全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(2): 215-218(2013)
收稿日期: 2012-01-29; 修回日期: 2012-12-10
基金项目: 国家烟草专卖局科技项目“全国烟草有害生物调查研究”(国烟办综(2010)182 号); 辽宁省烟草专卖局科技攻关项目“辽宁
省烟草有害生物调查研究”(辽烟计(2010)86 号)
通讯作者: 吴元华,博士,教授,主要从事植物病毒学和生物农药研究; Tel: 024-88487359, E-mail: wuyh09@vip. sina. com。
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■研究简报
烟草靶斑病菌菌丝融合群及 ITS序列分析
吴元华∗, 伏 颖, 赵秀香, 穆凌霄, 赵艳琴
(沈阳农业大学植物保护学院, 沈阳 110866)
The anastomosis groups and ITS sequence analysis of Rhizoctonia solani isolates of
tobacco target spot　 WU Yuan-hua, FU Ying, ZHAO Xiu-xiang, MU Ling-xiao, ZHAO Yan-qin　
(College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)
Abstract: Fifty-eight isolates of Rhizoctonia solani were isolated from tobacco target spot disease samples col-
lected from tobacco growing areas in Liaoning Province. The test results of anastomosis groups (AGs) by glass
slide fix position mating method showed that all isolates of R. solani belonged to AG-3. The rDNA ITS se-
quence of the R. solani strain YC-9 was amplified and sequenced by using the universal primers ITS1and ITS4,
and compared by nucleotide BLAST with other nucleotides in GenBank. It was showed that the ITS sequence of
YC-9 (653 bp) was completely identical to that of the R. solani AG-3 isolate from tomato foliar blight. The re-
sults provide important basis for further investigation of tobacco target spot disease.
Key words: Tobacco target spot; Rhizoctonia solani Kühn; anastomosis groups; ribosomal DNA; internal
transcribed spacer;sequence analysis
文章编号: 0412-0914(2013)02-0215-04
　 　 烟草靶斑病是 2006 年我国新报道发生的一种
叶部病害[1],其病原的无性世代为立枯丝核菌
(Rhizoctonia solani Kühn),有性世代为瓜亡革菌
(Thanatephorus cucumeris (Frank)Donk)。 该病菌
主要危害叶部形成病斑,对烟草的产量和品质影响
显著,目前该病害主要分布在辽宁省丹东和铁岭地
区,并呈现出迅速蔓延趋势。 烟草靶斑病最早由巴
西报道,此后,哥斯达黎加、美国、南非和津巴布韦
也相继发生[2,3]。
由于立枯丝核菌致病性复杂,寄主范围广,形
态变异大,因此分类有一定的难度。 现今,立枯丝
核菌的分类是应用菌丝融合法进行菌丝融合群的
划分,同一融合群的菌株在形态、生理和致病性等
方面有着相同或相近的趋势,而不同融合群的菌株
之间有较明显的差异。 此外,真菌的 rDNA ITS
( internal transcribed spacer)序列也可作为分类的
依据,近年来人们发现真菌的 ITS序列具有较高的
保守性,种内相对一致,种间差异比较明显,因此已
将其广泛运用到多种真菌种属水平的分类鉴定研
究中。
众所周知,立枯丝核菌多引起植物的根茎病
害,少有引起叶部病害的报道。 鉴于烟草靶斑病
为国内新报道的由立枯丝核菌侵染引起的为害
相当严重的叶部病害,尚缺乏系统研究,因此有
必要明确其融合群划分问题,并对病菌的 ITS 序
列进行比较分析,为烟草靶斑病的进一步研究奠
定重要理论基础。
　
植物病理学报 43 卷
1　 材料与方法
1. 1　 立枯丝核菌的分离与鉴定
