全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(3): 328鄄332(2011)
收稿日期: 2010鄄08鄄30; 修回日期: 2011鄄04鄄03
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30971892); 福建省自然科学基金资助项目(2009J01098; 2010J01109)
通讯作者: 陈庆河,博士,主要从事植物病理及分子生物学研究; Tel: 0591鄄87588129, E鄄mail: qinhechen@yahoo. com。
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研究简报
基于无毒基因的晚疫病菌指纹类型与致病型关系研究
李本金, 陈昌盛, 兰成忠, 黄灿强, 翁启勇, 陈庆河*
(福建省农业科学院植物保护研究所, 福州 350013)
Correlation between pathotype and DNA fingerprinting pattern based on avirulence
genes of Phytophthora infestans 摇 LI Ben鄄jin, CHEN Chang鄄sheng, LAN Cheng鄄zhong,
HUANG Can鄄qiang, WENG Qi鄄yong, CHEN Qing鄄he摇 ( Institute of Plant Protection, Fujian Academy of Agricultu鄄
ral Sciences, Fuzhou 350013, China)
Abstract: Four specific primers were designed according to the sequences of avirulence genes of Phytophtho鄄
ra infestans in GenBank and 88 P. infestans isolates from various regions were used for amplification by PCR
technique with the primers. Seven types of DNA fingerprinting were obtained by assortment of the bands of
PCR products. Meanwhile, pathotypes were identified with 11 different potato cultivars carrying known domi鄄
nant mono鄄genes R1鄄R11 according to the response of resistance and susceptibility, the results showed that 88
isolates were separated into 4 groups at 44% genetic similarity level. There was no obvious correlation be鄄
tween pathotype of the pathogen and DNA fingerprinting pattern based on avirulence genes in this study.
Key words: Phytophthora infestans; avirulence gene; DNA fingerprinting pattern; differential cultivar;
pathotype
文章编号: 0412鄄0914(2011)03鄄0328鄄05
摇 摇 由致病疫霉 Phytophthora infestans (Mont) de
Bary引起的晚疫病是马铃薯生产上可导致绝收的
世界性病害,在我国各地均有发生和流行[1]。 传
统的致病型鉴别只局限于表型上的分析,无法对复
杂多变的晚疫病菌致病型变化进行快速准确的预
测,因此有必要探索新的方法来弥补常规手段的不
足,以便更加准确有效地监测其变化趋势。 晚疫病
菌与寄主马铃薯这一病理体系中的单一抗性基因
和相应的无毒基因符合典型“基因对基因冶学说,
因此基于抗病基因与无毒基因的关系对晚疫病菌
分类将更为科学和实用。 到目前为止,已知的晚疫
病菌 无 毒 基 因 序 列 有 Avr1、 Avr2、 Avr3a 和
Avr4[2,3]。 本研究试图分析晚疫病菌基于无毒基
因的指纹类型与马铃薯鉴别品种划分的致病型之
间是否存在对应关系,以期进一步了解病原菌群体
结构特征及遗传变异本质,从而更好地指导抗晚疫
病育种和品种的合理布局。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
供试菌株:采集或征集我国福建、黑龙江、河
北、内蒙古、宁夏、甘肃、云南 7 省(区)的马铃薯晚
疫病标样或菌株,对采集的病叶或病果按 Zheng[4]
的方法进行病原菌分离纯化,菌株编号从 1 ~ 88
号。
供试鉴别寄主:从黑龙江克山马铃薯研究中心
引入一套完整的含有主效抗性单基因(R1 ~ R11)
以及无已知 R基因的感病材料( r),均为无菌保存
摇
摇 3 期 李本金,等:基于无毒基因的晚疫病菌指纹类型与致病型关系研究
的试管苗。
1. 2摇 引物设计
根据 GenBank已知的 2 个无毒基因序列 Avr1
(EEY66592)、Avr2 (EEY53870),采用 Primer5. 0
引物设计程序,设计不同基因序列的特异引物,无
毒基因 Avr3a 和 Avr4 特异引物参照文献[2,3]。
设计或引用的引物委托上海生物工程有限公司合
成。 无毒基因特异引物序列见表 1。
1. 3摇 PCR扩增
