全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$江苏省自然科学基金项目"
23!"#!+#+
#&江苏省高校优势学科建设工程项目"
4546
#
作者简介$陈
!
颖"
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#!女!博士!副教授!主要从事生物技术及抗性生理研究
7)89/:
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1
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#(%,;@8
杨树胞外蛋白的提取分离及
$%&
电泳体系的建立
陈
!
颖!乐
!
利!罗永亚!杨
!
华!汪南阳!林芳芝!王俊霖
"南京林业大学 南方现代林业协同创新中心!生物与环境学院!南京
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#
摘
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要$该研究以美洲黑杨杂种优良无性系
AB+&$
杨"
!"
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#组培苗叶片
和茎段为研究对象!对
AB+&$
杨叶片细胞壁蛋白"
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H@IE/10
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JK40
#和茎段质外体蛋白"
9
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H@IE/10
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5440
#的提取(分离和双向电泳等技术进行了系统研究结果表明$
#"
L
以上叶片(超声波破碎
#"8/1
(
J9J:
!
法提
取的细胞壁蛋白效果较好!经
M)()46N
酶活性检测!提取的细胞壁蛋白胞质污染率较低&真空渗透法提取的茎段
质外体蛋白胞质污染率较前者高!但在允许范围之内
OJ5
%丙酮沉淀法纯化提取的细胞壁蛋白(
G
N*
"
-
的
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胶条(上样量为
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#
L
的双向电泳体系!其蛋白电泳图谱中的斑点多而清晰!斑点数达
$$"
多个!是叶片细胞壁
蛋白电泳分析较适合的体系&
G
N%
"
#"
胶条对茎段质外体蛋白的电泳分离效果较好该研究初步建立了杨树胞
外蛋白的提取(分离及
!)67
电泳体系!为木本植物胞外蛋白的研究奠定了基础
关键词$胞外蛋白&
AB+&$
杨&提取方法&双向电泳分析
中图分类号$
P$"%
文献标志码$
5
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胞外蛋白"
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!
7J4
#又被叫
做细胞壁蛋白"
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G
H@IE/10
!
JK40
#!质外体蛋
白"
9
G
@
G
:90I/;
G
H@IE/10
!
5440
#和分泌蛋白)#*!是质
外体中对细胞生长发育和信号转导起关键调控作用
的物质!通常在高尔基体内合成!被分泌到细胞壁及
胞外的基质中!只占质外体所有成分的
$"
#"
但胞外蛋白是胞外信号的感知者!是信号跨越细胞膜
的传递者!又是细胞壁结构骨架的搭建者越来越多
的实验证据表明胞外蛋白与细胞骨架(胞外基质(细
胞膜及胞内物质之间不断地进行着+交流,)!)%*
根据其与细胞壁成分的结合度可将胞外蛋白分
为三类$一类是松散型结合蛋白!主要属于调控细胞
壁生长分化的酶类&第二类胞外蛋白称为弱结合型
蛋白!是以弱的非共价键与细胞基质结合的蛋白!在
胞外可以进行扩散和迁移!因与细胞的生物胁迫和
非生物胁迫应答有关!又称为防御蛋白&第三类胞外
蛋白与胞壁成分结合紧密!称为紧密结合型蛋白!因
与细胞壁的框架构建有关!又称为壁结构蛋白)**
把胞外蛋白称+质外体蛋白,的学者偏于前两类蛋白
的研究!而把胞外蛋白称+细胞壁蛋白,的学者大都
偏向于二(三类蛋白的研究本研究把叶片细胞壁
提取的蛋白叫做细胞壁蛋白"
J4K0
#!把从茎段液
流中提取的蛋白叫做质外体蛋白"
5440
#
随着分子生物学技术的不断发展!亚细胞蛋白
质组学研究成为当今生命科学研究的热点亚细胞
蛋白质组学在细胞膜(细胞器"线粒体和叶绿体中#
的研究相对较多!而由于人们对胞外蛋白作用的忽
视及提取的困难使其研究落后于胞内蛋白目前对
胞外蛋白组的研究主要集中在模式植物拟南芥
上)**!另外在甘蓝(紫花苜蓿(烟草(玉米(鹰嘴豆(葡
萄(水稻(豌豆(黄瓜等农作物和蔬菜上也有所涉
及)$)##*!但胞外蛋白组学在林木上的研究相对较少
杨属植物"
!"
