全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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基金项目$陕西省科技厅自然科学基础研究计划"
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#&陕西省教育厅自然科学研究"
#+13##$)
#&陕西理工学院研究生创新基金
"
456789#+!!
#
作者简介$蒋景龙"
#:)"(
#!男!博士!讲师!硕士生导师!主要从事西洋参无性快速繁殖与发根农杆菌转化研究
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五加科植物发状根诱导研究进展
蒋景龙!蒋
!
超!沈季雪!徐卫平
"陕西理工学院 生物科学与工程学院!陕西汉中
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#
摘
!
要$五加科植物多为重要的中药材!利用发根农杆菌诱导五加科药用植物产生发状根!并从中获取有用的次生
代谢产物!是保护五加科珍稀药用植物资源和实现有效次生代谢物质工业化生产的有效途径该文在概述发根农
杆菌转化药用植物研究历程和转化机理研究的基础上!对近年来在发根农杆菌诱导五加科植物的种类及诱导率(
影响发根农杆菌诱导五加科植物的各种因素和利用发根农杆菌诱导五加科植物获得再生植株等方面研究进行了
重点分析!并对今后亟需研究的几个重点方向进行了展望!以期为五加科药用植物的良性开发和合理利用提供
参考
关键词$五加科&发根农杆菌&冠瘿碱&乙酰丁香酮&诱导率
中图分类号$
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文献标志码$
B
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五加科"
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属
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余种!
仅中国就有
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属
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余种)#*已知可供药用的植
物有
##+
种"包括
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个变种!
#
个变型#!其中不乏
多种名贵中药材!如人参"
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"
13
4
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5
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加 "
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5
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#(东 北 刺 人 参
"
9
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#(刺五加"
76)+(-)#$$+00)/(*;
$0+0
#和龙牙
!
木"
!#&6*&,&/80-#*&
#等近年研
究表明!五加科植物大多具有抗肿瘤(抗衰老(降血
脂(活血补气和利脾补肾等医药作用)!*五加科药
用植物多为多年生!生长周期较长!野生资源遭受无
计划采挖!不少名贵药材已濒临绝迹)%*为保护和
开发利用这些药材!常利用人工栽培和组织培养技
术进行引种扩繁!但组织培养过程中!培养周期长(
药用次生代谢物含量不稳定以及再生苗成活率较低
等因素都极大地限制了该技术的工业化发展随着
生物工程技术的不断发展!利用发根农杆菌诱导药
用植物产生毛状根!并对毛状根进行离体培养!大量
提取重要药用成分!是药用植物资源可持续发展的
有效途径之一
发根农杆菌"
!
"
#$%&()#*+,#-*.$
"
)/)0
#属于
根瘤菌科"
ZE.U@W.R=AI=I
#农杆菌属"
!
"
#$%&();
8+,
#革兰氏阴性菌!能侵染绝大多数的双子叶植物
和少数单子叶植物以及个别裸子植物!使植物合成
冠瘿碱并产生许多不定根这种不定根生长迅速!
不断分支成毛状!故称之为发根或毛状根发状根
是由发根农杆菌含有的
Z.
质粒引起的)+*发状根
具有生长快速(自身合成植物激素(遗传性状和生化
特性稳定(合成次生代谢物质能力强等特点!更重要
的是!发状根的次生代谢物的含量不仅更高!而且还
能产生某些植物愈伤组织所不能合成的有效成分
本文就发根农杆菌转化药用植物研究进程(发根农
杆菌转化机制(发根农杆菌诱导五加科植物种类(诱
导条件的优化和五加科再生植株诱导方面的研究做
了综述!以期为五加科药用植物的良性开发和合理
利用提供参考
#
!
发根农杆菌转化药用植物研究历程
#:)
年!日本学者
7@/E.Y=X=
等)$*首次通过人
参愈伤组织成功诱导出了发根
!""#
年!王冲之
等)&*以西洋参胚为材料!用含
Z.
