全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(1): 37-44(2012)
收稿日期: 2011-03-04; 修回日期: 2011-09-22
基金项目: 国家自然科学基金(30871626)
通讯作者: 晏立英,副研究员,主要从事油料作物病害分子生物学研究; Tel:027-86812725, E-mail: yanliying2002@126. com。
利用 RNAi介导的抗病性获得抗 2 种
花生病毒的转基因烟草
晏立英*, 许泽永, 廖伯寿
(中国农业科学院油料作物研究所 油料作物生物学重点开放实验室, 武汉 430062)
摘要: 分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花
叶病毒(CMV-CA)复制酶基因 2a为模板,通过 PCR方法分别得到 PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和 CMV-CA 2a 3′ 端 150 bp的
片段,3 种片段混合物为模板经 PCR 拼接得到 450 bp 的片段,此拼接片段通过 Gateway 系统重组至植物表达载体
pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体 pK450。 冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌
株 GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经 PCR检测,获得转基因植株。 对 T1 代转基因植株分别人工
接种 3 种病毒,66. 7%的植株表现对 PStV免疫,9%的植株表现对 CMV-CA的恢复抗性,全部植株对 PSV感病。 siRNA的
Northern blot结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异 siRNA,siRNA含量随接种后时间延长而衰减。
关键词: 转基因烟草; 花生条纹病毒; 花生矮化病毒; 花生黄瓜花叶病毒; 抗性
Transgenic tobacco plants resistant to two peanut viruses via RNA mediated virus
resistance　 YAN Li-ying, XU Ze-yong, LIAO Bo-shou　 (Key Laboratory of Oil Crop Biology of the Ministry of
Agriculture, Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430062, China)
Abstract: Specific primers were designed according to the coat protein (CP) genes of Peanut stripe virus
Hongan isolate (PStV-Hongan), 2a gene of Peanut stunt virus-mild strin (PSV-Mi) and Cucumber mosaic vi-
rus peanut strain (CMV-CA), and cDNA fragments with length of 150 bp were obtained from the 5′ ends of
CP gene of PStV-Hongan, 3′ end of replicase 2a gene of PSV-Mi and CMV-CA. The three cDNA fragments
were recombined into one chimeric cDNA by PCR amplification. The chimeric cDNA was then introduced into
the plant expressing vector pK7GW1WG2 in a way of inverted repeats by Gateway recombination Kits. The
identified plant-expression plasmid pK450 was introduced into Agrobacterium tumefaciens GV3101 by direct
transferring, and the target cDNA with inverted repeats was introduced into Nicotiana benthamiana. Transgen-
ic plants obtained by tissue culture and identified by PCR. The resistance assay indicated that about 66. 7% of
T1 transgenic plants were immune to PStV, 9% of the transgenic plants were recovered after CMV inoculation
and all the plants were susceptible to PSV. siRNA was found in all transgenic plants by Northern-blot test and