25 滋L 反应体系:2. 5 滋L 10 伊 PCR 缓冲液
(Mg2 + free)、 2. 0 mmol / L MgC12、 0. 2 mmol / L
dNTP、1. 0 U Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 大连宝生
物工程有限公司),0. 4 滋mol / L上引物,0. 4 滋mol /
L下引物,50 ng DNA 模板,不足部分由无菌去离
子水补足。
PCR反应参数: 94 益预变性 5 min; 然后
94 益 1 min, 58 ~ 62益 30 s,72 益 1 min, 35 个循
环,最后 72 益 延伸 10 min。 取 5. 0 滋L PCR 产物
于含 0. 5 滋g / mL EB 的 1. 5%琼脂糖凝胶电泳 55
min(85V),在凝胶成像系统上检测并拍照。
1. 4摇 数据分析
观察并记载 PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳
结果,将特异性条带的有无分别用“ + 冶和“ - 冶表
示,根据不同引物在同一菌株中的扩增结果,统计
菌株的指纹类型。
1. 5摇 致病型测定
鉴别寄主培育、孢子悬浮液制备、离体叶片接
种鉴定方法以及致病型的确定均参照 Li等[5]的方
法。
1. 6摇 病菌致病型的划分
根据 88 个菌株在 11 个含有单显性抗病基因
的马铃薯鉴别品种抗感反应,利用 NTSYS鄄pc 2. 1
统计分析软件(R记为 0,S记为 1)进行聚类分析,
划分菌株致病类型。
2摇 结果与分析
2. 1摇 不同特异性引物的 PCR扩增结果
用 4 对无毒基因特异引物对 88 个晚疫病菌株
基因组 DNA 进行 PCR 扩增结果表明:Avr1 引物
在 83 个菌株中扩增到 620 bp 的特异片段,占供试
菌株 94. 3% ;Avr2 引物和 Avr3a 引物分别在 85 个
和 82 个菌株中扩增到 375 bp 和 451 bp 的特异片
段,分别占供试菌株的 96. 6%和 93. 2% ;Avr4 引
物在 84 个菌株中扩增到 861 bp 的特异片段,占供
试菌株的 95. 5% ,各菌株除极少部分未扩增出条
带外,大多数都能得到特异性扩增片段。
根据特异性条带的有无,用 4 对特异引物进行
PCR扩增,理论上可以得到 16 种指纹类型。 本研
究中,88 个供试菌株有 74 个能被 4 对引物同时扩
增出特异性条带,划分为指纹类型淤;12 个菌株能
被 3 对引物扩增产生条带,根据条带组合划分为指
纹类型于、盂、榆、虞;有 2 个菌株分别被 1 对引物
扩增出特异性片段,它们出现在指纹类型愚、舆
(表 2)。
2. 2 摇 不同菌株在马铃薯鉴别品种上的致病型测
定结果
供试的晚疫病菌株对鉴别寄主致病型测定结
果显示:88 个晚疫病菌株对 11 个已知抗性基因的
毒性频率有明显差异,对 R3 的毒性频率最高,为
98. 9% ,对 R7 的毒性频率为 86. 4% ,对 R4 的毒性
频率为 65. 9% ,R11、R10、R6 的毒性频率在28. 4%
~ 48. 9%之间,对 R1、R8 的毒性频率均为 18. 2% ,
对 R2、 R5 的毒性频率较低,分别为 10. 2% 和
9郾 1% ,对 R9 的毒性频率最低,为 2. 3% 。
Table 1摇 Primer sequences of avirulence genes
Avirulence
gene
Forward primer
(5忆 - 3忆)
Reverse primer
(5忆 - 3忆)
Annealing
temperature / 益
Avr1 ATGGGCTTAATGCACCGC TTAAAATGGTACCACAACATG 59
Avr2 ATGCGCGCAACGTATATTC TTAGTCCTTATCGATCGCTT 61
Avr3a CCATGCGTCTGGCAATTATGCT CTGAAAACTAATATCCAGTGA 58
Avr4 ATGCGTTCGCTTCACATTTTGCTGG CTAAGATATGGGCCGTCTAGCTTGGAG 62
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植物病理学报 41 卷
Table 2摇 Relationship between pathotype and fingerprinting type of 88 isolates from
different origin based on avirulence genes
F. P. T
Avirulence gene
Avr1 Avr2 Avr3a Avr4
Isolate code Pathotype
淤 + + + +
1,2,3,4,6,7,8,10,11,12,15,16,17,18,19,20,22,23,
24,25,26,29,31,32,33,34,35,37,38,39,40,41,42,43,
44,45,46,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,
61,62,63,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,77,78,
79,80,81,82,83,86,87,88
玉,域,芋,郁
于 + + + - 47,85 玉
盂 + + - + 5,27,28,76 玉
榆 + - + + 13,84 玉,芋
虞 - + + + 9,21,36,64 玉,域,芋
愚 + - - - 14 玉
舆 - + - - 30 芋
Note: F. P. T: Finger鄄printer types; “ + 冶showing a special band; “ - 冶without a special band.
