全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 128-135(2013)
收稿日期: 2012-01-05; 修回日期: 2012-12-10
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30670278)
通讯作者: 简 恒,教授,主要从事线虫学研究; Tel (Fax): 010-62731102,E-mail: hengjian@cau. edu. cn
第一作者: 林世锋,男,黑龙江牡丹江人,博士研究生,主要从事植物病理及分子生物学研究; E-mail: linshifeng1978@163. com。
松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达
及多克隆抗体的制备
林世锋1,2, 简 恒2∗, 赵海娟2, 卜祥霞2, 刘 倩2
( 1贵州省烟草科学研究院, 贵阳 550081; 2 中国农业大学植物病理学系 农业部植物病理学重点实验室, 北京 100193)
摘要:利用重叠延伸 PCR基因合成法,按大肠杆菌偏爱密码子,合成松材线虫类毒过敏原蛋白基因(Bxvap2),将其连接到原核
表达载体 pET-29b( + )上。 获得的重组子转化大肠杆菌 BL21(DE3)后,用 IPTG进行诱导表达。 SDS-PAGE分析表明,目的
蛋白以可溶形式高效表达,占细菌总蛋白的 33. 5 % 。 将表达产物经 Ni-NTA亲和柱纯化后进行质谱分析,结果显示纯化的蛋
白为 BXVAP2蛋白。 用制备的 BXVAP2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接 ELISA测得抗体灵敏度 5. 4 ng·mL -1
(效价为 1∶ 1 360 000),为进一步研究该蛋白的组织定位及功能,明确该基因在致病过程中的作用机理奠定了基础。
关键词:松材线虫; 类毒过敏原蛋白; 基因优化; 原核表达; 多克隆抗体
Prokaryotic expression of venom allergen-like protein of Bursaphelenchus xylophi-
lus and preparation of its polyclonal antibody 　 LIN Shi-feng1,2, JIAN Heng2, ZHAO
Hai-juan2, BU Xiang-xia2, Liu Qian2 　 ( 1Guizhou Institute of Tobacco Science, Guiyang 550081, China; 2Department of
Plant Pathology, China Agricultural University, Key Laboratory of Molecular Plant Pathology, Ministry of Agriculture, Beijing
100193, China)
Abstract: The venom allergen-like protein gene of Bursaphelenchus xylophilus (Bxvap2) was optimized using
the overlap extension PCR technique for expression in Escherichia coli. It was subsequently cloned into pET-29b
( + ) vector and the fusion protein was highly expressed in E. coli BL21 (DE3) in soluble form which covered
33. 5% of total cellular proteins. After purification through affinity Ni-NTA column, the fusion protein was fur-
ther identified as BXVAP2 by mass spectrometry (MS) . White rabbits were immunized with BXVAP2 protein.
The sensitivity of polyclonal antibody was 5. 4 ng·mL -1(the titer was 1∶ 1 360 000) tested by indirect ELISA.
This result will be an important basis for tissue localization and functional study of BXVAP2 protein of B. xylo-
philus.