质粒的发根农杆菌
及经过胡萝卜提取液处理的菌株感染的无菌苗切
段!在含
&<
?
%
5
萘乙酸"
DBB
#的培养基上培养获
得了发根刘峻等)*利用含
Z.
质粒的发根农杆菌
感染人参!首次从人参的带叶幼茎部位诱导出发状
根!并利用
[8Z
证实
Z.
质粒携带的
P@>A
序列已整
合到人参转化株的染色体中
!""%
年!
4I@
等)*分
别用刺五加的下胚轴和胚根均诱导出发状根!且前
者诱导率更高
!""$
年!于树宏等):*通过发根农杆
菌对虎杖进行遗传转化!发现其成熟叶片的发状根
平均诱导率为
$$,&&
!"")
年!王伟等)#"*发现用
发根农杆菌
Z#$)%+
诱导喜树胚轴能获得
%",)%诱导率
!"#!
年!芦韦华等)##*以新疆紫草为材料!
采用二阶段液体培养法首次建立了新疆紫草发状根
培养技术体系
!"#%
年
]=0.
-
I>=
等)#!*用百金花属
植物也诱导出了发状根
!"#+
年
I^PI等)#%*建 立 了 茜 草 的 发 根 转 化 体 系
!"#$
年
]<.RP@Q.A
等)#+*用绿藜诱导出发根且测得其总酚代
谢量远远高于野生型植株到目前为止!国内外己
有
%"
余科
+"
个属)#$*的药用植物如人参"
1&/&2
"
*/0)/
"
#(丹参"
<&6=*&,*6(*$##-*.&
#(绞股蓝"
>
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;
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:
)/(&
:
-
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66+,
#(红花亚麻"
@*/+,
"
#&/;
8*
5
6$#&
#(青蒿"
!#(),*0*&&#=*
5
$6*&
#(新疆雪莲
"
<&+00+#)&*/=$6+#&(&
#(王不留行"
A&&#*&0)
"
;
)(&6*0
#(秦 艽 "
>)/(*&/& ,&#$
:
-
?
66&
#(积 雪 草
"
B)/()66&&0*&(*&
#以及何首乌"
C&66$
:
*&,+6(*
5
6$;
#+,
#等的发状根诱导获得成功)#&*#)*
!
!
发根农杆菌转化机理
Z.
质粒是位于发根农杆菌染色体之外的独立
的双链环状
]DB
!一般在
#)"
"
!$"YW
之间)#:*
Z.
质粒主要有复制起始区"
_P.
区#(接合转移区(冠瘿
碱分解区和
!
个主要功能区)转移区"
T*]DB
区#
和致病区"
.^P
区#*等几部分其中
T*]DB
区是一
段不连续的
]DB
!依次包括
T5*]DB
区(生长素
区(激动素区(冠瘿碱区和
TZ*]DB
区"图
#
!
B
#!
.^P
区主要编码
T*]DB
转入并整合到植物基因组
上的各种功能性蛋白"图
#
!
N
#
发根农杆菌诱导五加科植物产生发状根的过程
可以概括为
$
个阶段
:
个步骤"图
#
!
8
#第一阶段
为信号的产生和接收植物受伤处的细胞会产生一
些糖类或酚类如乙酰丁香酮等物质!农杆菌识别和
接收这些小分子信号物质!然后产生纤维丝吸附在
易感染的植物细胞上同时!农杆菌形态因诱导物
的诱导作用向线形转变!线形的一端附着于植物细
胞表面第二为
T*]DB
复合体的初加工阶段信
号分子进入发根农杆菌后!
.^PB
和
.^P6!
蛋白组
成双组分信号系统!激活靶向在
T*]DB
边界序列
的限制性内切酶
.^P]#
和
.^P]!
!
T*]DB
在二者的
剪切下边界序列脱落!同时释放单链
T*]DB
"
//T*
]DB
#然后!
.^P]!