#
$%$&
#是林木基因组研究的模式
植物!具有基因组小(童期短(生长快(易转化(易再
生等特点!是当今世界中纬度地区栽培面积最广(木
材产量最多的树种之一!中国种植面积就已超过
-
C#"
(
<8
!
)
#!
*
目前杨树基因组学的研究较为深
入!在环境胁迫下胞外蛋白组的研究却相对较少
通过对杨树胞外蛋白组的变化研究!一方面可以揭
示胞外蛋白在环境胁迫中的响应机制!另一方面可
以为其他林木胞外蛋白研究提供重要的理论和技术
指导本研究以美洲黑杨杂种优良无性系-
AB+&$
.
"
!"
#
$%$&(%)"*(&C!"
#
$%$&($+,-(+*.,/,;D,
#
组培苗的叶片和茎段为试材!对杨树胞外蛋白的提
取(分离(纯化(单向和双向电泳检测等技术进行了
系统地研究其中叶片胞外蛋白"细胞壁蛋白#的提
取采用了
B/J:
和
J9J:
!
法!茎段胞外蛋白"木质部
液流蛋白#的提取采用了真空渗入法!初步建立了杨
树胞外蛋白的双向电泳研究体系
#
!
材料和方法
C,C
!
材
!
料
美洲黑杨杂种优良无性系
AB+&$
杨组培苗叶
片和茎段来自于南京林业大学实验室
C,$
!
苗木的扩繁和培养
组培苗的扩繁方法参照文献)
#%
*!蛋白提取等
试验材料取自组培苗的茎段和叶片"图版
$
!
5
(
2
#
C,D
!
杨树叶片胞外蛋白的提取与纯化
杨树叶片胞外蛋白提取参照
3@1
L
等)+*(朱紁
昊等)##*(
UE/V
等)#**提取法加以改进!分两步提取!具
体流程如下
细胞壁"
JK
#提取$"
#
#将
AB+&$
杨叶片用液氮
研磨成粉末!加适量
$88@:
/
B
#醋酸钠"
G
N*,(
#
溶解!然后转移到
$"8B
离心管中!在
*_
(
"""C
L
"
2E;^891J@?:IEH
O]
#离心
#$8/1
!重复
#
次上述
操作"
!
#将沉淀转入三角瓶中!加入含
",*8@:
/
B
#蔗糖的醋酸钠溶液"
$88@:
/
B
#
!
G
N*,(
#中
摇匀!用超声波细胞破碎仪"
S`)#"""6
#将细胞破
碎!共
%
次!每次
#"8/1
!并对破碎后的细胞粉碎程
度进行镜检破碎后的细胞在
*_
(
*"""C
L
离心
#$8/1
!弃上清"
%
#上述沉淀中依次加入含
",*
(
",(
(
#,"8@:
/
B
#蔗糖的醋酸钠溶液"
#8@:
/
B
#
#
各冲洗
%
次!每次在
*_
(
*"""C
L
离心
#$8/1
!弃
上清"
*
#沉淀再用
$88@:
/
B
#醋酸钠溶液"
G
N
*,(
#洗涤
(
次!洗涤后每次
*_
(
*"""C
L
离心
#$
8/1
"
$
#弃上清!沉淀再用超纯水冲洗
*
次!冲洗
后每次在
*_
(
*"""C
L
离心
#$8/1
!最后一次在
*
_
(
#!"""C
L
离心
%"8/1
!弃上清!其沉淀放入
!"_
冷冻干燥即得细胞壁组分
酚
)
甲醇%醋酸铵沉淀法胞外蛋白"
7J40
#的提
取与纯化$"
#
#弱键结合的
JK40
提取上述细胞
壁沉淀中加入
",!8@:
/
B
#
J9J:
!
醋酸钠溶液"
G
N
*,(
#冲洗
!
次!每次在
*"""C
L
离心
#$8/1
"
!
#
紧密型结合型
JK40
提取提取的细胞壁沉淀加
入含
",!8@:
/
B
#
B/J:
的醋酸钠溶液"
G
N*,(
#冲
洗
!
