全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 306-310(2012)
收稿日期: 2010-11-29; 修回日期: 2012-01-19
基金项目: 浙江省科技计划项目重点农业项目优先主题(2008C12003-3); 浙江省自然科学基金项目(Y307046); 中国西甜瓜产业技术
体系项目; 浙江省农业科学院创新提升工程以及国际合作项目
通讯作者: 王汉荣,研究员,主要从事植物病理学研究; Tel: 0571-86404224, E-mail:wanghrg@yahoo. com. cn。
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췍研究简报
不同甜瓜品种蔓枯病抗性与抗坏血酸
过氧化物酶基因表达的关系
任海英1, 李 岗2, 方 丽1, 茹水江1, 王汉荣1*
( 1浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所, 杭州 310021;
2浙江省植物有害生物防控重点实验室———省部共建国家重点实验室培育基地,浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州 310021)
Relationship between the resistance to gummy stem blight in the different varieties
of melon and the transcript profile of ascorbate peroxidase gene 　 REN Hai-ying1,
LI Gang2, FANG Li1, RU Shui-jiang1, WANG Han-rong1 　 ( 1 Institute of Plant Protection and Microbe, Zhejiang A-
cademy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China; 2 State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest
and Disease Control, Institute of Quality Standards for Agricultural Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hang-
zhou 310021, China)
Abstract: Ascorbate peroxidase gene (APX) plays important roles when plants are in stresses, low tempera-
ture and high humidity make it easy that melon are invaded by stem blight disease pathogen Didymella bryoni-
ae. The resistances of melon of 13 varieties to the disease were valued and APX relative expression levels after
the inoculation with D. bryoniae strain DB11 were analysed by real time RT-PCR. Eleven varieties with pelli-
cle were resistant to the disease, and 2 thick-skinned ones were high sensitive. It indicated that APX might
play roles in the melon resistance to stem blight disease, and the roles in different varieties were not the same.
Key words: melon; the resistance of gummy stem blight; ascrobate peroxidase gene
文章编号: 0412-0914(2012)03-0306-05
　 　 蔓枯病是威胁甜瓜最重要的病害之一,该病
是由西瓜壳二孢菌(Ascochyta citrullina Smith, 无
性世代是泄根亚隔孢壳 Didymella bryoniae)引起
的,在甜瓜的幼苗期至采收期均可发生。 在中国
厚皮甜瓜栽培品种中尚未发现蔓枯病抗性较好
且综合性状优良的品种,多数甜瓜抗蔓枯病材料
均为薄皮小果,关于甜瓜与蔓枯病菌的互作机理
目前报道较少[1] ,厚皮甜瓜和薄皮甜瓜与蔓枯病
菌的互作机理差异以及不同品种的薄皮甜瓜间
与蔓枯病菌的互作机理差异未见任何报道。 在
低温高湿环境下甜瓜发生蔓枯病的几率比在适
宜生长环境下大大增高,抗坏血酸过氧化物酶
(ascrobate peroxidase gene,APX,EC1. 11. 1. 11)
是植物耐受逆境胁迫的主要因子,调节活性氧水
平[2] ,与过氧化氢、一氧化氮一起参与防卫反应
和细胞死亡[3] ,有可能调节 MAPK 的级联反应,
应对多种环境胁迫因子[4] 。 本研究拟探讨不同
甜瓜品种与蔓枯病菌互作时 APX 转录水平的变
化,初步解释 APX 在甜瓜与蔓枯病菌互作中的
作用。
　
　 3 期 　 　 任海英,等:不同甜瓜品种蔓枯病抗性与抗坏血酸过氧化物酶基因表达的关系
1　 材料与方法
1. 1　 材料
本研究收集了浙江省农业科学院甜瓜育种单
位常用的 2 个厚皮甜瓜品种(浙江省农业科学院
蔬菜研究所张跃健馈赠)CM6(白色厚皮)和 CM7
(绿白相间网纹厚皮)、浙江省生产上常用的 8 个
商品性的薄皮甜瓜品种、2 个温州地方品种 CM8
和 CM9 以及 1 个黄色薄皮的抗性材料常规品种
(CM5)(张跃健馈赠),详见表 1。 甜瓜蔓枯病菌