Keywords: Bursaphelenchus xylophilus; venom allergen-like protein; gene optimization; prokaryotic expres-
sion; polyclonal antibody
中图分类号: S432. 45　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)02-0128-08
　 　 类毒过敏原蛋白 ( venom-allergen proteins,
VAP)是富含半胱氨酸分泌蛋白( cysteine-rich se-
cretory protein, CRISP)家族的一员。 CRISP 在植
物和动物中广泛分布,其确切的生物学功能还不清
楚。 在线虫中类毒过敏原蛋白最早报道自动物寄
生线虫犬钩口线虫(Ancylostoma caninum) [1],在动
物寄生线虫涡卷盘尾丝虫 ( Onchocerca volvu-
lus) [2]马来丝虫(Brugia malayi) [3]及自由生活线
　
　 2 期 　 　 林世锋,等:松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
虫秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans) [4]中也
有发现和报道。 目前,编码该类蛋白的基因在南方
根结线虫(Meloidogyne incognita) [5,6]、大豆孢囊线
虫(Heterodera glycines) [7]和马铃薯腐烂茎线虫
(Ditylenchus destructor) [8]等植物寄生线虫中也已
被分离鉴定,推测该类蛋白可能在植物线虫侵染过
程中发挥着重要作用。
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是我国
二类检疫性线虫,也是国际上公认的重要检疫性有
害生物。 由松材线虫引起的松树萎蔫病是一种毁
灭性病害,以其致病能力强、传播途径广、蔓延速度
快、防治难度大等特点,给世界林业造成严重危害。
2011 年我们从松材线虫中克隆到 3 个以基因簇形
式存在的功能性类毒过敏原蛋白基因(Bxvap1、2、
3) [9]。 3 个全长类毒过敏原蛋白各包含 1 个 N 端
信号肽、1 个保守的机构基元 HFTQ和 8 个保守的
半胱氨酸残基,原位杂交显示 Bxvap1、2 和 3 皆在
松材线虫的食道腺特异表达。 随后,Kang 等[10]对
Bxvap1 的表达特征及功能进行了深入研究。 结果
显示,该基因的转录和翻译水平均于松材线虫在松
树体内生长繁殖阶段最高。 同时,免疫组化分析证
实 Bxvap1 蛋白特异存在于松材线虫的食道腺和
中食道球中。 此外,RNAi 敲除该基因会显著降低
松材线虫的迁移率。 这些结果表明 Bxvap1 蛋白
可能经松材线虫口针分泌至体外抑制松树的防卫
反应,参与松材线虫的迁移过程。 最近,Yan 等[11]
通过松材线虫转录组分析,发现松材线虫类毒过敏
原蛋白家族 6 个新成员,为进一步研究松材线虫
VAP的多态性和功能提供了新的线索。
在植物寄生线虫中,要理解该类蛋白在线虫与
寄主植物互作中的作用,不仅从分子水平还应从蛋
白水平进行研究判断。 因此,本文以 Bxvap2 基因
为例,利用 Donato(1993)建立的重叠延伸 PCR 合
成基因的方法[12],按大肠杆菌偏爱密码子,合成松
材线虫类毒过敏原蛋白基因,构建原核表达载体,
使其在大肠杆菌中得到了高效表达,并以纯化的原
核表达产物为抗原制备了相应的多克隆抗体,为进
一步研究该蛋白的组织定位及功能,明确该基因在
致病过程中的作用机理奠定了基础。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
原核表达载体 pET-29b ( + )、大肠杆菌
(Escherichia coli)DH5α和 BL21 (DE3)由中国农
业大学植物线虫学实验室提供。 克隆载体 pGEM-
TEasy 购自 Promega 公司。 聚合酶 PrimeSTARTM
HS和 Ex Taq购自 TaKaRa公司。 Ni-NTA亲和层
析柱套装购自 Qiagen公司。
1. 2　 遗传密码优化及 PCR 扩增反应
根据本实验室报道的 BXVAP2 的氨基酸序列
和大肠杆菌密码子的偏好性原则,设计合成 16 条
PCR引物(表 1),用于遗传密码优化后 Bxvap2m 基