次!每次在
*"""C
L
离心
#$8/1
!以下两者提
取的步骤相同"
%
#合并
!
次上清液!加入
#
%
%
体积
OH/0)
平衡酚混匀!吸取苯酚相!转入离心管中!再加
""!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
入
$
倍体积
",#8@:
/
B
#乙酸铵%甲醇溶液混匀!
于
!"_
条件下沉淀过夜"
*
#次日将沉淀在
*
_
(
#!"""C
L
离心
!"8/1
!弃上清加入
!
倍沉淀体
积的甲醇!漩涡震荡
!8/1
!
#!"""C
L
离心
!"8/1

"
$
#弃上清!加入
!
倍沉淀体积的丙酮!漩涡震荡
!
8/1
!
#!"""C
L
离心
!"8/1
重复
#
次该操作!最
后沉淀于
!"_
冰箱中冷冻干燥!干粉即为细胞壁
蛋白质"
JK40
#!
-"_
保存
OJ5
%丙酮沉淀法胞外蛋白"
7J40
#的提取与纯
化$参照林梓浩等)(*和
3@89I0?
等)#$*法!在提取的
细胞壁组分中加入含
",!8@:
/
B
#
J9J:
!
的醋酸
钠缓冲液"
!$88@:
/
B
#
!
G
N*,(
#!涡旋
$8/1
!于
*_
冰箱中浸提
%<
!
*_
下
#$"""C
L
离心
%"8/1
!
留取上清液该步骤重复
#
次后!再加入含
%8@:
/
B
#
B/J:
的醋酸钠缓冲液"
!$88@:
/
B
#
!
G
N*,(
#
#$8B
!涡旋
$8/1
!
*_
冰箱中浸提
%<
后!
*_
下
#$"""C
L
离心
%"8/1
取上清液加入
*
倍体积预
冷的
#"\ OJ5
%丙酮溶液"内含
",#\ 6OO
!
#
88@:
/
B
#
4]XU
#!并在
!"_
冰箱沉降过夜!
*
_
下
#$"""C
L
离心
%"8/1
!弃上清!沉淀用丙酮清
洗
%
次!每次
*_
下
#$"""C
L
离心
%"8/1
!弃上
清!沉淀于
!"_
冰箱中冷冻干燥!干粉即为细胞
壁粗蛋白"
JK40
#
C,E
!
杨树茎段胞外蛋白提取
参照
691/
等)#(*与
a等)#-*的真空渗入法!并
加以改进"
#
#称取适量杨树茎段剪成
!;8
长小
段!用超纯水漂洗和分光光度计检测蛋白的含量
"
!
#将漂洗好的茎段浸入
!"88@:
/
B
#醋酸钠"含
!"88@:
/
B
#
J9J:
!
#液体中!用
-" 4^9
真空抽气
泵抽气
!"8/1
!然后在
$8/1
内慢慢放气至室内大
气压!将茎段取出吸干表面水分!并剪除两端褐化部
分"
%
#将材料放入底端带孔的离心管中!将其套入
另一个大的离心管内!
*_
(
%"""C
L
离心
("8/1
!
收集离心管底部的胞外提取液"
*
#向提取液中加
入
#,$
倍体积预冷的甲醇"含
#冰乙酸#!在
!+
_
下浸提过夜"
$
#次日!
*_
(
%$""C
L
离心
%"
8/1
!收集沉淀!依次用
#""(
-"甲醇洗涤沉淀!
去除甲醇后的胞外蛋白粉在
-"_
保存"即质外体
蛋白!
5440
#
C,=
!
细胞壁显微检测与胞外蛋白质含量测定
用
#,"碘
)
碘化钾染色液(蓝墨水染色液浸润
超声破碎的细胞!然后做徒手切片!并在显微镜下检
测细胞结构的变化情况胞外蛋白提取液中蛋白的
含量测定参照
B9E88:/
)
#+
*法进行!用牛血清白蛋白
做标准曲线!计算样品中蛋白质的含量
C,F
!
杨树胞内酶"蛋白#污染的检测
为防止提取液中胞内蛋白的污染!采用细胞内
()4)
葡萄糖"
M)()46N
#脱氢酶活性测定法"胞内标
志酶#检测胞质蛋白的污染率参照
3@89I0?
