全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 437鄄440(2011)
收稿日期: 2010鄄10鄄21; 修回日期: 2011鄄03鄄10
基金项目: 国家自然科学基金项目(30571216); 山西省自然科学基金资助项目(20051071)
通讯作者: 牛颜冰,博士,教授,主要从事植物病毒学研究; Tel: 13835400019, E鄄mail: niuniugood@yahoo. com. cn。
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研究简报
臭椿病毒病病原鉴定
牛颜冰*, 姚 敏, 王德富, 王贵军, 弓 强
(山西农业大学生命科学学院, 太谷 030801)
Identification of the pathogenic virus on Ailanthus altissima 摇 NIU Yan鄄bing, YAO
Min, WANG De鄄fu, WANG Gui鄄jun, GONG Qiang摇 (College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University,
Taigu 030801, China)
Abstract: Leaves from Ailanthus altissima showing severe symptoms were selected and indexed by antigen鄄
coated plate (ACP) 鄄ELISA. Tobacco mosaic virus (TMV) was found in all the samples tested. By using
dsRNA as template, one鄄step RT鄄PCR was performed to confirm the presence of TMV with specific primers
designed for the partial movement protein gene (MP), and a fragment of about 470 bp(GenBank GU167975)
was amplified. Sequence analysis demonstrated that Ail isolate showed 75. 5% ~ 99. 6% identity with other
TMV isolates, and shared the highest identities of 99. 6% at nucleotide (nt) level with isolate B8 from Spain.
From the above, it can be concluded that the virus disease pathogen infecting Ailanthus altissima was TMV.
Key words: Ailanthus altissima; ACP鄄ELISA; dsRNA; RT鄄PCR; sequence analysis
文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0437鄄04
摇 摇 臭椿 ( Ailanthus altissima)属苦木科 ( Sima鄄
roubaceae)落叶乔木,为我国常用中草药;以根
皮入药,具有消炎、杀菌、杀虫、抗肿瘤及抗病毒
等作用 [1] ;亦可用在建筑、能源、环保和造纸等
方面,具有广阔的开发和应用前景。 已有研
究 [2]表明,引起臭椿花叶症状的病毒病原主要
是西瓜花叶病毒 ( WMV ) 和黄瓜花叶病毒
(CMV)等马铃薯 Y 病毒属病毒。 而笔者 2008
年进行药用植物病害调查时,发现山西晋中地
区许多臭椿叶片也呈典型的花叶症状,有的叶
片已成畸形、甚至脱落,严重影响了臭椿的正常
生长和根皮的产量,但其病原尚不清楚。 为此
本试验通过多种检测手段对该病毒病病原进行
了鉴定,以确定该病毒分离物的种类,为进一步
防治此病害打下基础。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
臭椿病样(花叶症状)采自山西太谷。 病原分
离物经苋色藜 3 次单斑分离后保存于普通烟上。
马铃薯 Y 病毒(Potato virus Y,PVY)多克隆抗体
及番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、黄
瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草
花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和芜菁花
叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)单克隆抗体均
由西南大学植物保护学院植物病理学系青玲教授
提供,TMV鄄MP 引物由本实验室提供。 其他相关
试剂均为分析纯。
1. 2摇 方法
1. 2. 1 摇 抗原直接包被 ELISA(ACP鄄ELISA)测定
摇
植物病理学报 41 卷
测定时每个样品均设 3 次重复,P / N > 2. 1 作为阳
性判断标准。 所用抗体为 PVY、 ToMV、 CMV、
TMV和 TuMV。
1. 2. 2摇 植物病原双链 RNA(dsRNA)的提取摇 参
考 Tzanetakis等[3]的方法进行,并加以修改。
1. 2. 3 摇 RT鄄PCR 检测 摇 以所提取的病样 dsRNA
为模板进行 RT鄄PCR检测,同时以健康臭椿为阴性
对照。 RT鄄PCR反应程序为:50益反转录 30 min;
94益预变性 3 min; 94益变性 1 min,53益 退火
1 min,72益延伸 1 min,30 个循环;72益延伸 10
min,4益保存。 反应结束后,进行琼脂糖凝胶电泳
检测。
1. 2. 4摇 PCR产物的克隆及序列分析摇 将所得 RT鄄
PCR产物纯化后,与 pGEM鄄T easy 载体连接并转
化宿主菌 DH5琢;阳性克隆通过 PCR 和酶切鉴定
后,送至北京博迈德生物技术有限公司进行测序。
核苷酸序列同源性采用 DNAMAN软件进行分析,
其它国家病毒分离物的核苷酸序列来自美国国家
生物技术信息中心数据库 ( http: / / www. ncbi.