因成熟蛋白编码序列(ORF中除信号肽部分)的全
合成。 其中在 F8和 R8 引物的 5′端分别引入 NdeⅠ
和 XhoⅠ酶切位点,以利于载体构建。
　 　 采用重叠延伸 PCR 法[12]进行优化改造序列
的合成。 合成从基因的中部开始,采用高保真
PrimeSTARTM HS聚合酶进行扩增和延伸。 第 1 组
PCR反应以引物 F1 和 R1 互为模板进行扩增。 反
应体系:引物(F1,R1)各 1 μL(10 μmol·L -1 )、
4 μL dNTP Mixture(各 2. 5 mmol·L -1 )、10 μL
5 ×缓冲液、0. 5 μL PrimeSTARTM HS 聚合酶(2. 5
U·μL -1 )和 33. 5 μL 灭菌蒸馏水。 反应条件:
98℃变性 10 s,68℃延伸 1 min,得到 PCR产物 P1,
2%琼脂糖凝胶电泳回收 P1。 第 2 组 PCR 反应以
P1 为模板,(F2,R2)为引物,常规 PCR 得到产物
P2,琼脂糖凝胶电泳回收 P2。 以此类推,进行前 7
次 PCR反应。 最后以普通聚合酶 Ex Taq 代替高
保真聚合酶进行第 8 组 PCR 扩增反应,得到扩增
产物 P7,1%琼脂糖凝胶电泳回收 P8。
1. 3　 表达载体的构建及其表达纯化
将纯化后的重叠延伸 PCR 产物与 pGEM-
TEasy 载体连接,构建基因重组体 pGEM-Bxvap2m,
委托上海 Sangon 公司进行全序列测定。 将
pGEM-Bxvap2m 用 Nde Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切,纯化回
收 Bxvap2m 片段连到同样双酶切的 pET-29b ( + )
载体上,转化大肠杆菌 DH5α。 筛选重组质粒 pET-
29b-Bxvap2m 的转化子并提取重组质粒,转化
BL21 (DE3),得到 BL21 (DE3 ) -Bxvap2m 工程
菌。 　 　
挑取 BL21 (DE3) -Bxvap2m 单菌落于 2 mL
LB液体培养基中(含卡那霉素 100 μg·mL -1),
37℃振荡培养过夜,1∶ 50 稀释到新鲜的 LB液体培
养基中(含卡那霉素 100 μg·mL -1),37℃振荡培
养 3 h,加 IPTG至终浓度 0. 4 mmol·L -1,继续于
921
　
植物病理学报 43 卷
Table 1　 Primers used in this research
Name Primer sequence (5′ to 3′)
F1 ATGCCGCATGTGGGCGTGGATAGCGCGGTGAACGGCAGCGCGCAGATGTGGTGGGATGA
R1 GCTCCATTCAAATTTCGCATCGCCGCTATAATCTTTAATTTCATCCCACCACATCTGCG
F2 ACATCCGACCAACGGCGGCTATGGCCAGAACCTGGCGGCGCAGATGCCGCATGTGGGCG
R2 TTTCCGCCCACGCCATCTGGGTAAAATGGCCGGTGCTGGTGCTCCATTCAAATTTCGCA
F3 GGAAGCGAAAGCGGATGAATGGGCGCAGGCGTGCAACTTTGAACATCCGACCAACGGCG
R3 CGCCGTTGGTGCAGTTCTGAATCGCGCAGCCAATTTTATCGGTTTCCGCCCACGCCATC
F4 AAGGCGCGAACATTCGCGAAATTACCTGGGATGCGGATCTGGAAGCGAAAGCGGATGAA
R4 GTAAAGGTCCAATCTTTCCATTCGCCAAAGCCCTGGGTATCGCCGTTGGTGCAGTTCTG
F5 GCGAACGGCGAAGCGGAAGCGAAAAACGGCACCATGGCGAAAGGCGCGAACATTCGCGA
R5 CCATCATGTTGCCCGGGTTCATATAATCGCACACGGTAAAGGTCCAATCTTTCCATTCG
F6 ACAGGCGATTCTGGATGCGCATAACAGCCGCCGCCGCACCCTGGCGAACGGCGAAGCGG
R6 CATTTGCTGCACGGTTCGCCGGTAATATACAGATCCGCGCCCATCATGTTGCCCGGGTT
F7 CATATGACCAAATTTAGCGAAAGCCAGAAACAGGCGATTCTGGATGCGCATAAC