等)#$*与
a<@?
等)#&*法!向
#""
#
B
茎段胞外蛋白质
提取液(叶片细胞壁蛋白提取液和叶片总蛋白提取
液中分别加入
!,&8B
含
$$88@:
/
B
#
OH/0)NJ:
"
+,"
#(
%,%88@:
/
B
#
]
L
J:
!
(
",!88@:
/
B
#
A564
(
%,%88@:
/
B
#
M)(4
"
()4)
葡萄糖#的混合
液!在
%*"18
处检测
M)()46N
脱氢酶的活性用
胞外蛋白提取液中
M)()46N
脱氢酶活性占总蛋白
提取液中
M)()46N
脱氢酶活性的百分比来检测提
取的胞外蛋白是否有胞内蛋白污染!重复
%
次
CGH
!
杨树胞外蛋白的
C%&
和
$%&
电泳分析
CGHGC
!
胞外蛋白样品处理及
C%&
电泳分析
!
样品
的处理$将提取的胞外蛋白加入样品处理液混匀!在
沸水浴中煮
$8/1
!冷却后在
*_
(
#!"""C
L
下离
心
#$8/1
!取上清液点样!进行
X6X)45M7
电泳分
析分离胶浓度
#!,&!初始电压
+"b
!
#$8/1
后
改为
!""b
恒压!至溴酚兰迁移到距凝胶底部约
#
"
!;8
时终止电泳用
46P?E0I#)67-,*,"
图
像处理软件进行图谱分析
CGHG$
!
$%&
电泳体系优化
!
!)6
电泳参照林梓浩
等)(*的方法并加以改进"
#
#等电聚焦"
T7U
#$按
#"
#
B
%
8
L
胞外蛋白含量加入蛋白裂解液)含
-8@:
/
B
#尿素!
!8@:
/
B
#硫脲!
*\ J<9
G
0
!
#\ 6OO
!
!\ 58
G
<@:
=
IE
"
G
N%
"
#"
#!
#88@:
/
B
#
4]XU
*!
充分摇匀后进行超声波处理
!"8/1
&
%-_
水浴
*$
8/1
!
#!"""C
L
离心
#$8/1
!取上清液
#$"
#
B
!加入
%""
#
B
溶胀液)含
(8@:
/
B
#尿素!
8@:
/
B
#硫
脲!
\J<9
G
0
!
",*\6OO
!
#\58
G
<@:
=
IE
"
G
N%
"
#"
#*水化上样液!涡旋混匀将样品液加入
T4M
0IH/
G
聚焦盘中!再放入
T4M
胶条"
M7NE9:I<;9HE
#!
滴加
!
"
%8B
矿物油水化
#!<
后!在等电聚焦仪
"
2/@)c9Z
#上进行第一向等电聚焦电泳"
T7U
#
T7U
聚焦参数为
!$"b
慢速升压
*$8/1
!
#"""b
快速
升压
#<*$8/1
!
#""""b
线性升压
$<
!
#""""b
非线性快速升压聚焦!使总聚焦伏特小时数达
(""""b<
完成聚焦!最后为
$""b
保持任意时间!
水化和聚焦温度为
!"_
"
!
#平衡$等电聚焦结束
后!将胶条在平衡液
$
)内含
$"88@:
%
BOH/0)NJ:
"
G
N+,+
#!
(8@:
/
B
#尿素!
%"甘油!
!"
L
/
B
#
X6X
!
"
L
/
B
#
6OO
*中振荡平衡
#$8/1
!再在平
#"!
#
期
!!!!!!!!!!!!
陈
!
颖!等$杨树胞外蛋白的提取分离及
!)6
电泳体系的建立
衡液
%
)内含
$"88@:
/
B
#
OH/0)NJ:
"
G
N+,+
#!
(
8@:
/
B
#尿素!
%"甘油!
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L
/
B
#
X6X
!
!$
L
/
B
#碘乙酰胺*中振荡平衡
#$8/1
"
%
#第二向
X6X)45M7
$同
#)6
电泳操作步骤"
*
#凝胶蛋白染
色$
X6X)45M7
结束后!取出凝胶!用去离子水漂洗
!
