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Identification of the bacterial leaf spot pathogen of betel palm in Hainan Province

海南槟榔细菌性叶斑病病原鉴定



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  44(6): 700 ̄704(2014)
收稿日期: 2014 ̄03 ̄18ꎻ 修回日期: 2014 ̄08 ̄23
基金项目: 海南省自然基金项目 ( 312041)ꎻ海南省重大科技项目 ( ZDZX2013008)ꎻ中央级公益性科研院所基本科研业务费专项
(1630052012016)
通讯作者: 覃伟权ꎬ研究员ꎬ主要从事热带油料作物及棕榈科植物病虫害防治研究ꎻ电话:0898 ̄63330001ꎻE ̄mail:QWQ268@163.comꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2014.06.018
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研究简报
海南槟榔细菌性叶斑病病原鉴定
唐庆华1ꎬ 张世清2ꎬ 牛晓庆1ꎬ 朱 辉1ꎬ 余凤玉1ꎬ 宋薇薇1ꎬ 覃伟权1∗
( 1中国热带农业科学院椰子研究所ꎬ文昌 571339ꎻ2中国热带农业科学院热带生物技术研究所ꎬ海口 571101)
Identification of the bacterial leaf spot pathogen of betel palm in Hainan Province 
TANG Qing ̄hua1ꎬ ZHANG Shi ̄qing2ꎬ NIU Xiao ̄qing1ꎬ ZHU Hui1ꎬ YU Feng ̄yu1ꎬ SONG Wei ̄wei1ꎬ Qin
Wei ̄quan1   ( 1Coconut Research Instituteꎬ Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences CATASꎬ Wenchang 571339ꎬ
Chinaꎻ 2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnologyꎬ CATASꎬ Haikou 571101ꎬ China)
Abstract: In 2008ꎬ a severe bacterial disease was observed in Wenchangꎬ Hainan Province. Symptoms consis ̄
ted of small circular to elongated brown lesions surrounded by yellow halos. All isolatesꎬ which formed white
coloniesꎬ were gram ̄negative and each had a singleꎬ polarꎬ sheathed flagellum. Isolates were oxidase and cata ̄
lase positiveꎬ negative for arginine dihydrolaseꎬ gelatin hydrolysis and starch hydrolysisꎬ and acid production
from levan. Sequences of the 16S rDNA gene of the isolates shared 98% sequence identity with that of Burkhold ̄
eria andropogonis strain LMG2129 (GenBank accession No. NR118985) . Pathogenicity tests were conducted
and fulfilled Kochs postulatesꎬ indicating that these isolates are causative agent of the disease. The results led to
the conclusion that the causal pathogen of betel palm bacterial leaf spot was B. andropogonis. It is the first report
of B. andropogonis causing bacterial leaf spot of betel palm in mainland China.
Key words: bacterial leaf spot of betel palmꎻ Burkholderia andropogonisꎻ molecular identification
文章编号: 0412 ̄0914(2014)06 ̄0700 ̄05
    槟榔(Areca catechu L.)属棕榈科常绿乔木ꎬ
是我国四大南药之一ꎬ具有固齿杀菌、消化积食、驱
虫等功效ꎮ 槟榔还是世界著名的三大口腔嗜物之
一ꎬ为我国海南及湖南等部分地区群众所喜好ꎮ 目
前ꎬ海南省槟榔年产值超过 30亿元ꎬ已发展为仅次
于橡胶的第二大热带作物ꎬ是琼海、屯昌等地 200
多万农民的主要经济来源之一[1]ꎮ 近年来ꎬ随着
种植面积不断扩大ꎬ其病害发生也日趋严重ꎬ给槟
榔生产带来严重损失ꎮ 2008 ~ 2012 年海南省文昌
市昌洒镇一槟榔园(4.67 ha)连续爆发细菌性病
害ꎬ致使该园槟榔至今尚未结果ꎮ 其症状具体表现
为叶片上发生周围伴有黄色晕圈的不规则形褐色
坏死病斑ꎬ重病株叶片黄化干枯ꎬ植株枯死ꎮ 鉴于
该病危害严重ꎬ我们对病原菌进行了常规程序鉴
定ꎬ以期为病害防治提高理论依据ꎮ
1  材料和方法
1.1  病原菌的分离与保存
    2010 ~ 2012 年从发病槟榔园内采集新鲜病叶
(图 1ꎬ2)ꎬ用肉汁胨培养基(NA)平板划线法分离
细菌ꎬ纯化获得 Y1 ~ Y30、W1 ~ W20 共 50 株菌ꎮ
全部菌株在 NA平板上生长特征表现一致ꎬ故后续
 