nlm. nih. gov)。
2摇 结果与分析
2. 1摇 血清学测定
以 TMV、PVY、ToMV、CMV 和 TuMV 5 种病
毒的抗血清对 6 个臭椿样品进行 ACP鄄ELISA 检
测,结果(图 1)表明,6 个臭椿样品均仅对 TMV抗
血清呈阳性反应,初步确定臭椿被 TMV感染。
2. 2摇 dsRNA的提取
对经 TMV抗体 ELISA 检测呈阳性的臭椿样
品提取病毒 dsRNA,并以健康臭椿植株作阴性对
照,1%琼脂糖凝胶电泳分离到大小约为 6 400 bp
的一条带(图 2),与烟草花叶病毒 dsRNA 大小相
一致。
2. 3摇 RT鄄PCR检测
以提取的病叶 dsRNA 为模板, TMV鄄MP鄄F /
TMV鄄MP鄄R为引物进行 one step RT鄄PCR 扩增,扩
增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测,得到大小为
470 bp目标片段,与预期的片段大小相符(图 3)。
2. 4摇 序列同源性分析
对阳性重组质粒进行序列测定,确认所插入的
TMV鄄MP 片段均为 470 bp (GenBank 登录号为
GU167975),并将其命名为 Ail。 对 Ail 与 Gen鄄
Bank上收录的 18 个不同来源 TMV分离物进行序
列同源性分析,从表 1 可见,Ail分离物与其他国家
TMV分离物的核苷酸同源性在 75. 5%~ 99. 6%之
间,其中与西班牙 B8 分离物同源性最高,与哈萨
克斯坦 K3 分离物和俄罗斯 K1 分离物同源性
最低。
Fig. 1摇 The results of ELISA for Ailanthus altissima samples
834
摇
摇 4 期 摇 牛颜冰,等:臭椿病毒病病原鉴定 934
摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 2 摇 Electrophoresis of dsRNA extracted
from infected Ailanthus altissima
M: DL 6000 DNA marker; CK: Healthy plants; 1: Sample
1; 2: Sample 3; 3: Sample 5.
Fig. 3摇 RT鄄PCR detection of Tobacco mosaic
virus (TMV) 鄄MP
M:DL 2000 DNA marker; 1: Healthy plants; 2: Infected
plants
3摇 讨论
本研究利用血清学、RT鄄PCR 检测和核苷酸序
列分析等方法,鉴定出感染臭椿的病毒病原为烟草
花叶病毒(TMV),并将其命名为 Ail。 该分离物与
已报道的 18 个 TMV分离物的核苷酸序列同源性
为 75. 5%~ 99. 6% ,与西班牙 B8 分离物的同源性
最高。 本研究不但发现 TMV 可感染臭椿,使叶片
表现花叶症状,并且还观察到感病臭椿植株上仍有
健康叶片存在,这与前人发现臭椿具有抗TMV作
用相一致,说明臭椿中很可能存在抗 TMV 的活性
物质,但二者的互作机理还有待进一步研究。
RNA病毒(约 90%的植物病毒是 RNA 病毒)
在植物细胞内复制产生正常组织中不存在的、包含
病毒基因组所有信息的 dsRNA,对该 dsRNA 进行
RT鄄PCR扩增可获得病毒基因组全序列或部分基
因序列,将病毒分类定位到种的水平。 此方法不但
可用于病毒复合侵染的检测,甚至还能发现新病
毒,弥补传统病毒检测方法之不足。 Niu 等[4]、
Xiang等[5]应用反转录和 PCR 分步检测技术,以
dsRNA 为模板分别检测了梨脉黄病毒、甜菜坏死
黄脉病毒和草莓病毒。 本研究采用改进的 dsRNA
提取方法抽提病叶 dsRNA(即利用 5 ~ 10 g染病幼
叶,便可获得较多的病毒 dsRNA),并以此为模板
进行一步 ( one鄄step) RT鄄PCR,使 cDNA 合成和
PCR扩增在同一管内进行,减少了 RNase 降解的
机会,消除了交叉污染,并对病毒基因的核苷酸序
列进行了分析,建立了有效的病毒检测技术,为进
行药用植物病毒病病原的检测和有针对性的病害
防治奠定了基础。
参考文献
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dsRNA as template ( in Chinese) [J] . Journal of Fruit
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[5] 摇 Xiang B C, Zeng Y L, Xi D H, et al. Application of
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of Benyvirus ( in Chinese) [ J] . Acta Phytopathologi鄄
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责任编辑:李晖
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