its amount decreased with the time after inoculation.
Key words: transgenic tobacco; Peanut stripe virus; Peanut stunt virus; Cucumber mosaic virus-CA; resis-
tance
中图分类号: S432. 23　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)01-0037-08
　 　 占我国花生种植面积 60%的北方产区,病毒 病的流行和危害严重影响花生生产和品质。 自 20
　
植物病理学报 42 卷
世纪 70年代以来,花生病毒病害多次爆发大流行,
给花生生产带来严重损失[1]。 侵染花生并造成产量
损失的病毒在我国主要有 3 种,即花生条纹病毒
(Peanut stripe virus,PStV)、花生矮化病毒(Peanut
stunt virus,PSV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic
virus,CMV)-花生株系[2,3,4],这 3 种病毒在田间单
独或复合侵染花生,一般年份造成产量损失 5% ~
10% ,大流行年份造成产量损失可达 20% ~30% ,复
合侵染比单独侵染产量损失增加 10% ~ 15% [5]。
针对田间花生病毒病严重复合侵染,培育多种病毒
抗性的花生在生产上显得尤为迫切和重要。 然而在
栽培花生种质资源中,未发现抗性材料;在野生花生
资源中,发现了对 3种病毒具有抗性的材料[6],但是
由于野生花生与栽培品种杂交不亲和,以及抗性与
其他不良性状的连锁,使得常规的杂交育种很难利
用。 伴随基因工程技术的发展,多种植物通过转化
病毒基因的途径获得了对病毒的抗性,使利用该途
径获得多抗病毒的花生成为可能。
RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是双链
RNA介导的特异性基因表达沉默现象。 其特点是
同源序列特异性的降解,dsRNA 在 RNA 沉默过程
中起着非常重要的作用,是 RNA 沉默的激发子和
靶标;而 dsRNA也是植物病毒的复制中间型,可以
作为 RNA 沉默的靶标来介导植物病毒的抗性。
RNAi途径因针对植物外源序列的特异性强,而且
利用反向重复外源序列获得基因沉默转基因植株
的频率高,因此利用 RNAi 机制,通过转化外源反
向重复的病毒核酸序列正成为获得转基因病毒抗
性的主要途径。 很多研究者利用这种途径获得了
抗病毒的植物,最早报道利用该策略获得抗病毒植
物的是将大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,
BYDV)的 ORF1 构建成发夹结构获得病毒免疫型
的转基因植株[7]。
利用病毒的完整基因创造多个病毒抗性比较
困难,因为植物表达载体的容量有限,多个基因难
于构建至同一植物表达载体中。 反向重复序列载
体不需要转化病毒的完整基因,利用较小的片段
60 ~ 200 bp 就能诱导 RNA 沉默[8],使创造多病毒
的抗性成为可能。 利用病毒基因片段代替完整基
因,通过 RNA 沉默策略获得病毒抗性,不仅便于
植物表达载体的构建,而且可以将多个病毒片段同
时导入同一植物,获得更广谱的植物病毒抗性。
本试验旨在利用 RNAi策略,将侵染花生 3 种
病毒的 150 bp 片段 ( PStV-Hongan CP,CMV-CA
2a 、PSV-Mi 2a )拼接的 450 bp 片段,构建反向重
复的植物表达载体,转化 3 种病毒的繁殖寄主本生
烟,探索获得抗 3 种花生病毒的转基因烟草的可能
性,为以后多抗花生病毒病的防治提供理论指导。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
1. 1. 1　 质粒、菌株、病毒和试剂　 本生烟(Nicotia-
na benthamiana)种子;病毒 PStV-Hongan、PSV-Mi
和 CMV-CA株系;PStV、CMV-CA和 PSV-Mi抗血
清;Agrobacterium tumefaciens 菌株 GV3101 均由
本实验室提供。 质粒 pDONR207、 pK7WG1WG2
和 Gateway BP、LR 重组试剂盒购自 Invitrogen 公
司,Anit-digoxigenin-AP试剂盒购自 Roche公司。
1. 1. 2　 引物　 FP-F1和 FP-R1是含有 PStV-Hongan
CP基因和 CMV-CA 2a基因反向互补序列的引物,
FP-F2 和 FP-R2是含有CMV-CA 2a基因和 PSV-Mi
2a基因反向互补序列的引物;attB2 PStV CP-F含有
Gateway 系统 attB2 重组位点和 PStV CP 序列,
attB1PSV-R含有 Gateway 系统 attB1 重组位点和
PSV-Mi 2a基因序列。 PRAPF1 来自植物表达载体
pK7WG1WG2内含子下游卡那霉素基因上的序列,
PRAPR1来自 pK7WG1WG2 内含子上游 35S 启动
子上的序列,引物序列和位点见表 1。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 病毒片段的拼接和植物表达载体的构建　