摇 摇 根据供试菌株在马铃薯鉴别寄主上的抗感反
应,在遗传相似系数 0. 44 的位置,将供试菌株划分
为 4 种致病类型。 其中有 73 个菌株属于玉型,约
占供试菌株 83. 0% ,3 个菌株属于域型,9 个菌株
属于芋型,3 个菌株属于郁型(图 1)。
2. 3摇 晚疫病菌致病类型与指纹类型的关系分析
基于无毒基因划分的指纹类型淤有 74 个菌
株,所对应的致病型有 4 种,分别为玉、域、芋、郁;
指纹类型于、盂、愚分别有 2、4、1 个菌株,对应的致
病型均为玉;指纹类型榆有 2 个菌株,对应的致病
型有 2 种,即玉、芋;指纹类型虞有 4 个菌株,对应
的致病型为玉、域、芋;也可以说致病型玉对应了 6
种不同的指纹类型,域对应了 2 种指纹类型,芋对
应了 4 种指纹类型,郁只对应 1 种指纹类型(表
2)。 根据本研究结果表明,指纹类型与致病型间
不存在一一对应关系。
3摇 讨论
本研究基于晚疫病菌无毒基因 Avr1、Avr2、
Avr3a、Avr4 序列设计或引用 4 对特异引物,对 88
个晚疫病菌基因组 DNA进行 PCR扩增,能得到特
异性扩增片段的菌株分别占供试菌株的 94. 3% 、
96. 6% 、93. 2%和 95. 5% ,但致病型测定结果却表
明,抗性基因 R1、R2、R3、R4 分别能被供试菌株中
18. 2% 、10. 2% 、98. 9%和 65. 9%的菌株所侵染,
可见,这 4 个抗病基因在群体中被病原菌克服的频
率均偏高,尤其是 R3 和 R4,其原因可能是由于晚
疫病菌无毒基因序列的突变或碱基缺失等而导致
无毒性丧失,进而导致病原菌产生致病型的改变。
本试验供试的 88 个菌株有 74 个能被 4 对引物同
时扩增出特异性条带,表明无毒基因序列在晚疫病
菌中高度保守。 部分菌株在特异引物下不能扩增
出特异性条带,可能是因为该基因在引物序列结合
位点区域发生了变异或缺失。 为此,我们将进一步
对扩增条带进行测序比较,明确晚疫病菌致病型变
化的分子机制。
本试验根据每个菌株特异性条带的有无统计
其指纹类型,分析指纹类型与致病型之间的关系,
发现同一指纹类型分布于不同致病型中,同一致病
型也包含多个指纹类型,指纹类型与致病型之间未
发现明显的对应关系,这可能与特异性引物的数目
有关,根据 4 对特异引物,产生的理论指纹类型为
16 种,本结果仅得到 7 种指纹类型,已获得的指纹
类型远不足覆盖复杂多变的晚疫病菌群体。 此外,
指纹类型愚和舆均只出现 1 个菌株,不能确定这些
指纹类型是否对应菌株所属致病型的代表性的指
纹,需对更多的菌株进行研究验证。
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摇 3 期 李本金,等:基于无毒基因的晚疫病菌指纹类型与致病型关系研究
Fig. 1摇 Dendrogram by cluster analysis for 88 isolates of Phytophthora infestans
based on avirulence genes
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植物病理学报 41 卷
参考文献
[1] 摇 Yang S X, Li C H, Hao D H,et al. Phenotype charac鄄
teristics of Phytophthora infestans on winter鄄growing
potato in Dehong district of Yunnan province ( in
Chinese)[ J] . Acta Phytopathologica Sinica(植物病
理学报), 2007, 37(1):18 -24.
[2] 摇 Armstrong M R, Whisson S C, Pritchard L, et al. An
ancestral oomycete locus contains late blight avirulence
gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in
the host cytoplasm[J] . Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2005, 102(21): 7766 -7771.
[3] 摇 van Poppel P M J A, Guo J, Van de Vondervoort P J
I, et al. The Phytophthora infestans avirulence gene
Avr4 encodes an RXLR鄄dEER effector [ J ] . Mol. Plant鄄
Microbe Interact, 2008, 21(11): 1460 -1470.
[4] 摇 Zheng X B. Phytophthora and its research technology ( in
Chinese)[M] . China Agriculture Press(中国农业出版社),
1997.
[5] 摇 Li B J, Lv X, Lan C Z,et al. Mating type, metalaxyl sensiti鄄
vity and physiological races of Phytophthora infestans in Fujian
Province ( in Chinese)[J] . Acta Phytophylacica Sinica(植物
保护学报), 2008, 35(5):453 -457.
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于金枝
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