采用常规组织分离法从新鲜病叶的病健交界
处分离病菌,于 25℃,24 ~ 48 h 恒温培养。 待菌丝
长出,根据 Parmeter[4]等人的鉴定标准,镜检确认
是立枯丝核菌后,切割单枝菌丝尖端,进行单菌丝
分离与纯化,移植于 PDA斜面上培养,以获得该菌
株的纯培养物,根据采集地点进行编号。
1. 2　 菌丝融合群的鉴定
标准测试菌株 AG-1-IA、AG-1-IB、AG-1-IC、
AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-2-2IV、AG-3、AG-4-HGI、
AG-4-HG Ⅱ、 AG-5、 AG-6-HGI、 AG-6GV、 AG-8、
AG-9、AG-BI由沈阳农业大学植物保护学院免疫
室惠赠。 采用玻片配对法,将待测菌分别与各融合
群标准测试菌株配对进行融合观察。
1. 3　 菌丝基因组 DNA的提取
选取烟草靶斑病菌代表性菌株 YC-9 移植至
PDA平板上,28℃培养 3 d 后,取菌饼转移至盛有
PD培养液的培养皿中,28℃下静置培养,待菌丝长
满皿后,取出菌丝,真空干燥后装入 1. 5 mL 的离
心管中, -20℃备用。 DNA提取采取 CTAB法。
1. 4　 rDNA ITS序列扩增及分析
采用真菌核糖体基因转录间隔区( ITS)通用
引物 ITS1 和 ITS4,对病菌 rDNA ITS 序列进行
PCR扩增。 TS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-
3′; ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。
PCR 扩增反应体系: 10 × PCR Buffer 5. 0 μL,
MgCl2(25 mM) 4. 0 μL,dNTP(2. 5 mM) 4. 0 μL,
ITS1(10 μM)和 ITS4 (10 μM)各 2. 0 μL,模板
DNA(50 ng·μL -1) 1. 0 μL,Taq酶(5 U·μL -1)
0. 5 μL,ddH2O 31. 5 μL,反应总体积为 50 μL。 扩
增反应程序:94℃预变性 5 min;94℃变性 30 s,
55℃退火 45 s,72℃延伸 1 min,35 个循环;72℃延
伸 10 min。 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳,溴化
乙锭染色,凝胶成相系统观察并拍照。 将 PCR 产
物送至大连宝生物公司进行纯化并测序。 测序结
果在 GenBank 核酸序列数据库进行同源序列搜
索,并做序列比对、分析。 ITS 序列信息登录 Gen-
Bank注册。
2　 结果与分析
2. 1　 立枯丝核菌的分离与鉴定
从辽宁省烟草主产区丹东市和铁岭市采集的
烟草靶斑病病斑上分离得到 58 株立枯丝核菌
(Rhizoctonia solani Kühn)菌株(表 1),其形态特征
符合 Parmeter等[4]对立枯丝核菌种的描述。 主要
特征有:无性世代不产生任何孢子;菌丝分枝在其
起源处缢缩;分枝菌丝在离起源处不远有隔膜,隔
膜具桶孔;菌丝分枝呈直角或锐角,主轴菌丝宽度
大于 6 μm;菌体呈不同深浅的褐色;细胞多核;多
形成内外结构均一的菌核等。
Table 1　 Isolates of Rhizoctonia solani and their sources
Strain Locality Number of strain
YMC-01 ~ 09 Yangmuchuan township in Kuandian county, Dandong 9
QYS-01 ~ 07 Qingyishan township in Kuandian county, Dandong 7
DB-01 ~ 07 Dapu township in FengCheng county, Dandong 7
BKS-01 ~ 08 Bakeshu township in Kaiyuan county, Tieling 8
LJT-01 ~ 09 Lijiatai township in Kaiyuan county, Tieling 9
LF-01 ~ 02 Linfeng township in Kaiyuan county, Tieling 2
HL-01 ~ 07 Helong township in Xifeng county, Tieling 7
YC-01 ~ 09 Yingchang township in Xifeng county, Tieling 9
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　 2 期 　 　 吴元华,等:烟草靶斑病菌菌丝融合群及 ITS序列分析
2. 2　 立枯丝核菌菌丝融合群测定
采用载玻片定位融合法,将待测菌株与标准菌
株对峙培养,对 58 个立枯丝核菌菌株进行融合群
测定。 结果表明,采集的烟草靶斑病菌的菌株全部
与 AG-3 融合群融合,即菌丝接触后,接触细胞间
细胞壁溶解,细胞质相互融合,细胞核流入另一菌
