全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 43(3): 328 ̄332(2013)
收稿日期: 2012 ̄03 ̄18ꎻ 修回日期: 2013 ̄04 ̄05
基金项目: 四川省教育厅重点项目(08ZA054)
通讯作者: 叶华智ꎬ教授ꎬ博导ꎬ主要从事植物抗病性研究ꎻ Tel: 0835 ̄2882547ꎬ E ̄mail: yhz@sicau. edu. cnꎮ
研究简报
巢豆油壶菌与蚕豆相互作用下植物内源激素的动态
严吉明ꎬ 叶华智∗
(四川农业大学ꎬ 雅安 625014)
Dynamics of endogenous phytohormone in broad bean leaf infected by Olpidium
Viciae YAN Ji ̄mingꎬ YE Hua ̄zhi (Sichuan Agricultural Universityꎬ Yaan 625014ꎬ China)
Abstract: To understand the physiological mechanism of induced histopathology and symptom of broad bean
blister caused by Olpidium Viciaeꎬ the endogenous phytohormone levels of Zeatin (ZT)ꎬ Indoleacetic acid
(IAA)ꎬ Gibberellin (GA)ꎬ Cytokinins (KT) and Abscisic acid (ABA) in diseased and healthy tissues of leav ̄
es were determined by High Performance Liquid Chromatography (HLPC) . The results showed that the levels of
five endogenous hormones were higher in diseased tissues than in healthy tissues. At the early period of symptom
developmentꎬ a large increase in level of five hormones in the diseased tissue was detected along with active the
cell division. At the late period of symptom developmentꎬ the cell division in tumor tissues gradually stopped
with the exception of a continuous increase in the rate of GA in tumor tissue. The increase rate of other hor ̄
mones in tumor tissues decreased obviously but the contents of those hormones were still higher in diseased tis ̄
sues than in healthy tissues. Changes in level of five endogenous hormones in diseased tissues reflected physio ̄
logical mechanism of inducing histopathological change and symptom of broad bean blister.
Key Words: broad beanꎻ Olpidium Viciaeꎻ phytohormoneꎻ physiological pathological changeꎻ broad bean
blister
文章编号: 0412 ̄0914(2013)03 ̄0328 ̄05
蚕豆火肿病由巢豆油壶菌(Olpidium Viciae
Kusano)引起ꎬ症状特点是病部产生小瘤状突起ꎮ
我们对该病的组织病理学研究[1]表明是一种增生
型组织病变ꎬ病菌仅定殖在侵入叶、茎的表皮细胞
内ꎬ病菌的侵染引起邻近侵染点的表皮细胞及其下
的叶肉细胞或茎的皮层组织细胞转化为分生细胞ꎬ
并不断分裂增生和细胞体积增大ꎬ导致蚕豆病组织
发生畸形增生的病理解剖改变ꎬ是病部产生瘤状物
