全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４３(４): ４４０￣４４３(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣１２￣１０ꎻ 修回日期: ２０１３￣０４￣０２
基金项目: 国家农业行业专项计划(ｎｙｈｙｚｘ２００９０３０１７￣０８)
通讯作者: 王国平ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ主要研究方向为植物病毒学ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｇｐｗａｎｇ＠ｍａｉｌ. ｈｚａｕ. ｅｄｕ. ｃｎꎮ
研究简报
侵染藠头的大蒜潜隐病毒分子鉴定及部分序列分析
吴承春１ꎬ 洪 霓２ꎬ 刘 勇２ꎬ 徐文兴２ꎬ 王国平２∗
( １华中农业大学理学院ꎬ 武汉 ４３００７０ꎻ ２ 华中农业大学植物科学技术学院ꎬ 武汉 ４３００７０)
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇａｒｌｉｃ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ
Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ ＷＵ Ｃｈｅｎｇ￣ｃｈｕｎ１ꎬ ＨＯＮＧ Ｎｉ２ꎬ ＬＩＵ Ｙｏｎｇ２ꎬ ＸＵ Ｗｅｎ￣ｘｉｎｇ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｐｉｎｇ２
( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅꎬＨｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬＣｈｉｎａꎻ ２ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＨｕａ￣
ｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｆｏｕｒ Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ (Ｇ. Ｄｏｎ)ｓａｍｐｌｅｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｗｕｈａｎ ｃｉｔｙ ｏｆ
Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａꎬ ａｎｄ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ
ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｐＣａｒ￣１( ＋ )ａｎｄ Ｍ４. Ｎｉｎｅ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ. Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｖｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ３′ｔｅｒｍｉｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ ｗａｓ ａｂｏｕｔ １ ８０８ －１ ８１２ ｎｔ ｉｎ
ｌｅｎｇｔｈ ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ｐｏｌｙ (Ａ)ꎬ ａｎｄ ｓｈａｒｅｄ ａ ｓｉｍｉｌａｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｍｅｍｂｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃａｒｌａ￣
ｖｉｒｕｓ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｙ ｓｈａｒｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｏｆ ７７％ －９３％ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅｍｓｅｌｖｅｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｉｍｉ￣