强致病力菌株 DB11。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 甜瓜植株准备、蔓枯病菌分生孢子液制备
及苗期接种蔓枯病菌和抗性水平分析方法　 接种
用的甜瓜苗子准备、5 × 105 个孢子 /毫升的孢子悬
浮液制备和大棚温室苗子的接种方法参考以前发
表的论文[1]。 病情调查分级标准参考以前发表的
方法并且结合茎蔓基部病斑的长度[1]。
1. 2. 2　 RNA提取、TaqMan 实时荧光定量 PCR 及
转录水平分析方法　 13 个甜瓜品种,选择 90 棵长
势一致的苗子接种蔓枯病菌,接种后在 0、12、24、
48、72 和 96 h取样,每棵幼苗取样 1 次,排除伤害
对植株的影响。 3 棵幼苗的样品算作 1 个重复,每
品种重复 3 次 Real-Time RT-PCR。 样品迅速放置
到液氮罐内备用。 用 Trizol 试剂盒( Invitrogen)提
取样品 RNA。 QuaWell Q5000 测定 RNA 浓度。
反应总体积为 20 μL。 在 1. 5 mL离心管中依次加
入下列反应物(体积为 12. 5 μL):DEPC 水 (8-x)
μL,RNA酶抑制剂(50 U / μL) 0. 5 μL,随机引物
(50 pmol / μL) 2 μL,RNA x μL,总 RNA 体积与
DEPC 水的总体积是 8 μL,其中 RNA 的量是 2
μg。 在 65℃水浴处理 5 min。 室温放置 10 min,高
速离心( >5 000 g)5 s。 然后在该 1. 5 mL 离心管
内依次加入下列反应物 (加入之后总体积为 20
μL):RNA酶抑制剂(50 U / μL) 0. 5 μL,5 × buffer
(Promega) 4 μL, dNTP Mix (10 mmol / L each)
2 μL,DTT 2 μL,M-MLV (200 U / μL) (Promega,
USA) 1 μL,水浴 37℃下反应 1 h,然后 90℃处理
5 ~ 10 min,迅速冰浴 5 min,高速离心( > 5 000 g)
5 s备用。
探针和引物使用 the Primer Premier 3 software
(Applied Biosystems)根据表 2 内序列号提供的序
列设计合成(表 2)。 实时荧光定量 PCR 的反应体
系,按照顺序依次加入 cDNA template 1 μL,For-
ward primer (10 μmol / L) 0. 4 μL,Reverse primer
(10 μmol / L)0. 4 μL,TaqMan probe (10 μmol / L)
0. 3 μL,TaKaRa Taq (5 U / μL) 0. 3 μL,MgCl2(25
mmol / L) 2. 4 μL,dNTP Mixture (2. 5 mmol / L /
each) 0. 4 μL,10 × PCR buffer (Mg2 + free) 2 μL,
H2O 12 μL。 Applied Biosystems 7000 Real time
PCR System完成荧光定量 PCR试验。 95℃ 2 min
1 个反应;95 ℃ 10 s(变性),57 ℃ 45 s(复性和延
伸),40 个循环。 Cyclophilin(CPN)基因作为看家
基因,体系和反应条件同上。 采用 Delta-delta 方
法[5]计算基因的诱导表达。 首先,把 3 次 PCR 的循
环阈值(the threshold cycles,CT)取平均值定量转录
水平。 △CT样品 =△CT 样品平均值 -△CT 看家基因。 △△CT
= △CT样品 -△CT对照。 2 -△△CT就是基因的相对表达
水平。 接种后 0 h的甜瓜作为对照,则基因的相对表
达水平都是 1。
2　 结果与分析
2. 1　 甜瓜蔓枯病抗性鉴定结果
表 1 的抗性鉴定结果表明生产上主要栽培的
薄皮、小果的甜瓜中日本甜玉(Ribentianyu)、美都
青皮 ( Meiduqingpi )、 美 玉 ( Meiyu )、 白 沙 蜜
( Baishami )、 黄 金 蜜 ( Huangjinmi )、 黄 金 莎
(Huangjinsha)、十条棱黄金瓜(Shitiaolenghuangjin-
gua)、精品青玉( Jinpinqingyu)和温州的 2 个地方
品种 CM8 和 CM9 以及 1 个常规品种 CM5 都对蔓
枯病抗性较好,病情指数都在 35 以下,而白色厚皮
的 CM6 和绿白相间网纹厚皮的 CM7 对蔓枯病菌
则是高感,病情指数都高于 75。
2. 2 　 接种蔓枯病菌后不同抗感品种的甜瓜内抗
坏血酸过氧化物酶基因的表达水平
由图 1 可见,不同的甜瓜品种接种蔓枯病菌
后,叶片内抗坏血酸过氧化物酶的表达谱差别很
大。 其中抗性品种 CM5、日本甜玉、CM9 和精品青
玉的 APX 的表达受到抑制,在蔓枯病菌接种后 96
h内表达量都低于对照。 短时间内表达量急剧增
加,而其他时间表达量都低于对照的抗性品种有美
玉、黄金蜜、十条棱黄金瓜。短时间内出现表达量
703
Table 1　 The resistances to stem blight disease in the different varieties of melon
No. Variety Disease index Resistance identification No. Variety Disease index Resistance identification
1 CM5 20. 4 R 8 Shitiaolenghuangjingua 30. 9 R
2 Ribentianyu 22. 8 R 9 CM9 30. 9 R
3 Meiduqingpi 23. 5 R 10 Jinpinqingyu 32. 8 R
4 Meiyu 25. 8 R 11 CM8 34. 1 R
5 Baishami 27. 1 R 12 CM7 79. 9 HS
6 Huangjinmi 28. 5 R 13 CM6 82. 2 HS
7 Huangjinsha 28. 5 R
Notes: R: Rensistant; HS: High susceptible.