"
%
次!加入适量的
c)!$"
染色液!于摇床上轻轻
染色
%<
!随后用脱色液洗脱至背景清晰
C,;
!
杨树胞外蛋白电泳图谱分析
显色后的凝胶用
J凝胶成像系
统"
2/@)c9Z
#扫描获取图像单向电泳采用
P?91I/)
I
=
S1E#)6
分析软件进行条带的识别和分析双向
电泳采用
46P?E0I!)67-,*,"
对图谱进行蛋白点
的检测
!
!
结果与分析
$,C
!
杨树叶片细胞壁破碎程度检测及显微检测
细胞壁的提取与叶片的破碎程度有关!叶片越
破碎!细胞壁越易提取出来在图版
$
!
J
"
7
中!
在用液氮研磨后的叶片进行光镜检测时!可以看到
叶片组织块较大!破碎程度小"图版
$
!
J
#&经超声
破处理
$8/1
后!叶片组织块开始变小"图版
$
!
6
#!当超声破处理
#"8/1
后!叶片已成为非常小的
碎片!这对后面的细胞壁蛋白的提取是有利的!因此
在细胞壁的提取过程选择超声波处理
#"8/1
效果
较好"图版
$
!
7
#
将
$8/1
和
#"8/1
超声处理的细胞碎片悬浮
液用碘化钾和蓝墨水染色后!可以看到胞内结构易
着色!而细胞壁不易着色"图版
$
!
U
"
M
#细胞破
碎时间不同!细胞的结构变化相差很大!超声波处理
$8/1
后!可以看到大量细胞壁网络!但胞内细胞质
保留较多"图版
$
!
U
#!而
#"8/1
超声破碎处理!其
叶片细胞中细胞质大部分已经去除!只看到细胞壁
连接而成的网络!还可以观察到大量气孔存在!说明
#"8/1
超声破碎清除胞内物质的效果较好"图版
$
!
M
#
$,$
!
杨树叶片胞内蛋白污染检测
M)()46N
脱氢酶是植物细胞内呼吸过程中重
要的糖代谢酶!代表植物细胞的活力程度!也是判断
细胞活力强弱的标志酶!常被用来检测细胞器提取
液的纯净程度或污染程度)#&*从表
#
中可以看出!
叶片细胞壁蛋白提取较纯!该酶占总蛋白提取液的
!,&!而茎段质外体蛋白提取液中该酶活性占总蛋
白酶活性的
#*,#!低于细胞壁提取液的纯度!但
仍在允许的范围之内
$,D
!
杨树胞外蛋白的电泳图谱分析
$GDGC
!
杨树叶片胞外蛋白
?&?%73I
分析
!
从图
#
的
J
(
6
泳道电泳胶中可以看出!分别用加
J9J:
!
和
B/J:
提取的
AB+&$
杨叶片细胞壁蛋白条带差异
很大!
J9J:
!
纯化的蛋白较
B/J:
提取的蛋白条带清
晰(带宽!而
B/J:
纯化的胞外蛋白清晰度差!条带数
和条带宽度都远小于
J9J:
!
在此提取方法中
J9J:
!
提取的细胞壁蛋白主要是以弱键形式与细胞壁结合
的蛋白!大多属于酶类!说明在细胞壁的提取液中与
细胞壁和胞外基质活动相关的酶类含量丰富!细胞
代谢活动旺盛"图
#
!
J
泳道#
从图
#
中还可以看出!提取样品叶片的质量与
提取蛋白的含量关系密切!同样用
J9J:
!
提取胞外
蛋白的方法中!用
-
L
"图
#
!
J
泳道#叶片样品电泳
的多肽条带清晰度差!条带弥散不集中!但用
#$
L
"图
#
!
2
泳道#叶片量提取的蛋白与前者比较!条带
数明显增加!条带清晰(带宽!可以观察到的条带有
#!
"
#*
条!分子量主要分布在
#%
"
($ 6^
之间!其
中丰度较高的亚基分布在
*%
(
%"
和
!$ 6^
附近
表
C
!
胞外蛋白提取液中胞内蛋白污染检测
O9Y:E#
!