利用表 1 的引物通过 PCR扩增 3 种病毒的目的片
段,attB2PStVCP-F 和 FP-R1 扩增 PStV CP 5′端
150 bp的片段,FP-F1 和 FP-R2 扩增 CMV 2a 基因
3′端 150 bp 的片段,FP-F2 和 attB1 PSV-R 扩增
PSV 2a 3′ 端的片段。 将 3 个病毒片段分别回收等
量混合后作为模板,利用引物 attB2 PStV CP-F 和
attB1PSV-R进行 PCR扩增得到 3 个病毒片段的拼
接片段。 参考 Yan 等的方法[9],将拼接片段利用
Gateway 重 组 系 统 构 建 至 植 物 表 达 载 体
pK7WG1WG2,具 体 策 略 见 图 1。 利 用 引 物
PRAPF1、PRAPR1 和 FP-F1 对重组后的植物表达
载体进行 PCR扩增,检测反向重复的拼接片段;重
组后的植物表达载体内含子的方向通过 Xba I 酶
切鉴定。
83
　
　 1 期 　 晏立英,等:利用 RNAi介导的抗病性获得抗 2种花生病毒的转基因烟草
Table 1　 The primers for fragments fusion, gateway recombination and
plant expression vector identification
Primer Sequence (5′-3′)
FP-F1 GA ACAGAGAATCAATCAATGAGA-GAAGAATCGACGGGAACGAGGTC
PStV-Hongan CP (149-171 nt) CMV-CA 2a (2 503-2 524 nt)
FP-R1 GACCTCGTTCCCGTCGATTCTTC-TCTCATTGATTGATTCTCTGTTC
CMV-CA 2a (2 524-2 503 nt) PStV-Hongan CP (171-149 nt)
FP-F2 GTGTGGTGGAACTGTCCGAGTC-TCTGGAGATGATTCCCTAGCC
CMV-CA 2a (2 631-2 652 nt) PSV-Mi 2a (1 912-1 932 nt)
FP-R2 G GCTAGGGAATCATCTCCAGA-GACTCGGACAGTTCCACCACAC
PSV-Mi 2a (1 932-1 912 nt) CMV-CA 2a (2 652-2 631 nt)
attB2PStV CP-F ggggACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-TCAGGGAGCGGCACAACACAAC
attB2 PStV-Hongan CP (22-45 nt)
attB1PSV-R gggg ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-GGTGTGTCCCAACTCGTCCGTC
attB1 PSV-Mi (2 064-2 043 nt)
PRAPF1 GATGACGCACAATCCCAC (548-566 nt)
PRAPR1 CGCAAGACCGGCAACAGG (6 320-6 336 nt)
Fig. 1　 Fragments fusion of three viruses and plant binary vector construction
93
　
植物病理学报 42 卷
1. 2. 2　 转基因烟草的获得和检测　 将鉴定好的植
物表达载体通过冻融法导入根癌农杆菌菌株
GV3101,选择 PStV-Hongan、CMV-CA 和 PSV-Mi
相同的繁殖寄主本生烟(N. benthamiana)进行叶盘
法转化,烟草转化参照 Yan等的方法[10],转基因植
株通过引物 attB2PStVCP-F 和 attB1PSV-R 进行
PCR鉴定。
1. 2. 3　 转基因植株的抗病性鉴定　 将 CMV-CA、
PStV和 PSV-Mi发病叶片按照 1 ∶ 10 的比例加入
含有 0. 05% β-巯基乙醇的磷酸缓冲液(pH7. 0),分
别接种 5 个转基因烟草家系 T1 代 6 ~ 8 叶期的不
同植株,接种 5 d 后对无症状植株重复接种 1 次,
第 1 次接种 3 d后,每天调查和记录各植株的症状
表现,10 d 后每周调查 1 次并取叶片进行 ELISA
检测(检测 4 周),以非转基因本生烟为对照。
1. 2. 4 　 转基因植株的 siRNA 检测　 参照 Yan 等
的方法进行转基因植株的 siRNA 检测[10]。 分别
提取转基因烟草家系 pK450-24 接种前,pK450-14
接种前、接种后 15 d和 50 d植株的小干扰性 RNA
(small interfering RNA,siRNA),定量后进行凝胶
电泳,转膜后进行 Northern blot杂交检测。 同一植
株,接种前的样品标示为 - 1,接种后 15 d 的样品
标示为 -2,接种后 50 d 的样品标示为 - 3。 杂交
前对提取的 siRNA进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测
定,使各个样品转到杂交膜上的量基本相同,杂交
试验 siRNA的用量为 0. 5 ~ 1. 0 μg。
2　 结果
2. 1 　 含 3 种花生病毒片段的植物表达载体的
构建
分别利用 attB2PStV CP-F和 FP-R1 扩增 PStV
CP 5′端 22-171 位置 150 bp 的片段,FP-F1 和 FP-