以极性共价键的方式附着在
//T*]DB
的
$`
端!形成不成熟的
T*]DB
前体第
三阶段为
T*]DB
前体进入植物细胞胞质
.^PN
和
.^P]+
等效应蛋白将
T*]DB
前体包裹在
.^Pa
的效应下通过
C^
型分泌系统以线性的方式穿过
!
层细胞膜+注射,到植物细胞胞质中!随后
.^Pa
(
.^P;!
(
.^P;%
和
.^P]$
蛋白也以同样的方式进入
植物细胞第四阶段为
T*]DB
由胞质进入细胞
核单链的
T*]DB
前体与
.^P;!
蛋白结合!高度
螺旋化形成成熟的双链
T*]DB
!在
.^P]!
和
.^P;!
蛋白核定位信号的作用下移向细胞核!
.^P;%
发挥
作 用保护
T*]DB
免受核酸酶的降解!
.^Pa
和
T*
!#
&
期
!!!!!!!!!!!!!!!
蒋景龙!等$五加科植物发状根诱导研究进展
图
#
!
发根农杆菌的结构及转导发根机制"根据
[=AHP=P
)
!#
*图示改进#
发根农杆菌转导的
:
个步骤为$
#,
受伤的植物细胞产生信号分子&
!,
信号分子被发根农杆菌识别(接受&
%,
发根农杆菌吸附在细胞表面&
+,
激活
.^P
蛋白加工
//T*]DB

$,
形成不成熟的
T*]DB
复合体&
,T*]DB
进入细胞&
,
装配成熟的
T*]DB
复合体和核输入&
),T*]DB
整合到植物基因组中&
:,
发根农杆菌基因的表达和蛋白质的合成
a.
?
,#
!
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"
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*
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0REI/./@MW=ARIP.=>
L
P@RI.0/
]DB
复合体经过核孔复合体进入到细胞核中第
五阶段为
T*]DB
的整合与表达在
.^P]!
和
.^P;!
等蛋白的定位下!
T*]DB
复合体靶向植物染
色体特定区域并与之结合!同时
.^P
蛋白从
T*]DB
复合体上解离!而
T*]DB
整合到宿主基因组中
T*]DB
上携带的外源基因表达并合成冠瘿碱(生长
素和激动素等物质以促进发状根的形成)!"*!!*
%
!
发根农杆菌诱导五加科植物种类及
诱导率的研究
!!
目前!已有近百种药用植物成功诱导出发状根!
但五加科药用植物诱导比例仅为
!,)
!%
*
!其中人
参(西洋参(竹节参(龙牙
"
木和刺五加等已成功诱
导出发状根!且诱导率随种类(外植体和菌种的不同
呈现一定的差异性"表
#
#
8,9
!
人参
1I@0
?
等)!+*利用农杆菌
3T8T!++
转化人参的
参根片诱导出发状根!在一定条件下培养!生命力旺
盛!生长良好赵寿经等)!$*选取
!
年生人参的参根!
用发根农杆菌
B+
菌株感染参根片!成功获得了人
参发根且诱导率为
#),%!而郜玉钢等)!&*选用
%
年
生的人参根通过同样方法也诱导出了发状根!但未
报道诱导率据报道一些研究员)*用发根农杆菌
Z#$)%+
菌株处理带叶和不带叶的人参幼茎也能诱
导出发状根!诱导率为
),""
!),"!而用菌株
Z#&#"
(
5NB:#)
(
Z#"""
(
B+
(
Z#$)%+
处理人参根的
薄壁组织(子叶(真叶(无菌苗却没有获得发状根
在上述研究中!只有菌株
3T8T!++
(
Z#$)%+
和
B+
可转化人参发状根!且不同外植体诱导率高低依次
为$带叶幼茎
"
参根片
"
幼茎!说明不同发根农杆菌
对人参的不同部位敏感性不同!可能
3T8T!++
(
B+
和
Z#$)%+
分别对人参的根片和幼茎的较为敏
感发状根是在外植体的生理下端形成!所以参根
片的诱导率高于幼茎!而叶片内源性激素类物质的
运输也有助于发状根生成
8,:
!
