinese) [ J] . Acta
Phytopathologica Sinica (植物病理学报), 2006, 36
(3): 219 -225.
[4] 摇 Bailey J A, Nash C, Morganl W. Molecular taxono鄄
myof Colletotrichum species causing anthracnose on the
malaceae[J] . Phytopathology, 1996, 86(10): 1076
-1083.
[5] 摇 Culebras P M, Eladio B M, Querol D A. Identifica鄄
tion of Colletotrichum species responsible for anthrac鄄
nose of strawberry based on the internal transcribed
spacers of the ribosomal region[J] . FEMS Microbiol鄄
ogy Letters, 2000, 189(1):97 -101.
责任编辑:于金枝
735