6EIE;I/@1@>/1IH9;E:?:9H;@1I98/19I/@1/17J40
部位
4@0/I/@1
M)()46N
酶活性"
5
%*"
#
M)()46NE1V
=
8E
9;I/D/I
=
占总蛋白比例
4EH;E1I9
L
E@>
I@I9:
G
H@IE/1
%
叶片
JK40
提取液
JK40@>:E9DE0
","#*d",""# !,&
茎段液流蛋白提取液
5440E[IH9;I/@10
","(+d","!* #*,#
总蛋白提取液
O@I9:
G
H@IE/1E[IH9;I/@10
",*+%d","!$ #""
图
#
!
AB+&$
杨胞外蛋白的
#)6
电泳图谱
],]9H^EH
&
5,
总蛋白&
2,
细胞壁蛋白"
#$
L
叶片!
J9J:
!
提取#&
J,
细胞壁蛋白"
-
L
叶片!
J9J:
!
提取#&
6,
细胞壁蛋白"
-
L
叶片!
B/J:
提取#&
7,
茎段质外体蛋白"茎段!真空渗入提取#
U/
L
,#
!
X6X)45M7/89
L
E919:
=
0/0@>AB+&$
G
@
G
:9H:E9>JK40
"
56
#
91Z0IE8
"
7
#
7J40
],]9H^EH
&
5,O@I9:
G
H@IE/1
&
2,JK40
"
#$
L
:E9DE0
!
J9J:
!
E[IH9;I/@1
#&
J,JK40
"
-
L
:E9DE0
!
J9J:
!
E[IH9;I/@1
#&
6,JK40
"
-
L
:E9DE0
!
B/J:E[IH9;I/@1
#&
7,5440
"
0IE80
!
D9;??8/1>/:IH9IE0E[IH9;I/@1
#
!"!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
在
*% 6^
附近有较为丰富的蛋白存在!
c)!$"
染色
深!亮度大通过与总蛋白电泳胶"图
#
!
5
泳道#比
较!
#
!
$)!)4
核酮糖羧化酶的大亚基"
$$ 6^
#在
2
泳
道电泳胶中非常弱!说明细胞壁蛋白提取的纯度较
高"图
#
!
2
#而总蛋白的
X6X)45M7
图谱中可以
看到标志酶
#
!
$)!)4
核酮糖羧化酶的大亚基"
$$
6^
#存在!总蛋白图谱中多肽的条带多于胞外蛋白
的条带数"图
#
!
5
泳道#经真空渗入法提取的茎
段胞外蛋白
X6X)45M7
电泳见图
#
!
7
泳道!可见在
*% 6^
附近有较大的多肽带存在!在
*" 6^
以下有
少量条带存在!而在高分子量区域
$"
"
&- 6^
区域
中多肽条带稀少!说明杨树的茎段质外体蛋白主要
分布在小分子量蛋白区域
$GDG$
!
杨树叶片胞外蛋白的
$%&
电泳分析
!
#
"不同
G
N
胶条和提取方法对杨树叶片细胞
壁蛋白
!)67
图谱的影响
!
为探究杨树细胞壁蛋白
最佳的
G
N
范围!采用了
G
N%
"
#"
和
*
"
-
(长为
#-
;8T4M
胶条进行研究结果表明"图
!
#!从叶片提
取的
AB+&$
杨细胞壁蛋白经
!)6
双向电泳后!在不
同
G
N
介质中出现的蛋白质多肽斑点差异较大在
G
N%
"
#"
介质条件下"图
!
!
5
#!电泳图谱中蛋白质
斑点较少!而且不清晰!统计斑点数在
$"
个左右!大
部分在
*%
"
!" 6^
之间而在
G
N*
"
-
介质条件
下"图
!
!
J
#!电泳图谱中蛋白质斑点较
G
N%
"
#"
介
质条件下增多且斑点清晰!且在
((
"
*$ 6^
之间出
现了蛋白斑点!
*$
"
%$ 6^
之间是斑点最密集区域!
!$,"
"
#+," 6^
之间斑点也比较密集!蛋白点最密
集的条带在
%# 6^
左右!斑点数最多!最清晰!经软
件统计的斑点数达
#$"
个左右!再次说明杨树细胞
壁蛋白"
J9J:
!