R2 扩增 CMV 2a 基因 3′端 2 503-2 631 位置 150
bp的片段,FP-F2 和 attB1 PSV-R 扩增 PSV 2a 3′
1 912-2 064 位 150 bp的片段。 3 个片段分别回收
后等量混合作为模板,利用引物 attB2 PStV CP-F
和 attB1PSV-R 进行 PCR 扩增,得到 3 个病毒 450
bp的拼接片段。 拼接片段利用 Gateway 系统的
BP重组试剂盒重组至入门载体 pDONR207,经
PCR和酶切鉴定的重组质粒命名为 pDONR450。
pDONR450 质粒与植物表达载体 pK7WG1WG2 利
用 Gateway系统 LR 重组试剂盒进行重组,将 450
bp拼接片段以反向重复方式重组至 pK7WG1WG2
内含子的两侧。 利用引物 PRAPR1 与 IRF1 对重
组质粒内含子左侧的片段进行 PCR 扩增检测,12
个克隆都获得 1. 6 kb 左右的目的片段(图 2);利
用引物 PRAPF1 与 IRF1 对重组质粒内含子右侧片
段进行 PCR 扩增检测,12 个克隆也都获得 475 bp
左右的目的片段(图 3),表明 450 bp 的拼接片段
已经以反向重复的方式重组到植物表达载体内含
子的两侧。 对重组质粒进行 Xba I 酶切,内含子正
向的片段大小为 900 bp,内含子反向的片段大小为
1. 3 kb,Xba Ⅰ酶切鉴定得到内含子为正向的克隆
5 个,为反向的克隆 4 个(图 4)。 将 3 种病毒的拼
接片段反向重复插入并且内含子为正向的植物表
达载体命名为 pK450。
Fig. 2　 PCR identification of pK450 with prim-
ers PRAPR1 and IRF2
1: λDNA / Pst Ⅰ marker; 2-13: PCR bands of 1 638 bp.
Fig. 3　 PCR identification of pK450 with prim-
ers pRAPF1 and IRF1
1: λDNA / Pst Ⅰ marker; 2: Negative control; 3-14: PCR
bands of 475 bp.
2. 2　 转基因烟草 T0 代植株的 PCR检测
叶盘法转化本生烟,经卡那霉素筛选得到 15 个
转基因烟草株系并扩繁得到 47个植株。按SDS-KAc
04
　
　 1 期 　 晏立英,等:利用 RNAi介导的抗病性获得抗 2种花生病毒的转基因烟草
Fig. 4　 Identification of pK450 by Xba Ⅰ
1: λDNA / Pst Ⅰ marker; 2, 4, 5, 9, 12: 900 bp fragment of pK450 digested by Xba Ⅰ;
3, 7, 10, 13: 1. 3 kb fragment of pK450 digested by Xba Ⅰ; 6,8,11: False recombinant plasmids.
方法小量提取转基因烟草 T0 代植株叶片的总
DNA,经 attB2 PStV CP-F和 attB1PSV-R引物进行
PCR检测,其中 14 个系的 41 个植株获得 450 bp
左右的目的片段 (图 5 ),转基因烟草命名为
pK450-N。
2. 3　 转基因烟草 T1 代植株对病毒的抗性检测
对转基因烟草 pK450-7、pK450-14、pK450-21、
pK450-23 和 pK450-24 5 个家系 T1 代植株的 6 ~ 8
叶期分别接种 PStV、CMV 和 PSV 进行抗性检测
(4 ~ 5 株 /病毒 /家系),其 T1 代命名为 pK450-N-
N。 5 个家系的感病植株在接种 PStV 6 d 后上部
叶片出现系统花叶,接种叶不表现症状;抗病植株
与未接种植株一样,没有任何症状。 经 ELISA 检
测:2 个家系的植株 100%抗 PStV,2 个家系分别有
50%和 66. 7%的植株抗 PStV,另外 1 个家系的植
株对 PStV 100%感病。 在 CMV 接种 3 d 后,5 个
家系的植株均在接种叶上表现褪绿斑,6 d 后除
pK450-14-1 和 pK450-14-4 植株表现症状恢复外,
其余的植株均出现系统花叶症状。 在 PSV 接种 3
d后,5 个家系所有植株的接种叶均出现褪绿斑,6
d后上部叶片出现系统花叶,并卷曲。 在检测 5 个
家系中,pK450-14 T1 代所有植株表现对 PStV 免
疫,2 株表现对 CMV的症状恢复,所有植株对 PSV
感病;pK450-23 T1 代所有植株表现对 PStV 免疫,
对 CMV 和 PSV 感病;pK450-21 和 pK450-7 部分
植株对 PStV免疫,对 CMV和 PSV感病;pK450-24
所有植株对 3 种病毒均感病。 5 个家系中,只有
pK450-14 部分植株表现对 2 种病毒 ( PStV 和
CMV)有抗性。 PStV 抗性鉴定和 3 种病毒 ELISA
检测结果见表 2 和表 3。
Fig. 5　 PCR identification of 450 bp in the transgenic tobacco T0 plants
1: Non-transgenic plant; 2: Positive control of pK450 plasmid; 3: 200 bp ladder; 4-12: Transgenic tobacco plants.