的组织学机制ꎮ 前人对一些增生型组织病变病害
的研究结果发现是由于病组织内的内源激素水平
改变所致[2]ꎮ 蚕豆火肿病这种增生型病变是否与
内源激素水平改变有关? 其变化特点怎样? 至今
尚未有研究报导ꎮ
本研究的目的是采用高效液相色谱法测定蚕
豆火肿病病、健组织内的内源激素水平变化ꎬ探索
内源激素的病理变化与组织病变的关系ꎬ从而揭示
巢豆油壶菌与蚕豆在生理生化水平上的相互作用ꎮ
1 材料与方法
1. 1 植物材料
蚕豆品种为松潘红蚕豆ꎮ 从田间采集发病程
度不同的蚕豆火肿病病株ꎬ装入塑料袋ꎬ放入有冰
3 期 严吉明ꎬ等:巢豆油壶菌与蚕豆相互作用下植物内源激素的动态
块的塑料保温箱内ꎬ带回实验室供测试用ꎮ 测试样
本采用目测和组织病变程度结合取样ꎬ分为二类ꎮ
①症状发展初期样本:即病组织的瘤状物开始形
成ꎬ处于发展阶段ꎬ此时内部细胞在不断分化和分
裂增生(图 1A)ꎻ②症状发展后期样本:病瘤增大
和病瘤内部细胞分裂增生趋于稳定(图 1B)ꎮ 用
解剖剪剪取病瘤组织ꎬ并在相应叶片剪取健康叶组
织块(约 5 ×5 mm)ꎮ 样本立即冻存于 -20 ℃备测
定用ꎮ
1. 2 主要仪器和试剂
高效液相色谱仪(型号 LC ̄20Aꎬ日本岛津公
司)ꎻ超纯水机(LKBꎬ美国)ꎻ旋转蒸发仪(R220ꎬ瑞
士 BUCHI 公司)ꎻ真空泵(SHZ ̄D 型ꎬ巩义市英峪
予华仪器厂)ꎻ电子天平(BSA ̄124Sꎬ德国赛多利
斯)ꎮ
主要试剂:3 ̄吲哚乙酸( IAA) (成都科龙化工
公司)ꎻ6 ̄糠氨基嘌呤(KT)(成都科龙化工公司)ꎻ
赤霉素(GA3)(Sigma)ꎻ脱落酸(ABA) (上海蓝季
科技发展有限公司)ꎻ玉米素(ZT)(上海生物科技
有限公司)ꎻ以上试剂纯度均为≥99. 0% ꎮ 石油
醚、乙酸乙酯、冰乙酸均为分析纯(成都科龙化工
公司)ꎻ甲醇(色谱纯ꎬFisher公司)ꎮ
激素标准品分别溶于甲醇中ꎬ配制浓度分别是
ZT:4. 24 μg / mL、GA3:71. 0 μg / mL、KT:24. 4 μg /
mL、IAA:4. 40 μg / mL、ABA:2. 24 μg / mLꎮ
1. 3 样本内源激素的提取 参见文献[3]
将病、健样本分别按下列步骤和方法提取样本
的内源激素ꎬ整个实验过程在弱光低温下进行ꎮ
①5. 0 g低温保存样品用液氮研磨ꎬ加入冷的
50 mL 80%甲醇ꎬ4℃避光浸提过夜ꎻ
②浸提液抽滤ꎬ残渣再分别用 40 mL、20 mL
80%甲醇洗提 2 次ꎬ每次 2 hꎬ抽滤后合并滤液ꎬ于
旋转蒸发仪上 38 ~ 40℃减压浓缩至干ꎻ
③依次用 10 mL的磷酸缓冲液(0. 02 mol / Lꎬ
pH 8. 0)和 10 mL 石油醚分 2 次冲洗蒸馏瓶ꎬ将冲
洗液合并ꎻ
④冲洗液用等体积石油醚脱色 3 次ꎬ取水相ꎬ
弃醚相ꎻ
⑤调水相 pH至 8. 0ꎬ用等体积乙酸乙酯萃取
3 次ꎬ取酯相ꎻ将萃取的水相合并ꎬ调 pH 至 3. 0ꎬ用
等体积乙酸乙酯再萃取 3 次ꎻ取所有萃取液中的酯
相ꎬ40℃减压浓缩至干ꎻ
⑥用 80%甲醇溶解蒸馏物并冲洗蒸馏瓶ꎬ定
容至 10 mLꎬ过 0. 45 μm超微滤膜ꎬ供 HPLC分析ꎮ
1. 4 测定方法[3]
由于各种激素同时存在于植物体内ꎬ在调控生
理过程中有协同作用ꎬ因此采用高效液相色谱法同
Fig. 1 Histopathological changes in leaf tissue cross section through tumor and
uninfected zone of broad bean leaf infected by Olpidium Viciae
A: Tissue cross section of early period symptom showing the epidermal cells (ec)ꎬ palisade mesophyll cells (pmc) and spongy
mesophyll cells (smc) were converted into meristematic cells (mc) and rapid divisionꎻthe uninfected zone (unz) .
B: Tissue cross section of late period symptom showing the hyperplasia in leaf tissue was resulted from cell swellꎬ
the cell division gradually stoppedꎬ zoosporangia (zsp) and the uninfected zone (unz) .