#提取部分!弱碱结合的细胞壁蛋白的
分子量主要分布在低分子量(酸性区域!即小分子量
蛋白居多
从上样量来看!
$""
#
L
"图
!
!
2
#上样量蛋白点
较少!清晰度较差!特别是低丰度的蛋白分辨率差&
#"""
#
L
"图
!
!
J
#上样量无论从蛋白点的斑点数(
清晰度(低丰度蛋白的表达量来讲都最好!蛋白质点
呈圆形!重复性好!斑点数达
%""
多个&而
#!""
#
L
"图
!
!
6
#上样量由于上样量高!导致大多数蛋白质
点没有完全分离!叠加在一起
尽管酚
)
甲醇%醋酸铵沉淀法在
#"""
#
L
上样
图
!
!
AB+&$
杨叶片细胞壁蛋白
!6
电泳图谱"
#-;8T4M
!
G
N*
"
-
#
U/
L
,!
!
!)67/89
L
E919:
=
0/0@>AB+&$
G
@
G
:9HJK40E[IH9;I/@1Y
=
91Z
G
%
AN*5;
"
#-;8T4M
!
G
N*
"
-
#
5,$""
#
L
&
2,$""
#
L
&
J,#"""
#
L
&
6,#!""
#
L
%"!
#
期
!!!!!!!!!!!!
陈
!
颖!等$杨树胞外蛋白的提取分离及
!)6
电泳体系的建立
量(
#-;8
胶条(
G
N*
"
-
条件下获得了较为满意的
蛋白质图谱!但由于胶条较窄!出现部分蛋白质点的
重叠和堆积!斑点仍然较少在用
OJ5
%丙酮沉淀
法提取的细胞壁蛋白中!改进了提取技术!采用加大
离心力到
#$"""C
L
(延长离心至
%"8/1
!并在提取
液中添加
6OO
和
4]XU
!使细胞壁蛋白的提取效果
大大增加!采用
$""
#
L
"图
%
#上样量(
!*;8
胶条(
G
N*
"
-
条件下获得了满意结果!蛋白质电泳图谱
清晰度提高!特别是蛋白质斑点数大大增加!斑点数
达
$$"
多个!比酚
)
甲醇%醋酸铵沉淀法多了
!""
多
个斑点!是较为有效的一种纯化方法
!!
!
!
"杨树茎段胞外蛋白的
!)6
电泳分析
!
AB+&$
杨细胞壁蛋白经
!)6
电泳后!在不同
G
N
介
质胶条下电泳出现的蛋白质斑点与在叶片中的
G
N
范围不同在
G
N%
"
#"
介质条件下"图
*
!
5
#!电
泳图谱中蛋白质斑点较多!而且清晰!在高分子量部
图
%
!
AB+&$
杨叶片丙酮沉淀法细胞壁蛋白的
!6
电泳图谱"
$""
#
L
!
*;8T4M
!
G
N*
"
-
#
U/
L
,%
!
!)67/89
L
E919:
=
0/0@>AB+&$
G
@
G
:9H
JK40E[IH9;I/@1Y
=
OJ5
%
9;EI@1E
G
HE;/
G
/I9I/@1
"
$""
#
L
!
*;8T4M
!
G
N*
"
-
#
分
-"
"
&- 6^
区域也有斑点存在!但较少!在
%#
"
(( 6^
区域蛋白主要分布在
G
N$
"
-
之间的中性区
域&
%#
"
*% 6^
之间蛋白斑点最多!特别是在
*% 6^
左右!蛋白斑点最为集中!依然说明茎段胞外蛋白主
要分布在小分子量的区域而在
G
N*
"
-
介质条
件下!电泳图谱中蛋白质斑点并没有表现出比
G
N%
"
#"
之间多的现象!也是主要在
%#
"
(( 6^
之间蛋
白斑点最多!但斑点堆积现象明显"图
*
!
2
#
%
!
讨
!
论
目前胞外蛋白的提取方法主要有两种!一种是
细胞毁坏型即通常采用先提取细胞壁!再从细胞壁
中纯化出蛋白)#*)#$*!主要应用于叶片&另一种是细胞
非毁坏型即通过真空渗入法)#-!#&*将胞外蛋白提取
出来!主要应用于茎段不同植物胞外蛋白的提取
技术相差很大!在本研究中叶片细胞壁蛋白采用了
第一种方法!在细胞壁的超声破碎过程中!