ｌａｒｉｔｉｅｓ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ ７５％ ｔｏ ８２％ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ Ｇａｒｌｉｃ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ (ＧＬＶ) ｉｓｏｌａｔｅｓ. Ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａ￣
ｓｉｎｇ ｏｎ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ｔｈｅ ｎｉｎｅ ｃｌｏｎｅｓ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｆｏｕｒ ｍａｊｏｒ ｇｒｏｕｐｓ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ＧＬＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ.
Ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ＧＬＶ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ａ. ｃｈｉｎｅｎｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｒｔｈｅｒ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ａ. ｃｈｉｎｅｎｓｅ ｐｌａｎｔｓ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ: Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ (Ｇ. Ｄｏｎ)ꎻ Ｇａｒｌｉｃ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓꎻ Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０４４０￣０４
藠头(Ａｌｌｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｇ. Ｄｏｎ)ꎬ为百合科葱
属鳞球茎多年生植物ꎬ是一种高产、高营养和具有
食疗作用的蔬菜类作物ꎬ也常作为中药材加以利用
和研究ꎮ 国内外学者对发生在葱属植物上的病毒
病原鉴定和分类做了深入研究ꎬ但针对藠头病害的
发生特点和病原鉴定研究不多ꎬ 自 Ｃｈｅｎ等[１]在我
国发病野生藠头样品中发现 ２ 种病毒即藠头花叶
病毒(Ｓｃａｌｌｉｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬＳｃａＭＶ)和藠头 Ｘ病毒
(Ｓｃａｌｌｉｏｎ ｖｉｒｕｓ ＸꎬＳｃａＶＸ)后ꎬ国内外没有更多有关
藠头病毒病的研究报道ꎮ 由于长期无性繁殖及多
年连作ꎬ极易导致藠头病毒扩散及积累ꎬ使病毒病
害日趋严重ꎬ种苗出现严重衰退ꎮ 前期调查发现ꎬ
藠头感病后出现明显的矮缩或叶片皱缩、扭曲ꎬ有
的出现黄绿斑驳呈花叶状或褪绿条纹ꎬ病株地下鳞
茎变小、分蘖减少ꎬ还首次发现洋葱黄矮病毒(Ｏｎ￣
ｉｏｎ ｙｅｌｌｏｗ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎬＯＹＤＶ)侵染ꎬ以及多种病毒
复合感染现象[２]ꎮ
本研究采用依据香石竹潜隐病毒属(Ｃａｒｌａｖｉ￣
ｒｕｓ)成员基因组序列设计的简并引物ꎬ对侵染藠头
的病毒进行 ＲＴ￣ＰＣＲ扩增ꎬ通过对扩增产物克隆和
序列分析ꎬ首次从我国栽培的藠头上鉴定出大蒜潜
隐病毒ꎮ
４ 期 吴承春ꎬ等:侵染藠头的大蒜潜隐病毒分子鉴定及部分序列分析
１ 材料与方法
１. １ 材料
藠头样品采自武汉市江夏区藠头种植区ꎬ为当
地主栽品种舒安大叶藠头ꎮ 田间藠头样品表现花
叶、褪绿条纹、植株扭曲等症状ꎬ编号后移栽至盆
钵ꎬ置温室内盆栽保存ꎮ
１. ２ 方法
１. ２. １ ＲＮＡ 提取 参考香石竹潜隐病毒提取方
法提取病毒粗提物和 ＲＮＡ[３]ꎮ
(１)病毒粗提物制备 取藠头病叶 １４０ ｇꎬ加
入 ４００ ｍＬ预冷 Ｂｕｆｆｅｒ Ａ (０. ５ ｍｏｌ / Ｌ 磷酸钾缓冲
液ꎬ含 ０. ２ ％ 巯基乙醇ꎬ０. ０１ ｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡꎬｐＨ ７. ０)ꎬ
用纱布过滤ꎬ低速离心(１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ) １５ ｍｉｎꎻ 上
清液转移至三角瓶ꎬ 加入 ＰＥＧ６０００、 ＮａＣＬ 和
Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ １００ꎬ分别至终浓度 ６％ ( Ｗ/ Ｖ )、３％ (Ｗ/