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植物病理学报 43 卷
时测定样本中的几种激素ꎬ有利于了解其作用机
理ꎮ 在正式测定前ꎬ对方法的最低检测限、线性范
围、精密度、稳定性、重复性和加样回收率进行测
定ꎬ并对色谱条件进行优选ꎬ最终确定的色谱条件
是:色谱柱:Diamonsil C18 (150 mm × 4. 6 mmꎬ
5 μm)ꎻ流动相:甲醇 - 0. 075% 冰乙酸水溶液
(45∶ 55ꎻv / v)ꎻ紫外检测波长:254 nmꎻ流速:0. 7
mL / minꎻ柱温:20℃ꎻ进样量:10 μLꎻ此条件用于同
时检测样本中 5 种内源激素的含量ꎬ每种样本重复
测定 3 次ꎮ 测定数据采用 EXCLE 进行统计分析ꎬ
计算重复间测定值的标准差ꎬ进行平均值的成对二
样本 t检验ꎬ确定处理间的差异显著性ꎮ
2 结果
2. 1 测定方法和条件的优化结果
在上述色谱条件下测定 5 种内源激素 ̄ZT、
GA3、KT、IAA和 ABA 的最低检出限(LOD)分别
为 0. 047 4 mg / L、2. 186 4 mg / L、0. 058 3 mg / L、
0 230 9 mg / L 和 0. 102 6 mg / Lꎻ线性范围分别为
0. 424 ~ 40. 280 mg / L、7. 104 ~ 355. 200 mg / L、
2 440 ~ 97. 600 mg / L、0. 440 ~ 30. 800 mg / L 和
0 224 ~ 5. 600 mg / Lꎻ精密度试验的相对偏差
(RSD)分别为 0. 48% 、1. 1% 、0. 47% 、0. 16% 和
3 9% ꎬ表明测定体系精密度符合要求ꎻ样品液在 0
~ 12 h 内的稳定性测定的 RSD 分别为 0. 62% 、
0 69% 、0. 66% 、3. 9%和 3. 1% ꎬ结果显示样品液
在 12 h 内较稳定ꎻ重复性测定的 RSD 分别为
0 68% 、 4. 8% 、 1. 4% 、 1. 0%和 2. 0% ꎬ说明该方
法重显性好ꎻ加样回收率分别为 95. 6% 、93. 2% 、
87. 8% 、104%和 91. 4% ꎮ 表明回收率高ꎮ
色谱条件的优选结果是:综合比较 5 种流动相
对 5 种激素的分离效果ꎬ以甲醇 - 0. 075%冰乙酸
(45∶ 55ꎬv / v)最好ꎻ采用 0. 4 ~ 1. 0 mL / min四种流
速等度洗脱ꎬ最佳流速为 0. 7 mL / minꎻ对五种激素
标准液的吸收波长范围扫描ꎬ均在 250 ~ 270 nm范
围ꎬ考虑到 UV ̄检测器在 254 nm的灵敏度最高ꎬ故
选用 254 nm作为 5 种激素的扫描波长ꎮ
2. 2 5 种内源激素的动态变化
蚕豆被巢豆油壶菌侵染后ꎬ病部组织内 5 种内
源激素 ̄ZT、KT、IAA、GA和 ABA水平均发生明显
变化ꎬ经统计分析迖显著水平(图 2)ꎮ 总的变化趋
势是:蚕豆叶片病组织中的五种激素均较健康组织
高ꎻ病叶组织中的激素水平随症状发展和内部组织
病理变化而变化ꎮ 在症状发展初期ꎬ病瘤增大和病
组织细胞迅速分裂、增生时(图 1A)ꎬ病组织内的
五种激素水平均明显上升ꎬ尤以细胞分裂素类的玉
米素(ZT)和激动素(KT)水平上升幅度最大ꎬ增长
率分别为 144. 73%和 103. 59% ꎻ在症状发展后期ꎬ
即病瘤体积的增大和内部细胞分裂、增生趋于停
止ꎬ细胞变肿大(图 1B)ꎬ除赤霉素(GA)增长率达
208. 73% ꎬ明显较前期高外ꎬ病组织中的其它激素
水平增长率较前期降低ꎬ玉米素(ZT)和激动素
(KT)增长率分别为 42. 04%和 64. 47% ꎬ但病组织
中的各激素含量仍高于健康组织ꎮ
3 讨论
植物被病原物侵染后ꎬ病原物和寄主发生相互
作用ꎬ引起植物产生一系列病理变化ꎬ其中植物内
源激素水平的改变是生理病变的一个重要方面ꎬ在
一些植物病害发生过程中起着非常重要的作
用[2]ꎮ 对巢豆油壶菌侵染蚕豆引起蚕豆内源激素
水平变化的研究结果揭示了五种激素在蚕豆病健
组织中的变化特点ꎬ即病瘤组织中的五种内源激素
水平均高于健康组织ꎮ 这一结果与一些增生型病