R7 GCGCTGCACAGGCTATCGCTGCAGCTGCCCTGGCTGCTGCATTTGCTGCACGGTTCGCC
F8 CATATGACCAAATTTAGCGAAAGCCAGAAACAGGCGATTC
R8 CTCGAGCGCGCTGCACAGGCTATCGCTGCAGCTGCCCTG
37℃培养 3 h。 离心收集菌体,加适量 TE溶液(pH
8. 0),振荡悬浮,再加入等体积的 2 × SDS 上样缓
冲液,100℃煮沸 5 min,取上清进行 SDS-PAGE 电
泳,进一步 Ni-NTA 纯化,SDS-PAGE 电泳检测纯
化效果。
1. 4　 重组蛋白的质谱鉴定
1. 4. 1　 分子量测定 　 将纯化的 BXVAP2 融合蛋
白与基质(CHCA)以 1∶ 1 等体积比混合后,取 0. 5
μL 进行 MALDI-TOF-MS(ABI-4700)检测分析,
记录质谱分析图。 以单电荷峰所对应的分子量与
理论分子量进行比较。 其中 BXVAP2 融合蛋白的
理论分子量在互联网上通过开放的预测软件(ht-
tp: / / expasy. org / tools / pi_tool. html)计算获得。
1. 4. 2　 肽序列测定 　 将纯化的 BXVAP2 融合蛋
白进行 SDS-PAGE 电泳后,参照 Wang 等[13]的方
法进行蛋白质胶内酶解,切取目的条带,经脱色、还
原、烷基化、真空干燥后,用 10 mg·L -1的胰蛋白
酶液消化,离心取上清,收集酶解液。 加 5% TFA
至胶块中,37℃保温 1 h,收集合并酶解液。 加入
2. 5% TFA、50% ACN 混合液至胶块中,37℃保温
1 h,收集合并酶解液。 将合并得到的酶解液体真
空干燥后,采用纳升液相电喷雾离子肼串联质谱
(nLC-ESI-IT-MS / MS)进行质谱检测。 所得数据
运用 MASCOT软件配合 NCBInr 数据库进行分析
和确定。
1. 5　 BXVAP2 蛋白多克隆抗体的制备
用纯化的 BXVAP2 融合蛋白作为免疫原。 选
取 2 只纯种雄性新西兰大耳白兔(体重约 2 kg)作
为免疫动物,免疫接种前采集阴性血清。 每只兔子
的具体免疫程序如下:用 600 μg 免疫原与等体积
的弗氏完全佐剂混合乳化,进行皮下多点注射免
疫。 初次免疫后在 3 和 5 周分别用 400 μg 免疫原
与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后加强免疫。
末次免疫 10 d 后取血用间接 ELISA 法[14]测定抗
血清效价,效价满意后心脏取血,分离抗血清。
用 Protein A亲和层析法对抗血清中 IgG 进行
纯化。 具体操作如下:先用 binding buffer 平衡 Pro-
tein A亲和柱,效价较高兔子的血清样品负载上柱,
然后收集流穿液再次上柱,再用 eluting buffer洗脱,
收集的洗脱峰用 0. 01 M PBS(pH 7． 2)透析,使纯化
后的 IgG保存在 0. 01 mol·L -1、pH 7. 2 PBS 环境
中,最终分别采用 SDS-PAGE和间接 ELISA检测纯
031
　
　 2 期 　 　 林世锋,等:松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
化后抗体的纯度和效价。
2　 结果与分析
2. 1　 基因优化合成及其表达载体的构建
测序结果分析表明:人工合成的 Bxvap2m 成熟
蛋白编码序列与设计一致,将原序列中的 98 个密
码子替换为大肠杆菌偏爱密码子,替代率为
55． 8% ,核苷酸相似性为 80. 4% (图 1)。 该序列已
经提交至 GenBank,登录号为 HQ830173。
用 NdeⅠ和 XhoⅠ双酶切 pGEM-Bxvap2m,回
收获得 Bxvap2m 基因片段,插入原核表达载体
pET-29b ( + )的 NdeⅠ和 XhoⅠ位点之间,转化大
肠杆菌 DH5α,经菌落 PCR 和测序鉴定,结果与设
计一致,表明已成功构建 pET-29b-Bxvap2m 重组质
粒。
2. 2　 重组蛋白的表达及其纯化
将重组质粒 pET-29b-Bxvap2m 转化至 BL21
(DE3),经 IPTG诱导后收集细胞。 其细胞全蛋白
的 SDS-PAGE电泳结果表明,在 BL21 (DE3)中人
工合成的 Bxvap2m 基因在预期位置有较明显表达
带(表达的蛋白为 His-Tag 融合蛋白,理论分子量
为 21. 8 kDa),而野生型 Bxvap2 基因在大肠杆菌