  6期 唐庆华ꎬ等:海南槟榔细菌性叶斑病病原鉴定
试验选取 4个菌株 Y11、Y30、W15 和 W20 作为代
表ꎬ其中菌株 Y11、Y30 保藏于中国典型培养物保
藏中心 (编号 CCTCC AB2014034 和 CCTCC
AB2014035)和中国普通微生物菌种保藏管理中心
(编号 CGMCC 1. 12337 和 CGMCC 1. 12338)ꎮ
Burkholderia andropogonis 标准菌株 LMG2129(即
ATCC23061)由中国检验检疫科学研究院赵文军
博士提供ꎮ 供试植物材料为本地槟榔品种ꎮ
1.2  致病性测定
    将菌株 Y11、Y30、W15 和 W20 在 NA 培养基
上 28℃培养 48 hꎬ用无菌水配制成 1.0×108CFU􀅰
mL-1细菌悬浮液ꎬ采用针刺法[2](用 25#皮下注射
针在叶面刺 15 ~ 20 个伤口ꎬ然后用灭菌脱脂棉蘸
取细菌悬浮液均匀涂抹叶面和叶背)活体接种槟
榔叶片ꎬ以无菌水为对照ꎮ 每株槟榔接种 3 片叶ꎬ
重复 3 次ꎮ 用塑料袋 26℃ ~ 28℃保湿 48 h 后去
袋ꎬ3 d后观察发病情况ꎮ 待症状出现后 15 dꎬ从
发病叶片上再分离病原菌ꎮ 同时ꎬ将 4个菌株接种
本氏烟(海南大学缪卫国教授提供)叶片ꎬ26℃ ~
28℃放置 48 hꎬ观察过敏性反应ꎮ
1.3  形态学观察
    革兰氏染色反应采用结晶紫草酸铵染色法ꎮ
将供试菌株在 NA培养基上培养 48 hꎬ用牙签挑取
菌落涂在载玻片上ꎬ固定ꎻ用结晶紫染剂染色 1
minꎬ水洗ꎻ然后用碘液处理 1 minꎬ水洗ꎻ再用 95%
的酒精褪色 30 sꎬ吸干ꎻ最后用复染剂染色 10 sꎬ水
洗ꎬ吸干后在 OLYMPUS CX21 型显微镜下观察细
菌形态ꎮ 培养性状等参考 Wen 等[2]和 Hseu 等[3]
的方法ꎬ在 NA、YDC 和 Kings B Medium(KB)培
养基上 28℃培养 2 d后观察菌落特征ꎮ
1.4  生理生化测定
    代表菌株 W15、W20、Y11、Y30 和标准菌株
LMG2129的生理生化反应测定方法参见 Hseu等[3]ꎮ
1.5  16S rDNA序列测定
    16S rDNA 扩增采用细菌通用引物 F27: 5′ ̄
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ̄3′ 和 1492R: 5′ ̄
AAGGAGGTGATCCAGCGGCA ̄3′ꎮ PCR 体系和
扩增条件参见 Hseu等[3]和 Lane[4]ꎮ PCR体系(25
μL): 10 × PCR Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μLꎬ dNTP
mixture(各 2.5 mM)2 μLꎬ引物(20 μmol􀅰L-1)各
0.5 μLꎬTaq酶(5 U􀅰μL-1)0.2 μLꎬ模板 DNA(20
mg􀅰L-1)1 μLꎬ补充灭菌双蒸水至 25 μLꎮ 扩增条
件:95℃ 5 minꎻ95℃ 1 minꎬ55℃ 1 minꎬ72℃ 1 minꎬ
30个循环ꎻ72℃延伸 8 minꎮ PCR 产物克隆到大肠
杆菌 JM109后(南京农业大学窦道龙教授惠赠)ꎬ选
3个阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司测
序ꎬ将测得的序列在 GenBank中进行比对分析ꎮ
2  结果与分析
2.1  病原菌的分离与致病性测定
    经平板划线法纯化ꎬ共分离得到 W15、W20、
Y11和 Y30 等 50个菌株ꎬ在 NA培养基上ꎬ所有菌
落均为白色(图 3)ꎮ 致病性测定结果表明ꎬ4 个菌
株均能在本氏烟上产生典型的过敏性坏死反应
(图 4)ꎻ在供试槟榔叶片的接种点先出现水渍状病
Fig. 1  Field symptoms of bacterial leaf spot
of betel palm
Fig. 2  Leaf symptom of bacterial leaf spot
of betel palm
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植物病理学报 44卷
Fig. 3  Colony morphology of Burkholderia
andropogonis strain Y30 on KBꎬ
NA and PDA plates
Fig. 4   The hypersensitive reaction elicited by
strain Y30 on Nicotiana benthamiana
(Blue circle: CKꎻ Red circle: Treatment)
Fig. 5  Leaf symptom of strain Y30 developed
a month after inoculation
Fig. 6  Negative control
Fig. 7  Gram stain of strain Y30 Fig. 8  Morphology of strain Y30 (Bar=950 nm)
斑ꎬ7 d 后病斑开始扩展ꎬ边缘出现黄色晕圈ꎬ此后
病斑缓慢扩展(图 5)ꎬ对照无明显症状(图 6)ꎮ 从
发病的槟榔叶片上重新分离到与接种细菌形态一
致的细菌ꎬ接种本氏烟叶片均可产生过敏性坏死反
应ꎮ 该结果表明 4个代表菌株均为致病菌ꎮ
2.2  病原细菌生理生化特征分析
    供试的 4个代表菌株及标准菌株 LMG2129均为
革兰氏阴性、杆状(图7)ꎬ具有一根极生鞭毛(图8)ꎬ
207
 