Ｖ)和 １％ (Ｖ / Ｖ)ꎬ冰浴搅拌 ３０ ｍｉｎꎬ使 ＰＥＧ６０００ 完
全溶解ꎬ４℃静置 ４ ~ ５ ｈꎬ使病毒沉淀完全ꎻ４℃ 离
心(１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ) ３０ ｍｉｎꎬ弃上清ꎮ 沉淀重新悬浮
于 １５ ｍＬ Ｂｕｆｆｅｒ Ｂ (０. ５ ｍｏｌ / Ｌ 磷酸钾缓冲液ꎬ含
０. ５ ｍｏｌ / Ｌ 尿素ꎬ０. ０１ ｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡꎬ０. １ ％ 巯基
乙醇)ꎮ 离心(１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ)２０ ｍｉｎꎬ将上清液转至
超速离心管中ꎬ重复 １ 次ꎬ合并上清液于超速离心
管中ꎻ在超速离心管底部铺上 Ｂｕｆｆｅｒ Ｃ(０. ０１ ｍｏｌ /
Ｌ 磷酸钾缓冲液、２０％ 蔗糖、０. １ ％ 巯基乙醇、
０ ３％ Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ １００)ꎬ２８ ０００ ｒ / ｍｉｎ超速离心 １. ５ ｈꎻ
弃上清ꎬ沉淀用 ２ ｍＬ 灭菌 ｄｄＨ２Ｏ 溶解ꎬ离心
(１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ) １０ ｍｉｎꎬ取上清液ꎮ
(２)病毒 ＲＮＡ提取 取病毒样品 ３００ μＬꎬ加
１０ × ＤＮａｓｅ缓冲液 ４０ μＬꎬ加无 ＲＮａｓｅ的 ＤＮａｓｅ Ｉ ４
μＬꎬ放置 ２ ｈꎻ加入 １５ μＬ ０. ５ ｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ、５０ μＬ
１０ × 蛋白酶 Ｋ 缓冲液、１０ μＬ 蛋白酶 Ｋ、１０ μＬ
１０％ ＳＤＳ和 １５ μＬ ＤＥＰＣ 水ꎬ３７℃温育 ２ ｈꎻ用等
量酚￣氯仿、氯仿各抽提 １ 次 (１２ ０００ ｒ / ｍｉｎꎬ１０
ｍｉｎ)ꎬ取上清 ４００ μＬꎬ加入３ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＡｃ (ｐＨ ５. ２)
４０ μＬꎬ无水乙醇 １ ｍＬꎬ －２０℃放置 ２. ５ ｈꎻ于 ４℃离
心(１２ ０００ ｒ / ｍｉｎ) ２０ ｍｉｎꎬ收集沉淀ꎬ用 ７０％乙醇
洗涤 １ 次ꎬ干燥沉淀ꎬ加 ＤＥＰＣ水 ４０ μＬꎮ
１. ２. ２ 引物设计 据报道[４]的 Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ 属病毒
基因组 ３′末端序列ꎬ设计简并引物 ｐＣａｒ￣１( ＋ )序
列 ＡＴＧＣＣＮＣＴＮＡＭＸＣＣＸＣＣ(其中ꎬＮ ＝ Ａ ｏｒ Ｔꎻ
Ｍ ＝Ｃ ｏｒ ＧꎻＸ ＝Ａ ꎬＴꎬＣ ｏｒ Ｇ)ꎬ对应于浙江 ＧａｒＬＶ
全基因组序列(ＡＪ２９２２２６)６５５５￣６５７１ 位点ꎬ反转录
３′端起始互补引物采用通用引物 Ｍ４￣Ｔ ( ５′￣
ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ(Ｔ) １５ ￣３′)ꎬ用一对引物
ｐＣａｒ￣１( ＋ ) / Ｍ４ 进行 ＲＴ￣ＰＣＲꎬ扩增产物的预期大
小约 １. ８ ｋｂꎮ
１. ２. ３ ＲＴ￣ＰＣＲ 以 ＲＮＡ 为模板ꎬ采用引物 Ｍ４￣
Ｔ及逆转录酶 Ｍ￣ＭＬＶ 合成第一链 ｃＤＮＡꎬ２０ μＬ
反转录反应体系包括:模板 ＲＮＡ １０. ５ μＬꎬ引物
Ｍ４￣Ｔ ２ μＬꎬ５ ×逆转录反应缓冲液 ４ μＬꎬｄＮＴＰｓ ２
μＬꎬＲＮａｓｉｎ ０. ５ μＬꎬＭ￣ＭＬＶ １ μＬꎮ 在 ４２℃水浴
１. ５ ｈ 后加 ４０ μＬ 灭菌水ꎬ混匀后置 － ２０℃备用ꎮ
２５ μＬ ＰＣＲ反应体系为:１０ × ＰＣＲ缓冲液 ２. ５ μＬꎬ
ｄＮＴＰｓ １ μＬꎬ上游引物 ２ μＬꎬ下游引物 ２ μＬꎬｃＤ￣
ＮＡ ２ μＬꎬ ｄｄＨ２Ｏ １５. ３ μＬꎬｒＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０. ２
μＬꎮ ＰＣＲ反应程序为 ９４℃变性 ５ ｍｉｎꎬ然后 ９４℃
３０ ｓꎬ５８℃退火 ３０ ｓ ꎬ７２℃延伸 ２ ｍｉｎꎬ３５ 个循环ꎬ最
后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
１. ２. ４ 克隆及序列分析 ＰＣＲ 扩增产物经 １％
(ｗ / ｖ)琼脂糖凝胶电泳后ꎬ回收目标产物ꎬ经与载
体 ＰＭＤ１８￣Ｔ连接后转化大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ￣