中没有任何表达带出现(图 2)。 密度扫描显示,
Fig. 1　 Alignment of wild-type (WT) Bxvap2 and codon-optimized (CO) Bxvap2 (Bxvap2m)
131
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 2　 Induced expression and purification of recombinant BXVAP2 protein
M: Marker; 1, 7: BL21 (DE3) -Bxvap2m induced with IPTG; 2: BL21 (DE3) -Bxvap2m without IPTG;3: BL21 (DE3) -
Bxvap2 induced with IPTG; 4: BL21 (DE3) -Bxvap2 without IPTG; 5: BL21 (DE3) / pET-29b ( + ) induced with IPTG;
6: BL21 (DE3) / pET-29b ( + ) without IPTG; 8: Purified BXVAP2 protein.
Bxvap2m 的表达产物占细胞总蛋白的 33. 5% 。
BXVAP2 His-Tag融合蛋白经 Ni-NTA亲和层析纯
化后,其浓度经 Quant-iT 蛋白定量检测法测定为
2. 79 mg·mL -1。
2. 3　 重组蛋白的质谱鉴定
采用MALDI-TOF-MS检测纯化的 BXVAP2融
合蛋白的分子量(图3)。 除了典型的BXVAP2融合
蛋白的单电荷峰(21 699. 77)外,还可见 BXVAP2融
合蛋白的双电荷峰(10 848. 57),而未见其它杂质
峰。 BXVAP2 融合蛋白单电荷峰所对应的分子量
与 BXVAP2 融合蛋白理论分子量(21 817. 87)的
相对误差为 5. 41‰,表明表达产物的确是BXVAP2
融合蛋白,而且纯度很高。
进一步将纯化的重组蛋白凝胶条带进行胶内
酶解,酶解肽段混合物上 nLC-ESI-IT-MS / MS,结
合 MASCOT软件分析,搜索匹配结果(图 4)。 重
组蛋白与松材线虫 BXVAP2 蛋白(296045875)相
匹配,序列覆盖率为 37% ,MASCOT 得分高达 418
(P <0. 05),表明重组蛋白的鉴定具有显著的置信
水平,重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达。
Fig. 3　 Molecular weight (MW) determination of recombinant BXVAP2 by MALDI-TOF-MS
Peaks marked with 21 699 and 10 848 were produced by recombinant BXVAP2
in singly and doubly charged states respectively.
231
　
　 2 期 　 　 林世锋,等:松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
Fig. 4　 Peptide identification of trypsin cleaved recombinant BXVAP2 by nLC-ESI-IT-MS / MS
2. 4　 BXVAP2 多克隆抗体的制备
我们用纯化的 BXVAP2 融合蛋白免疫了 2 只
新西兰大耳白兔,在经过 3 次免疫后,ELISA 结果
显示其中 1 只兔子的血清效价为 1∶ 729 000,另 1
只效价较低,为 1:24 300,说明免疫动物个体之间
存在免疫应答差异。 用 Protein A柱子纯化高效价
的兔子血清,经蛋白定量检测仪测定纯化后总 IgG
浓度为 7. 38 mg·mL -1。 经 SDS-PAGE 电泳可见
清晰的重链与略微模糊的轻链条带(图 5),说明血
清纯化可以获得纯度较高的多克隆抗体。 间接
ELISA法测定纯化后抗体的灵敏度为 5. 4 ng·
mL -1(表 2),抗体的稀释度为 1∶ 1 360 000。
Fig. 5　 SDS-PAGE analysis of purified
anti-BXVAP2 polyclonal antibody
1: Protein marker; 2: Anti-BXVAP2 polyclonal antibody.