  6期 唐庆华ꎬ等:海南槟榔细菌性叶斑病病原鉴定
Table 1  Main physiological and biochemical characteristics of
bacterial leaf spot pathogen of betel palm
Character Strains from betel palm B. andropogonis strain LMG2129
KOH test G (﹣) G (﹣)
O / F test O O
Catalase + +
Fluorescent pigment on KB ﹣ ﹣
Levan production ﹣ ﹣
Yellow colonies on YDC ﹣ ﹣
Flagellar number 1 1
Diffusilble pigments ﹣ ﹣
Arginine dihydrolase ﹣ ﹣
Gelatin hydrolysis ﹣ ﹣
Starch hydrolyseis ﹣ ﹣
Oxidase + ﹣
  “﹣”: Negative reactionꎻ “ + ”: Positive reactionꎻ G (﹣): Gram negativeꎻ O: Oxidative.
主要生理特征为以氧化方式利用葡萄糖ꎬ不具有精
氨酸双水解酶活性ꎬ不能水解明胶和淀粉ꎬ不能产
生果聚糖ꎬ具有过氧化氢酶活性ꎻ但是ꎬ本实验供试
菌株具有氧化酶活性ꎬ与 LMG2129 结果不同ꎮ 根
据上述形态及生理生化特征(表 1)可初步确定 4
个菌株属伯克霍尔德氏菌类群ꎮ
2.3  病原菌 16S rDNA序列测定
    以 4个菌株基因组 DNA 为模板ꎬ用细菌 16S
rDNA通用引物和伯克霍尔德氏菌特异引物进行
PCR扩增ꎬ均获得预期大小的特异性扩增片段ꎮ
将所测得的序列与 GenBank 数据库比对ꎬ结果表
明 4个代表菌株的 16S rDNA序列(GenBank 登录
号 分 别 为 JX415479、 JX415481、 JX415482 和
JX415483)与须芒草伯克霍尔德氏菌株 LMG2129
相应片段(NR118985)的序列相似性为 98%ꎮ 根
据生理生化特征、菌落形态、致病性测定和序列分
析结果ꎬ供试菌株均被鉴定为须芒草伯克霍尔德氏
菌(Burkholderia andropogonis)ꎮ
3  讨 论
    我们从接种后发病的槟榔叶片上重新分离到
细菌ꎬ其菌落形态和 16S rDNA序列与初始代表菌
株一致ꎬ从而确认供试菌株为病原菌ꎮ 生理生化特
性测定显示该菌为革兰氏阴性ꎬ杆状ꎬ好氧性ꎬ具有
一根单极生鞭毛ꎬ有游动性ꎮ 该病菌在 YDC 培养
基上不产生黄色色素ꎬ在 KB培养基上也不产生荧
光色素ꎬ与 Hseu 等[3]和 Li 等[5]报道结果一致ꎬ推
断该菌属于 Burkholderia 属ꎻ16S rDNA 序列比对
结果表明 4 个供试菌株与 B. andropogonis 菌株
LMG2129相应序列同源性达 98%ꎮ 综合上述各项
生理生化测定结果和生物学特征及分子鉴定结果ꎬ
我们分离到的病原菌被鉴定为B. andropogonisꎮ
    2007 年ꎬ我国台湾省的 Hseu 等[3]首次报道
B. andropogonis可以侵染槟榔ꎮ 本课题组调查发
现发病槟榔叶片上发生褐色坏死病斑ꎬ病斑周围有
黄晕ꎬ病斑不规则形ꎬ严重者导致整片叶片黄化干
枯ꎬ症状与 Hseu 等[3]报道一致ꎮ 在 2012 年之前ꎬ
海南省槟榔上仅有细菌性条斑病危害的报道[2]ꎬ
但其病原菌为 Xanthomonas campestris pv. arecaeꎬ
而在中国大陆地区仅有 B. andropogonis 侵染高粱
和玉米(谢关林ꎬ私人联系)以及三角梅[5]的报道ꎮ
因此ꎬ本研究为首次报道中国大陆地区发生 B. an ̄
dropogonis引起的槟榔细菌性叶斑病ꎮ 我们随后
发现该病在三亚、琼海、定安等市县亦有发生ꎬ且常
在台风和雨季爆发ꎬ严重影响槟榔的生长和产量ꎮ
因此ꎬ有必要对该病开展综合防治技术研究ꎬ从而
确保海南省槟榔产业持续健康发展ꎮ
307
 
植物病理学报 44卷
参考文献
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2005ꎬ 89(10): 1132.
责任编辑:李晖
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