ｌｉ)ＤＨ５αꎬ在含 Ａｍｐ的 ＬＢ 平板上随机挑取白色菌
落ꎬ经 ＰＣＲ和质粒酶切鉴定筛选阳性克隆ꎬ送北京
三博远志生物有限公司测序ꎮ 采用软件 ＤＮＡ￣
ＭＡＮ、ＤＮＡＳｔａｒ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ １. ８２ꎬ进行序列比对
分析ꎬ系统进化树构建采用 ＭＥＧＡ４. ０ꎮ
２ 结果与分析
２. １ ＲＴ￣ＰＣＲ扩增结果
选取来自武汉江夏区的 ４ 个藠头样品中均能
获得预期大小约 １. ８ ｋｂ 扩增产物ꎬ每个样品重复
扩增 ２ 次ꎬ克隆后共筛选到 ９ 个阳性克隆ꎮ 全部进
行序列测定ꎬ除克隆 Ｐ４ 为 １ ８１２ 个核苷酸ꎬ其他克
隆子均为 １ ８０８ 个核甘酸ꎬ具有 Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ 属成员
基因组 ３′端的典型结构ꎬ含有基因组的第 ３ ~ ６ 个
ＯＲＦꎬ且 ＯＲＦ３ 与 ＯＲＦ４ 有 ２２ 个核苷酸重叠区域ꎬ
ＯＲＦ４ 和 ＯＲＦ５ 间有 ２５ 个核甘酸的间隔区ꎬ间隔区
１４４
植物病理学报 ４３ 卷
序列富含 ＡＴꎬＯＲＦ５ 和 ＯＲＦ６ 有 ７ 个核苷酸的重叠
区域ꎬＯＲＦ６ 之后为含有 ９３ － ９７ 个核苷酸的 ３′非
翻译区(ＵＴＲ 区)ꎮ 其中 ＯＲＦ３ 为 ３３０ 个核苷酸ꎬ
编码由 １１０ 个氨基酸组成的分子量为 １１. ８ ｋＤａ 蛋
白ꎮ ＯＲＦ４ 为 １９２ 个核苷酸ꎬ编码由 ６４ 个氨基酸组
成的分子量为 ７. １ ｋＤａ蛋白ꎮ ＯＲＦ５ 为 ８９１ 个核苷
酸ꎬ编码由 ２９７ 个氨基酸组成的分子量为 ３２. ８
ｋＤａ的 ＣＰ蛋白ꎮ ＯＲＦ６ 为 ２９４ 个核苷酸ꎬ编码由
９８ 个氨基酸组成的分子量为 １１. ２ ｋＤａ蛋白ꎮ
２. ２ 所获病毒基因组 ３′末端序列与其他相关病
毒基因组序列比较分析
根据所获得的克隆序列同源性分析ꎬ发现 ３′
末端序列存在很大变异ꎬ其中克隆 ｐｃａｒｌ￣２２ 和 ｃａｒｌ￣
８ 及 Ｐ１１ 和 ｃａｒｌ￣１８ 间同源性很高ꎬ达 ９９％ ꎬ其他克
隆之间核苷酸序列同源性在 ７７％ ~ ９３％之间ꎮ 将
本研究所获得的 ９ 个克隆暂定为病毒 ＧＬＶ的 ７ 个
不同分子变种ꎮ 将所获得的这些分子变种 ３′端核
苷酸序列与已报道的相关病毒分离物(表 １)相同
区域的序列比对分析结果显示ꎬ所获的序列与
Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ属 ＧＬＶ病毒各分离物 ３′端序列同源性
最高ꎬ为 ７５％ ~ ８２％ ꎮ
对第 ３ ~ ６ 个 ＯＲＦ 的核苷酸及推测编码氨基
酸进行比较分析ꎬ克隆 Ｐ２ 和 ｃａｒｌ￣５ 在各个区域与
已报道的 ＧＬＶ分离物基因组相同区域具有相对较
高的同源性ꎬＴＧＢ２(ＯＲＦ３)、ＴＧＢ３(ＯＲＦ４)、ＮＡＢＰ
(ＯＲＦ６)基因变异较 ＣＰ(ＯＲＦ５)基因大ꎬＣＰ 的变
异主要发生在氨基酸的 Ｎ末端ꎮ
本研究所得到的 ９ 个 ＣＰ 基因克隆序列与目
前报道的 ＧＬＶ病毒基因组该区域核苷酸和氨基酸
同源性分别为 ７５％ ~ ８７％和 ８８％ ~ ９７％ ꎬ９ 个 ＣＰ
基因克隆间的核苷酸和氨基酸的同源性分别 ７６％
~ ８９％和 ８８％ ~ １００％ ꎮ
对 ７ 个代表性的 ＣＰ 基因核甘酸和编码氨基
酸序列及已报道的相关病毒序列进行系统进化分
析(图 １)ꎬ结果显示所获的 ７ 个克隆分别与其他
ＧＬＶ分离物形成 ４ 个不同分支ꎬＰ２ 和 ｃａｒｌ￣５、ｐｃａｒｌ￣
２２ 和 Ｐ９、Ｐ１１ 和 Ｐ７￣５ 分别与现有 ＧＬＶ 分离物各
自进化成一簇ꎮ 克隆 Ｐ４ 在基于 ＣＰ 核甘酸序列进
化树上形成独立一簇ꎬ但在氨基酸进化树中与
ｐｃａｒｌ￣２２ 和 Ｐ９ 仍聚在一簇ꎮ 根据国际病毒学分类
委员会有关 Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ属病毒种的分类标准ꎬ以及
对所获扩增片段的 ＣＰ 核苷酸及氨基酸序列分析
结果ꎬ确认本研究所获的序列来源于 ＧＬＶ 的不同
分离物ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｈｏｓｔｓꎬ ｏｒｉｇｉｏｎｓ ａｎｄ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ
ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｆｏｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｉｓｏｌａｔｅ Ｈｏｓｔ(ｏｒｉｇｉｏｎ) ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.