西洋参
赵寿经等)!*和贾冬梅等)!)*用
B+
菌液以西洋参
的参根片(茎和叶作为外植体诱导发状根!只有参根
)!#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
9
!
发根农杆菌诱导五加科植物种类及诱导率
T=W>I#
!
4
L
IA.I/=0O.0OHAR.@0P=RI@MBP=>.=AI=I
L
>=0R.0OHAIOW
S
!3#-*.$
"
)/)0
五加科种类
4
L
IA.I/@MBP=>.=AI=I
外植体
;G
L
>=0R
菌种
4RP=.0
诱导率
C0OHAR.@0P=RI
参考文献
ZIMIPI0AI
人参
1&/&2
"
*/0)/
"
8,B,VI
S
参根片
6.0/I0
?
P@@R/>.AI/ 38T8!++ ( !+
参根片
6.0/I0
?
P@@R/>.AI/ B+ #),%\ !$
参根片
6.0/I0
?
P@@R/>.AI/ B+ ( !&
幼茎(带叶幼茎
7@H0
?
/RI!
S
@H0
?
/RII=QI/ Z#$)%+ ),"!
),"\ )
西洋参
13
4
+*/
4
+)
5
$6*+,
参根片
6.0/I0
?
P@@R/>.AI/ B+ ( !
参根片
6.0/I0
?
P@@R/>.AI/ B+ #$,:\ !)
叶(幼茎
5I=QI/
!
S
@H0
?
/RI叶(叶柄
5I=QI/
!
L
IR.@>I Z#$)%+ +,)!
%%,%\ %"
竹节参
13
D
&
:
$/*+0
地上幼茎
7@H0
?
/RIL
@0REI
?
P@H0O
改造的
8$)8#
V@O.M.A=R.@08$)8#
:","\ %#
龙牙
!
木
!#&6*&,&/80-#*&
叶柄(根切片
[IR.@>I
!
P@@R/>.AI/ Z#$)%+ #","!
&,\ %!
刺五加
76)+(-)#$$+00)/(*$0+0
叶片(叶柄(幼茎
5I=QI/
!
L
IR.@>I
!
S
@H0
?
/RI#&,"\ %%
片上长出白色发根!诱导率最大为
#$,:!谢海云
等)!:*用
Z#&"#
诱导叶片和幼茎!
#
块外植体上长出
了
#
条或几条的发状根王冲之等)%"*用
Z#$)%+
诱
导叶柄(叶片和子叶!发现子叶未诱导出发根!叶的
诱导率仅为
+,)!而叶柄诱导率最高达到了
%%,%我们分别用
B+
菌液和
6CV
菌液感染
!
年生的西洋参参根(西洋参无菌苗的子叶(下胚轴和
#,"<
?
%
5!
!
+*]
诱导的胚性愈伤组织!结果发现愈
伤组织的诱导率最高!子叶次之!参根的诱导率最
低!同时
B+
菌液诱导率比
6CV
菌液的要高"实验
结果 尚 未 发 表#上 述 研 究 表 明$
Z#&"#
(
B+
(
Z#$)%+
对西洋参不同外植体的诱导率高低依次为$
叶柄
"
参根片
"
叶!这可能是因为叶柄细胞再生能
力强!有明显的创伤反应!伤口附近的细胞较易脱分
化形成较多的感受态细胞和发根农杆菌对根细胞较
强的特异性以及根的创伤反应等因素造成的
8,8
!
其他种类
除人参和西洋参外!广大学者对五加科其他植
物种类发状根的诱导也有研究张来等)%#*用改造
的发根农杆菌
8$)8#
处理竹节参的地上茎部分!发
现伤口处长出发状根!其诱导率高达
:","
3=0
?