丝内(图 1);而不与其它标准融合群菌株如 AG-1-
IA、AG-1-IB、AG-1-IC、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-2-
2IV、 AG-4-HGI、 AG-4-HG Ⅱ、 AG-5、 AG-6-HGI、
AG-6GV、AG-8、AG-9、AG-BI 融合(图 2)。 此结
果表明,我国引起烟草靶斑病的立枯丝核菌应归入
AG-3 融合群。
Fig. 1 　 The complete fusion of two hyphae
from the test and standard strain of
Rhizoctonia solani
Fig. 2 　 The non-fusion of two hyphae from
the test and standard strain of Rhi-
zoctonia solani
2. 3　 基因组 DNA的提取与检测
采用 CTAB 法提取烟草靶斑病菌代表菌株
YC-9 的基因组 DNA,有效地去除了多糖、蛋白质
和 RNA。 提取的病菌基因组 DNA 经微量紫外分
光光度计检测,其 OD260 / 280值接近 1. 80,经电泳检
测,点样孔亮度不明显,只有 1 条带,且条带较整
齐、清晰、无弥散、拖尾现象,表明提取的 DNA 样
品完整性好且纯度高,基本无降解和 RNA 污染,
完全满足 PCR 扩增对样品基因组 DNA 质量的要
求。 用 TE稀释,将 DNA样品浓度调整至 50 ng·
μL -1,置于 -20℃冰箱中备用。
2. 4　 rDNA ITS序列扩增及分析
利用通用引物 ITS1 和 ITS4,以菌株 YC-9 菌
丝的基因组 DNA为模板,PCR 扩增出一条特异性
条带,测序结果表明,ITS 序列长度为 653 bp。 将
所测定的 ITS 序列在 GenBank 中注册,登录号为
HQ827784。
将烟草靶斑病菌菌株 YC-9 的 rDNA ITS序列
与 GenBank中的核酸序列进行 BLAST 检索比对,
结果显示,其与登录号为 GQ885147 的 ITS 序列具
有 100%同源性,该序列是引起番茄叶部病害的立
枯丝核菌,属于 AG-3 融合群。
3　 结论与讨论
立枯丝核菌各融合群对寄主植物的选择表现
出一定的专化性。 一般认为在自然条件下,AG-1-
IA菌株主要侵染水稻;AG-1-IB 菌株主要侵染一
些苗木;AG-2 菌株倾向于十字花科植物;AG-3 菌
株侵染茄科作物,尤其是马铃薯;AG-4 菌株寄主范
围广,偏向于为害多种植物的幼苗,造成立枯病;
AG-5 菌株主要来自于土壤;AG-6 菌株则不被认为
是植物病原菌。 国外有关于烟草靶斑病菌融合群
的报道,Shew 等[2]曾报道在美国北卡罗来纳州该
病菌属于 AG-2-2 融合群,而 Stevens 等[5]报道该
地区病菌属于 AG-3 融合群;Meyer 等[3]报道南非
该病菌也属于 AG-3 融合群。 本文从采自辽宁地
区的烟草靶斑病病斑上分离得到了 58 株立枯丝核
菌菌株,经融合群测定,基本可以明确在我国引起
烟草靶斑病的立枯丝核菌融合群均为 AG-3 融合
群。 进一步应用分子生物学技术对烟草靶斑病菌
的核糖体 DNA中的内转录间隔区( ITS)序列进行
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植物病理学报 43 卷
分析,并与 GenBank中的序列进行同源性比对,认
为其与引起番茄叶部病害同属于 AG-3 融合群的
立枯丝核菌的 ITS 序列的同源性达到 100% 。 因
此,在分子水平上的鉴定也表明了烟草靶斑病的病
原菌为立枯丝核菌,并且其属于 AG-3 融合群,这
与形态学和玻片配对法融合群鉴定的结果一致。
换言之,基于 ITS序列的分子鉴定完全支持了基于
形态特征的鉴定结果。
本文首次系统研究了我国烟草靶斑病菌菌丝
融合群的归属问题,并对病菌的 ITS序列进行了测
定分析,为我国首次报道。 这对烟草的抗病育种及
病害防治工作具有重要的理论和指导意义。
参考文献
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Acta Tabacaria Sinica (中国烟草学报), 2006, 12
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ris [J] . Phytopathology, 1969, 59: 1270 -1278.
[5] 　 Stevens Johnk J, Jones R K, Shew H D, et al. Chara-
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from potato and tobacco [ J] . Phytopathology, 1993,
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责任编辑:李晖
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