ＳＬＶ￣Ｇｔｗｎ Ｇａｒｌｉｃ(Ｔａｉｗａｎꎬ Ｃｈｉｎａ) ＡＢ００４４５７
ＳＬＶ￣ＣＬｔｗｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｌｅｅｋ(Ｔａｉｗａｎꎬ Ｃｈｉｎａ) ＡＢ００４４５６
ＳＬＶ￣ＷＯｔｗｎ Ｗｅｌｓｈ ｏｎｉｏｎ(Ｔａｉｗａｎꎬ Ｃｈｉｎａ) ＡＢ００４５４４
ＧＬＶ￣Ｒｊｐｎ Ｒａｋｋｙｏ(Ｊａｐａｎ) ＡＢ００４５６５
ＧＬＶ￣ＹＨ２ Ｇａｒｌｉｃ(Ｚｈｅｊｉａｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ) ＡＪ２９２２２７
ＧＬＶ￣ＹＨ３ Ｇａｒｌｉｃ(Ｚｈｅｊｉａｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ) ＡＪ２９２２２８
ＧａｒＬＶ￣ＨＢ Ｇａｒｌｉｃ(Ｈｕｂｅｉꎬ Ｃｈｉｎａ) ＡＪ４０９３１４
ＧａｒＬＶ￣ＳＤ Ｇａｒｌｉｃ(Ｓｈａｎｄｏｎｇꎬ Ｃｈｉｎａ) ＡＪ４０９３１６
ＧａｒＬＶ￣ＹＮ３ Ｇａｒｌｉｃ(Ｙｕｎｎａｎꎬ Ｃｈｉｎａ) ＡＪ４０９３１９
ＧＬＶ￣ＧＶ１ Ｇａｒｌｉｃ(Ｊａｐａｎ) Ｄ２８５９１
ＧＬＶ￣ＡｗＭ７７ Ａｌｌｉｕｍ ｗａｋｅｇｉ(Ｊａｐａｎ) Ｄ７３３７９
ｐＣａｒＬＶ１０ Ｃａｒｎａｔｉｏｎ(ＵＫ) ＡＪ０１０６９７
２４４
４ 期 吴承春ꎬ等:侵染藠头的大蒜潜隐病毒分子鉴定及部分序列分析
Ｆｉｇ. １ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ(Ａ) ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ(Ｂ) ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＣＰ ｇｅｎｅｓ
ｏｆ ＧＬＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｔｈｅ ｔｒｅｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ｍｅｔｈｏｄ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｅｄ
ｗｉｔｈ “▲”ꎬ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｗｅｒｅ ＪＸ５１３４００￣ＪＸ５１３４０６ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
３ 结论与讨论
本研究利用香石竹潜隐病毒属内成员的特异
性简并引物ꎬ结合 ３′末端下游引物 Ｍ４ꎬ对来自武
汉江夏区的藠头病毒进行了分子生物学鉴定ꎬ经
ＲＴ￣ＰＣＲ扩增及扩增产物的克隆、测序和基因组 ３′
端序列比对分析ꎬ确定从藠头上检测到的病毒为香
石竹潜隐病毒属(Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ)大蒜潜隐病毒(Ｇａｒ￣
ｌｉｃ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓꎬＧＬＶ)ꎮ 这是在我国首次发现该病
毒侵染藠头ꎮ 虽然本研究所获的克隆总量较少ꎬ但
仍显示侵染藠头的大蒜潜隐病毒在核苷酸水平上
存在较大变异ꎬ而在氨基酸水平上变异相对较小ꎮ
Ｃｈｅｎ等 [５]建立了马铃薯 Ｙ病毒属、马铃薯 Ｘ
病毒属、麝香石竹潜隐病毒属和葱 Ｘ 病毒属成员
ＲＴ￣ＰＣＲ 检测和全基因组扩增技术体系ꎬ并成功用
于 ６０ 多种植物病毒的检测诊断ꎮ 本研究利用属内
简并引物进行了香石竹潜隐病毒属病毒 ＲＴ￣ＰＣＲ
检测ꎬ获得了 ＧＬＶ基因的序列ꎬ但本研究所用样品
均来自同一产区ꎬ是否其他藠头产区也有大蒜潜隐
病毒及香石竹潜隐病毒属的其他病毒侵染ꎬ还有待
进一步研究ꎮ 所获研究结果为进一步明确藠头上
病毒的侵染状况及建立藠头病毒防控体系提供了
参考依据ꎮ
参考文献
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ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ４９ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ
ｐｌａｎｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃ￣
ｔｉｏｎ (植物保护)ꎬ２００７ꎬ ３３(５):３３ －４０.
责任编辑:于金枝
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