Table 2　 The sequences of anchors and primers used in the study
Gene Accession Sequence Productf / bp
APX EU798483a
Fc: 5′-CAGAGGATTCATCGCTGAGAAGA-3′
Rd: 5′-CCAGCAGAGTGCCATGCA-3′
Pe: 5′-TTGTGCTCCTCTAATGCTTCGTC-3′
66
CPN MU5581b
Fc: 5′-GGGTAGTGCATTCCACAGGA-3′
Rd: 5′-TCCATCGCCGAGGGTAAA-3′
Pe: 5′-TTCCCAGCTTCATGATTCAAGGAGGAGA-3′
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a: GenBank accession numbers of genes; b: Unigene ID; c: Forward primers used for quantitative RT-PCR; d: Reverse primers used for quantitative RT-PCR;
e: TaqMan probes used for quantitative RT-PCR; f: Amplification product sizes of quantitative RT-PCR.
　
　 3 期 　 　 任海英,等:不同甜瓜品种蔓枯病抗性与抗坏血酸过氧化物酶基因表达的关系
Fig. 1　 Induced expression of APX gene analyzed by using quantitative RT-PCR in the
leaves at seedling stage in the different varieties of melon after
infection with Didymella bryoniae strain DB11
The leaves were obtained at 0, 12, 24, 48, 72 and 96 hours post-inoculation. The transcript levels of APX gene were
normalized to those of the cyclophilin gene as house-keeping gene. Then, the expression levels of APX gene in the
inoculated samples were calculated relatively to those of controls that were treated with sterile water at respective times.
Error bars represent the standard deviation of the mean from three independent biological experiments.
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植物病理学报 42 卷
下降,但是多数时间内表达量都有大幅度升高的抗
性品种有白沙蜜、黄金莎、CM8、美都青皮。 2 个蔓
枯病高感品种表达谱差异非常大,CM7 接种蔓枯
病菌后 APX表达量都远远大于对照,而 CM6 接种
蔓枯病菌后 APX 的表达量与对照相比有显著下
降。
3　 结论与讨论
本研究发现对蔓枯病抗性不同的甜瓜品种感
染蔓枯病后 APX 的转录水平都发生显著变化,由
于对蔓枯病抗病和感病的不同品种其 APX 转录水
平的变化差异较大,与对照相比,有的抗性品种
APX转录水平升高,但是有的抗性品种 APX 转录
水平降低,感病品种 APX 转录水平也是有的升高
有的降低,这说明 APX 在甜瓜与蔓枯病菌的互作
过程中可能发生着重要的作用,这种作用的结果受
到不止一种因素的影响,而不单单是清除活性氧这
一种作用,很可能与其他多种信号网络交叉互作调
控甜瓜与蔓枯病菌的互作过程,这与前人的研究结
果小麦的叶片和穗部的感病严重率与过氧化物酶
活性成正相关存在差异。 本研究首次在转录水平
上研究 APX 与植物抗病性的关系,实时荧光定量
PCR的方法分析 APX转录水平,与研究 APX酶活
性和酶表达量相比,方法简单、快捷、准确,这为进
一步研究 APX与植物抗病性的关系提供了技术和
理论支持。
参考文献
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责任编辑:曾晓葳
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