Table 2　 ELISA analysis of the titer
of BXVAP2 polyclonal antibody
Concentration / ng·mL -1 OD450
4 000 3. 501
1 333 3. 501
444 3. 501
148 3. 352
49 1. 549
16 0. 539
5. 4 0. 199
PBS 0. 053
3　 讨论
目前针对植物寄生线虫类毒过敏原蛋白基因
的研究多处于转录水平的研究。 来源于根结和孢
囊线虫的 4 个类毒过敏原蛋白基因 mRNA时空表
达规律:基因表达部位均位于侧腹食道腺,在寄生
前和寄生阶段的二龄幼虫期强烈表达,在寄生后期
有微弱表达,在成虫期未见表达[5 ~ 7],推测该类基
因可能在固着性内寄生线虫侵染或诱导形成取食
位点过程中起作用。 与上述固着性内寄生线虫的
发育表达模式不同,来源于松材线虫的 3 个类毒过
敏原蛋白基因 mRNA在线虫不同发育阶段均有表
达[9],这种持续性表达模式与松材线虫作为迁移
性内寄生线虫,侵染、迁徙和取食行为贯穿整个生
活周期的特性之间是否存在必然联系值得商榷。
考虑到 mRNA-蛋白质表达水平存在不一致性,我
331
　
植物病理学报 43 卷
们有必要针对已获得的松材线虫类毒过敏原蛋白
基因进行更加详尽的蛋白表达和定位分析,从而为
进一步探讨该类基因的功能提供一定的依据。
为了满足松材线虫类毒过敏原蛋白的免疫学
检测的实验需求,本研究最初计划表达及纯化松材
线虫类毒过敏原蛋白基因的去信号肽重组蛋白,因
为在原核表达中去除信号肽序列不会对表达蛋白
的生物学活性产生影响,并能避免由于信号肽序列
的高疏水性抑制大肠杆菌细胞的生长和目的蛋白
的表达[15,16]。 另外,外源基因在大肠杆菌中的表
达水平受多种因素影响,其中一个重要的因素就是
当外源真核基因中含较多的中低频率使用的稀有
密码子时会严重影响翻译的进程,进而影响目的蛋
白的表达效果[17]。 由于松材线虫类毒过敏原蛋白
基因含有大肠杆菌中很少使用的密码子,特别是在
成熟蛋白序列氨基端附近出现了多个成串排列的
精氨酸稀有密码子可能造成其在大肠杆菌中的表
达困难。 对松材线虫类毒过敏原蛋白基因的去信
号肽重组蛋白我们尝试了多种表达载体及诱导条
件均未获得表达,随后对基因进行大肠杆菌优势密
码子改造,利用 Donato 等[12]建立的重叠延伸 PCR
合成基因的方法获得优化密码子的类毒过敏原蛋
白基因的成熟蛋白基因序列,构建原核表达载体,
最终获得了该基因的融合蛋白。 以上工作也可作
为解决外源基因难于表达类似问题的有益尝试,如
Bxvap1 和 Bxvap3,使用本方法也成功获得了相应
蛋白的高效表达,目的蛋白分别占细菌总蛋白的
40. 1% 和 68. 8% 。 除此之外,本文进一步利用
BXVAP2 去信号肽重组蛋白对大白兔进行免疫,
实验结果表明重组蛋白能使大白兔产生高效价的
抗体,为完成该蛋白的免疫学检测奠定了基础。
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责任编辑:李晖
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