等)%!*用
Z#$)%+
菌诱导龙牙
"
木的根和叶柄!诱导
率分别为
!&,和
#","!而在无
Z#$)%+
感染的
根和叶柄中均未发现发根的形成罗丽等)%%*用
8$)8#
和
Z#&"#
接种刺五加均未诱导出发状根!但
用
Z#$)%+
却成功的诱导出发根!且诱导率为
#","!再以
Z#$)%+
菌株作为试验菌株!对刺五加
叶片(茎段(叶柄进行感染!发现叶片的诱导率最高
为
#&,"!其次是叶柄为
#!,"!茎段最低为
#","从以上研究可以看出$发根农杆菌
Z#$)%+
和
8$)8#
对五加科不同种类的外植体敏感性明显
不同!其大小为$竹节参
"
龙牙
"
木
"
刺五加!而与
人参和西洋参不同的是$刺五加的叶片(龙牙
"
木的
根和竹节参的地上茎都表现出了较高的诱导率!而
叶柄的诱导率并不太高!这可能与五加科植物的种
间差异性有关
+
!
影响发状根诱导的因素
近年来!人们开始关注发根农杆菌对五加科发
状根诱导率的研究!以获取优质品系和大量有用的
次生代谢产物众所周知!在诱导五加科发状根的
过程中!不同菌株及菌液浓度(外植体取材部位(处
理方式(预"共#培养时间(不同浓度的激素和乙酰丁
香酮以及不同光照条件等因素都影响发状根的诱导
率!故优化诱导条件对提高五加科诱导率至关重要
;,9
!
不同菌株及菌液浓度
目前!诱导五加科药用植物发状根的常用菌株
主要有
B+
(
Z#$)%+
(
8$)8#
(
Z#&"#
(
38T8!++
(
5NB:#)
和
Z#"""
等

种"表
!
#在已诱导出的五
加科植物发状根中!
%%使用的是
B+
菌株!
!使
用的是发根农杆菌
Z#$)%+
!
#+使用的
Z#&"#
!其
余菌株的使用均在
#"以内!众多学者的研究表
明$
B+
和
Z#$)%+
菌株对五加科发状根诱导率更
高!且稳定性更好!但张来等)%#*用改良的
8$)8#
菌
处理竹节参!发根诱导率高达
:"除了菌株种类
之外!其浓度也影响发状根的诱导率!大多学者以菌
液浓度
_]
&""
b",&
来转化外植体!罗丽等)%%*发现$
当
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蒋景龙!等$五加科植物发状根诱导研究进展
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和
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等浓度转
化外植体!其诱导率较高的报道)!$!%!*
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外植体预培养时间(共培养时间和感染时间
农杆菌感染外植体后!伤口处的细胞因为过敏
反应而导致褐化!严重影响发根的形成及转化率
将过夜培养的发根农杆菌加入新鲜的
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液体培
养基中!置于"
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化问题!并且能够改变外植体的转化率共培养时
间长短与转化频率相关!这是因为发根农杆菌的
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转移与整合需要一定的时间!共培养时间不
足!则不能完成
T*]DB
转移与整合!发状根的转化
不能实现!延长共培养时间能提高转化频率张来
等)%#*用
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菌液浸染竹节参地上幼嫩茎段时发
现!在
"
"
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$
"
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!均
能诱导出发状根!但在
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"
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正相关!而在
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"
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为最佳!诱导率为
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加的发状根诱导条件时!发现共培养时间处在
"
"
+
O
之间时!转化率随着共培养时间的延长而逐渐升
高!当共培养时间为
+O
时!转化率达到最高为
#+共培养时间超过
+O
后!转化率急剧下降
王冲之等)%"*用
Z#$)%+
菌诱导西洋参发根时!发现
%O
是最佳的共培养时间!而且发状根多分枝!且生
长十分旺盛而刘峻等)%+*采用共培养
%"O
也诱导
出了人参的发状根
;,8
!