害病组织内的某些激素水平升高相一致[2]ꎬ不同
之处是蚕豆的多种激素水平均发生改变并表现出
植物激素在病变中的相互协同作用ꎮ 一般报导认
为生长素( IAA)能协同细胞分裂素(ZT、KT)促进
细胞分化、分裂和增生ꎮ 在蚕豆病组织细胞分化和
大量分裂增生时这 3 种激素的水平也明显升高ꎮ
因此可以认为在蚕豆与巢豆油壶菌相互作用下引
起 IAA、ZT 和 KT 水平的升高是胁迫侵染点邻近
的表皮细胞和其下叶肉细胞转化为分生细胞并不
断分裂增生(图 1 ̄A)的因素或条件ꎮ 这一论断与
前人[4]认为一些已分化并组成了植物基本组织的
细胞仍具有潜在的分生能力ꎬ在某些条件或因素胁
迫下ꎬ可以转化为分生组织细胞并不断分裂增生的
论断相符ꎮ 赤霉素(GA)能促进细胞伸长ꎬ在蚕豆
火肿病症状发展后期ꎬ赤霉素水平出现大幅上升促
进了病瘤中增生细胞的伸长ꎬ从而使病瘤细胞体积
增大ꎬ病瘤更加膨肿(图 1 ̄B)ꎮ 蚕豆病组织中这些
激素的变化动态与其组织病理变化是同步的ꎬ因此
蚕豆火肿病病组织内激素水平升高是导致蚕豆发
033
3 期 严吉明ꎬ等:巢豆油壶菌与蚕豆相互作用下植物内源激素的动态
Fig. 2 Endogenous hormone levels in healthy and diseased leaf tissue
at different symptom development period
H = healthy tissueꎻ D = diseased tissue. Columns between healthy and diseased tissue with a different
letter are significantly different based on analysis of t ̄testꎬ Small letters represent the significant
difference at P =0. 05ꎻ Capital letters represent the significant difference at P =0. 01.
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植物病理学报 43 卷
生增生型组织病变和症状产生的生理机制ꎮ 脱落
酸(ABA)的生理功能一般是抑制生长、落叶和休
眠等作用ꎮ 在本研究中ꎬ脱落酸(ABA)水平上升
也很明显ꎬ它的变化似乎与蚕豆火肿病的增生型组
织病变无关ꎮ 新近对脱落酸在植物病害中的作用
报导认为[5]ꎬ植物病原物的侵染能诱导植物体内
ABA水平升高ꎬ是病原物和寄主植物相互作用的
一种病理生理改变ꎬ多数报导认为是感病的反映ꎮ
这为认识 ABA 在蚕豆火肿病病组织内的生理改
变和意义提供了一定依据ꎮ
植物被病原物侵染后ꎬ植物内源激素水平发生
改变ꎬ原因之一是某些病原物自身能产生激素ꎻ另
一原因是植物因病原物侵染使植物体内激素的合
成、分解、分配和运输受到影响ꎬ导致激素水平发生
改变[2]ꎮ 蚕豆被巢豆油壶菌侵染后ꎬ病瘤组织中
五种激素水平均发生升高ꎬ是何种原因? 由于油壶
菌不能在合成培养基上生长ꎬ不能像其它病原物用
培养液来验证ꎬ需要从研究植物激素代谢着手ꎬ这
是一项尚待植物生理学和植物病理学深入研究的
课题ꎮ 根据我们对巢豆油壶菌在病组织中的动态
和组织病变特点的研究[1]ꎬ初步推断可能是油壶
菌的侵染导致蚕豆激素的代谢发生改变造成升高ꎮ
理由是:①巢豆油壶菌仅定殖在被侵入的表皮细胞
内ꎬ被侵染的细胞不发生分化和分裂ꎮ 如果是病菌
产生激素ꎬ被侵染的细胞首先就应发生分化和分
裂ꎻ②病菌菌体是单细胞原质团、整体产果ꎬ蚕豆细
胞内仅有单个或少数几个菌体产生的激素量不足
以引起较大范围的蚕豆表皮细胞和叶肉细胞发生
病变ꎮ
致谢:感谢四川农业大学分析测试中心张利教授在
激素测定工作中给予的指导和帮助!
参考文献
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责任编辑:张宗英
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