#"8/1
超声波对细胞壁的破碎程度最好!超声波处理后溶
液明显比处理前溶液均匀!且粉末更加细致!这样大
大增加了与提取液接触面积!进而提高了蛋白样品
质量通过染色镜检叶肉细胞中的胞内物质!可看
出该法已将其大部分去除!检测到大部分结构为去
除胞内成分的细胞壁!结果与朱紁昊等)##*的方法一
致!证明该法对细胞壁的破碎是可行的用真空渗
入法提取叶片胞外蛋白时!由于杨树叶片汁液流动
不及农作物!因而提取的胞外蛋白量非常少!需要大
量的叶片材料"资料未给出#!因此利用前一种方法
提取叶片胞外蛋白较好在茎段质外体液流蛋白的
提取过程中!采用了多年生实生苗杨树"春季嫩梢#
和组培苗的茎段提取作对比!发现实生苗由于枝条
较粗且已木质化!酚氧化酶活性强!在提取过程中亦
图
*
!
AB+&$
杨茎段胞外蛋白双向电泳图
U/
L
,*
!
!)67/89
L
E919:
=
0/0@>AB+&$
G
@
G
:9H9
G
@
G
9:0I
G
H@IE/10>H@80IE80
*"!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
褐化!给提取质外体液流蛋白带来困难"资料未给
出#!而利用组培苗的幼嫩茎段提取质外体液流蛋
白!其效果较好
在样品的用量方面!大部分文献中通常介绍样
品量在
$
"
#"
L
之间!但在杨树胞外蛋白提取过程
中!发现低量"
-
L
左右#!只有用
J9J:
!
纯化的蛋白
多肽条带清晰!用
B/J:
提取的蛋白电泳后条带不清
晰!浓度低!不能用于分析采用高质量"
#"
L
以
上#样品提取的胞外蛋白条带清晰(带宽(浓度高!说
明杨树细胞壁蛋白的提取需要较高的样品用量!这
与林梓浩等)(*在黄瓜中细胞壁蛋白提取只用
$
L
的
量相差很大!说明不同的植物细胞壁蛋白具有特异
性!另外也可能与提取的方法有关
在蛋白纯化中!采用的方法主要有丙酮干粉法
和饱和酚法酚
)
甲醇%醋酸铵沉淀法主要是用于从
富含次生代谢物的复杂样品中提取蛋白质的方
法)!"*&在酚
)
甲醇%醋酸铵沉淀法中本实验获得了
%""
多个蛋白质斑点!提取效果较好!与黄雅芳等)!#*
结果相似&而采用丙酮%沉淀法纯化的细胞壁蛋白效
果要好于上述方法!且采用
!*;8
的大胶条更有利
于杨树细胞壁蛋白斑点的展现!斑点达
$$"
个!是较
为理想的纯化方法在本研究中影响双向电泳蛋白
斑点数量和清晰度的因素主要有
!
个$一是胶条
G
N
范围!
G
N*
"
-
胶条对杨树细胞壁蛋白的分辨率
较有利!分离出的蛋白质斑点多而密集(清晰度高!
减少了蛋白斑点的堆积和重叠!而用
G
N%
"
#"
胶
条蛋白质斑点较少!低丰度蛋白不清晰!蛋白斑点堆
积(重叠相反!茎段质外体蛋白采用
G
N%
"
#"
的
胶条效果更好!说明不同器官之间蛋白质分子量区
域有差异!需要的
G
N
值也不同二是胶条长度!采
用
!*;8
胶条比
#-;8
的胶条得到的蛋白斑点多
杨树是林木研究的模式树种!而胞外蛋白在应
答环境胁迫和环境适应性中具有非常重要的作
用)%*本研究利用
AB+&$
杨组培苗的叶片和茎段
初步建立了杨树胞外蛋白的双向电泳技术体系!为
开展杨树细胞壁蛋白的研究提供了前提条件!为差
异蛋白的分析奠定了基础茎段质外体蛋白的提
取(纯化的方法还需进一步完善和探索
参考文献!
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