外源植物激素(抗生素及乙酰丁香酮"
B/
#
在共培养阶段加入适量的外源植物激素对转化
有一定的影响萘乙酸"
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#(激动素"
3T
#和油
菜素类脂"
N5
#对发状根的生长有促进作用!王冲之
等)%"*用添加
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的
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培养基!未能诱导出发状根!而使用添加
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%
5
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的
V4
培养基进行农杆菌与外植体共培养!成
功地获得了发状根刘峻等)%+*发现在含
DBB
(
3T
的条件下!外植体的愈伤化程度最高!分裂态细胞最
多!转化率也最高!达到
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N5
单独使用时!在低浓度下即表现出促进生长的活性
N5
浓度为
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%
5
时!诱导发根效果显著!其
与不同浓度的吲哚丁酸"
CNB
#也表现出协同作用
乙酰丁香酮"
B4
#是一种酚类化合物!可诱发农杆菌
内
Z.
质粒
]DB
上
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区基因的活化和高效表达
罗丽等)%%*发现!
B/
能有效地提高刺五加发状根的
转化频率!当
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浓度处在
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率逐渐上升!当
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浓度达到
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%
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时!转化
率最大达到
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浓度的进一步加大!其转化率
呈急剧下降的趋势
;,;
!
其他
影响农杆菌转化的因素还有很多!例如培养基
的类型(
L
F
(培养温度和光照等对发根诱导和生长
王冲之等)%"*研究表明西洋参发状根在
41*#
和
N
$
培
养基生长状况较好!且发状根在
N
$
增长速度较
41*#
高孙彬贤等)%&*发现人参发状根以
V4
为培养基!
培养
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周后收获较为合适
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西
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北
!
植
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物
!
学
!
报
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卷
$!
发根农杆菌诱导五加科再生植株的
研究及展望
!!
迄今!广大学者对发根农杆菌诱导药用植物发
根的产生已进行了大量研究!但通过发根农杆菌诱
导五加科植物获得再生植株的报道较少
!"":
年!
王建华)%*以人参(西洋参发根为外植体通过体细胞
胚发生途径均获得了再生植株!并证实了他们的体
细胞胚途径经历了类似合子胚的过程!且在基因表
达上存在明显差异性
!"##
年!谢海云等)!:*通过发
根农杆菌诱导出西洋参的发状根!由间接器官发生
途径诱导出不定芽!最终获得了再生植株以发状
根为外植体通过体细胞胚或者器官发生途径获得五
加科再生植株目前还只是出于初级阶段
近年来!发根农杆菌介导五加科药用植物方面
研究取得了长足的进展!尤其是在人参(西洋参的发
状根诱导和次生代谢产物生产方面进行了大量研
究!但距离大规模工业化生产还有一定差距在今
后的研究中!以下几个方面应该得到更多的关注$
"
#
#发根农杆菌菌株的改进与发掘近年来!随着农
杆菌侵染植物细胞机制的研究不断取得突破!可以
设计新的方法和技术来控制
]DB
整合!发掘出适
合不同植物并提高遗传转化效率的遗传转化新工
具)%)*例如!已发现的超毒农杆菌菌株可以通过产
生并向寄主细胞输送某些蛋白而提高侵染力!这些
蛋白是易转化植物细胞因子的衍生物!为那些难转
化植物带来了曙光"
!
#发状根诱导条件方面研究
发根农杆菌诱导五加科植物的效率普遍不高!需要
改变诱导条件(诱导方式!建立高效的转化体系!最
大限度地提高发状根的诱导率同时不断筛选高
产(生长快速(耐剪切力的单克隆发状根无性系为大
规模工业化生产奠定基础"
%
#目前!药用植物发状
根前期诱导和培养的报道居多!进行培养工艺优化
方面的研究较少!严重地制约了大规模工业化生产
一些物理因素"如光强(温度#和化学因素"如培养
基(碳源(氮源(激素(前体(诱导子等#(生物反应器
的类型等均会对发状根的增殖和次生代谢物质的合
成产生影响因此!应该在发状根发酵培养技术优
化方面需要进行重点研究
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