14
　
植物病理学报 42 卷
Table 2　 Resistance assay of transgenic tobacco T1 plants to Peanut stripe virus
Transgenic Lines Number of tested plants Resistant plants Susceptible plants Resistance ratio / %
pK450-7 4 2 2 50. 0
14 4 4 0 100. 0
21 6 4 2 66. 7
23 6 6 0 100. 0
24 4 0 4 0. 0
Table 3　 ELISA test of transgenic T1 plants to three viruses
Transgenic
lines
PStV
Resistance /
susceptible
CMV-CA
Resistance /
susceptible
PSV-Mi
Resistance /
susceptible
pK450-7-1 0. 303 R 0. 863 S 1. 424 S
pK450-7-2 1. 525 S 0. 945 S 1. 352 S
pK450-7-3 0. 506 R 0. 827 S 1. 475 S
pK450-7-4 1. 406 S 1. 235 S 1. 697 S
pK450-14-1 0. 283 R 0. 303 R 1. 226 S
pK450-14-2 0. 257 R 1. 154 S 1. 015 S
pK450-14-3 0. 311 R 1. 110 S 1. 070 S
pK450-14-4 0. 328 R 0. 576 R 1. 657 S
pK450-21-1 1. 739 S 1. 023 S 1. 314 S
pK450-21-2 0. 537 R 1. 325 S 1. 037 S
pK450-21-3 0. 293 R 0. 768 S 1. 423 S
pK450-21-4 1. 907 S 0. 976 S 1. 415 S
pK450-21-5 0. 379 R 0. 931 S 2. 054 S
pK450-21-6 0. 454 R 1. 152 S 1. 277 S
pK450-23-1 0. 221 R 1. 248 S 1. 351 S
pK450-23-2 0. 204 R 1. 114 S 1. 235 S
pK450-23-3 0. 195 R 0. 841 S 1. 038 S
pK450-23-4 0. 208 R 1. 142 S 1. 600 S
pK450-23-5 0. 321 R 1. 103 S 1. 024 S
pK450-23-6 0. 256 R 1. 108 S 1. 284 S
pK450-24-1 1. 310 S 0. 873 S 1. 884 S
pK450-24-2 1. 476 S 0. 981 S 1. 451 S
pK450-24-3 1. 762 S 0. 865 S 1. 325 S
CK - 0. 254 0. 286 0. 354
CK + 0. 603 1. 132 1. 257
buffer 0. 193 0. 223 0. 159
Note:pK450-N-N: Transgenic plants; CK + : Non-transgenic plants, inoculated with Peanut stripe virus, Peanut stunt
virus-Mi and Cucumber mosaic virus- CA; CK-: Non-transgenic plants without virus infection; R: Resistance plant; S:
Susceptible plant.
24
　
　 1 期 　 晏立英,等:利用 RNAi介导的抗病性获得抗 2种花生病毒的转基因烟草
2. 4　 转基因烟草的 siRNA检测
分别提取非转基因烟草、转基因烟草 pK450-
24-1 接种前,pK450-14-1 接种前、接种后 15 d 和
50 d 植株的 siRNA 进行 Northern blot 检测,结果
表明:非转基因烟草植株不含 siRNA,而所有转基
因烟草植株都含有不同量的 siRNA。 接种 PStV的
pK450-14-1 表现为抗病,其 siRNA 接种前含量最
高,接种后随时间的延长呈下降趋势;感病的
pK450-24-1 接种前 siRNA含量很低(图 5-A)。 接
种 CMV-CA的 pK450-14-1 表现为症状恢复,接种
前和接种后都检测到含量不同的特异 siRNA,siR-
NA含量随接种后时间变化而变化,接种 15 d 后,
特异 siRNA含量较高;50 d后,特异 siRNA含量明
显降低(图 5-B)。 接种 PSV后的 pK450-14-1 表现
为感病,但其接种前后的样品中都检测到较高含量
的特异 siRNA;而同样感病的 pK450-24-1 接种前
siRNA含量很低(图 5-C),表明不同转基因植株
siRNA 含量存在差异,对 PSV 而言 siRNA 含量并
不与抗、感表现相一致。
Fig. 5 　 Northern blot test of siRNA of trans-
genic tobacco T1 plants with Peanut
stripe virus, Cucumber mosaic virus-
CA and Peanut stunt virus-Mi probe
A: Specific siRNA by PStV probe; B:Specific siRNA by
CMV probe; C:Specific siRNA by PSV probe; D: siRNA
loading on the gel.
1: 450s24-1; 2: 450s14-1; 3: 450s14-2; 4: 450s14-3; 5:
Non-transgenic plant.
3　 讨论
通过基因工程途径利用植物病毒基因获得转
基因植物的病毒抗性已在多种植物上有成功的报
道。 由于能获得高频率的转基因植物病毒抗性,而
且仅需较小的片段 60 ~ 200 bp 就能诱导 RNA 沉
默获得植物病毒的抗性[8],RNAi 策略越来越受到
研究者的关注和利用。 因为传统的利用多个病毒
的完整基因拼接后构建植物表达载体,或者将病毒
的多个基因分别一个一个组装到植物表达载体,难
于操作,不仅费时而且费工;若利用病毒基因较短
的片段则大大简化了构建植物表达载体的工作量,
基于此,RNAi策略提供了多种植物病毒转基因抗
性的可能性,而且已经取得多例成功的报道。 Eti-
enne 等[11]利用该策略将 4 种 Tospovirus病毒 N 基
因 150 bp的片段拼接后构建的反向重复植物表达
载体转化烟草后得到抗 4 种病毒的转基因植株;
Zhu等[12]将 PVY、CMV和 TMV 3 种病毒 CP基因
拼接构建 hairpin RNA 植物表达载体转化烟草也
获得了对这 3 种病毒抗性的转基因植株。 这些利
用 RNAi策略获得多抗病毒的报道,为本研究的开
展提供很好的借鉴。 本研究利用 PStV-Hongan 的
CP基因,CMV-CA和 PSV-Mi 2a 基因片段构建的
反向重复植物表达载体转化烟草后成功获得了对
PStV和 CMV的抗性转基因烟草。
本研究获得的转基因烟草对 PStV 抗性频率
达 66. 7% ,对 CMV 的抗性频率达 9% ,而对 PSV
全部感病,推测不同病毒获得转基因抗性需要不同
长度的激发子。 150 bp 的 PStV 片段就可以获得
较高的转基因抗性,而 CMV和 PSV可能需要较长
的片段才能激发转基因抗性,这个结果与 Chen
等[13]利用长片段 2a(1. 5 kb)获得 70%抗性,而短
片度 2a(490 bp)获得 30%的抗性频率较低相吻
合,也印证 Cucumovirus 需要较长片段才能获得转
基因抗性。
本研究未能获得 PSV 的抗性转基因烟草植
株,但对 pK450-14-1 植株接种前的 siRNA 进行
PSV的 Northern blot杂交,检测到极高含量的特异
siRNA,推测是 PSV病毒的侵染力过强或接种浓度
过高;或是植株体内 siRNA 水平仍然不足以诱导
对该病毒的抗性;亦或 PSV的 2a基因并非是该病
毒最佳诱导抗性的病原基因导致的,今后需要对其
基因组不同的基因进行筛选,寻找一个较强诱导抗
34
　
植物病理学报 42 卷
性的基因来获得对 PSV的抗性。
参考文献
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责任编辑:曾晓葳
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