全 文 ：·中药及天然药物·
四倍体菘蓝毛状根的培养及其抗内毒素成分分析
李博华1 ,张汉明1 ,范国荣2 ,尹茶1 ,丁如贤1 ,许铁峰1 ,乔传卓1(1.第二军医大学药学院 , 上海 200433;2.第二军医大学长海医
院临床药理基地)
摘要:目的　从菘蓝的同源四倍体植物诱导出毛状根并探讨用毛状根培养来大规模生产有用的药用植物次生代谢物的可能
性。方法　利用发根农杆菌 A4 菌株对四倍体菘蓝进行感染 , 采用高效毛细管电泳法同时测定诱导出的毛状根中具有抗内毒
素作用的五种有机酸[邻氨基苯甲酸 、水杨酸 、丁香酸 、苯甲酸 、3-(2-苯甲酸)-4(3H)-喹唑酮] 的含量。结果　A4 菌株从四倍体
菘蓝诱导出毛状根 ,且毛状根含有原植物中具有抗内毒素作用的五种有机酸。结论　发根农杆菌能诱导四倍体植物产生毛
状根 ,我们有可能利用毛状根培养来生产有价值的植物次生代谢物。
关键词:四倍体菘蓝;发根农杆菌;毛状根;抗内毒素作用;有机酸
中图分类号:S567　文献标识码:A　文章编号:1001-2494(2000)11-0728-04
Studies on culture of hairy roots of autotetraploid Isatis indigotoca and analysis of its antiendotoxic active compo-
nents
LI Bo-hua ,ZHANG Han-ming ,FAN Guo-rong ,YIN Cha , DING Ru-xian , XU Tie-feng ,QIAO Chuan-zhuo (Department of
Pharmacognosy , College of Pharmacy , Second Military Medical University , Shanghai 200433 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To induce the hairy roots autotetraploid Isatis indigotoca Fort.and discuss the probability to produce useful bo-
tanic secondary metabolites from hairy root culture on a large scale.METHODS　The cotyledon leaf explants of autotetraploid Isatis indigotoca
Fort.were infected by Agrobacterium rhizogenes strain A4 , and five antiendotoxic active organic acids [ Anthranilic acid , salicylic acid , syringic
acid , benzoic acid and 3-(2-carboxyphenyl)-4(3H)-quinazolinone] were determined simultaneously by high performance capillary elec-
trophoresis.RESULTS　The hairy roots of autotetraploid Isatis indigotica Fort.could be indced by Agrobacterium rhizogenes strain A4 and the
hairy roots contained same five antiendotoxic active components as that in the primary plant.CONCLUSION　Agrobacterium rhizogenes could
induce hairy roots from polyploid plants and the hairy roots might be utilized to produce valuable botanic secondary metabolites.
KEY　WORDS:autotetraploid Isatis indigotica Fort.;Agrobacterium rhizogenes;hair roots;antiendotoxic action;organic acid
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670878)
　　菘蓝(Isatis indigotica Frot.)是常用中药板蓝根 、
大青叶的主要来源 。板蓝根和大青叶都有清热解
毒 、凉血消斑的功效 ,在防病治病中用量极大 。用秋
水仙碱处理萌发的菘蓝种子或幼苗生长点 ,获得了
菘蓝同源四倍体植株 ,经数代选育 ,得到了性状稳
定 、繁殖力正常 、根与叶中活性成分均较大幅度提高
的生产性能优良的品系[ 1] ,经国家科委批准 ,已列为
国家科技成果重点推广项目 。Ri质粒是发根农杆
菌(Agrobacterium rhizogenes)菌体中的一个约 250 kb
的大质粒 。当发根农杆菌感染植物时 ,Ri质粒上的
T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中 ,其整
合和表达的结果导致了大量发状根(毛状根)的产
生[ 2] 。发状根能合成与自然根相似甚至更多的次生
代谢物。近年来已有许多关于二倍体植物的转化及
利用毛状根生产药物有效成分的报道[ 3 ～ 5] 。但关于
菘蓝和四倍体植物的毛状根培养 ,作者尚未见报道。
我们在建立四倍体菘蓝毛状根培养系统的基础上 ,
依据Wu等[ 6] 已从菘蓝药材中分离得到的具有抗内
毒素作用的 5种有机酸成分[水杨酸 ,苯甲酸 ,邻氨
基苯甲酸 ,丁香酸和 3-(2-苯甲酸)-4(3H)-喹唑酮
(下称喹唑酮酸)] ,应用高效毛细管电泳法(HPCE)
同时测定了四倍体菘蓝毛状根中这 5种有机酸的涵
量 ,以探讨利用毛状根培养来工业化生产有价值的
植物次生代谢物的可能性。
1　材料和方法
1.1　发状根的诱导
将四倍体菘蓝的子叶切成 0.5 cm×0.5 cm 的
小块 ,将它的下胚轴切成 1 cm 的小段 ,分别浸入已
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达对数生长期的发根农杆菌 A4菌液进行共培养 。
10 min后取出共培养的外植体 ,用无菌滤纸吸干菌
液 ,置于MS 固体培养基上培养 2 d ,然后取出用无
菌水冲洗 4次 ,置于含头孢噻肟钠 500 mg·L-1的 MS
固体培养基上 , 25℃,光照 12 h·d-1下培养 ,每隔 5 d
转接 1 次。待毛状根长出后 ,分离毛状根转移至含
500 mg·L-1头孢噻肟钠的MS 固体培养基上除菌 ,转
移4 ～ 5次直至无菌为止 。
四倍体菘蓝种子由本室乔传卓教授提供 。
1.2　毛状根离体培养和优良克隆选择
灭菌后的毛状根在不含激素的 MS 固体培养基
上培养。经观察 ,选择生长快 、分枝多的三个毛状根
株系于 MS液体培养基中培养。培养容积为 150 ml
三角瓶装 50 ml液体培养基 , 接种量为 0.25 g(鲜
重),在 25℃,黑暗 、100 r·min-1条件下振荡培养 ,两
星期后收获毛状根并测鲜重 , 60℃烘干后测干重 。
以平均 5瓶的鲜重 、干重作为评定毛状根生长状况
的指标。
1.3　毛状根生长曲线的制定
将筛选得到的优良毛状根株系 RV2 置于MS 液
体培养基中继续培养 ,培养条件和接种量按“1.1”项
中所述。每隔 4 d 收获一次毛状根并测其鲜重 、干
重(每 3瓶),24 d后得出毛状根的生长曲线。
1.4　冠瘿碱检测[ 7]
取毛状根 100 mg 置于 1 ml Eppendor 管 ,加入
0.1 mol·L-1 HCl 100 μl ,捣成匀浆 ,低温浸提 2 h ,
15000 r·min-1离心 5 min ,取上清液 10 μl有冠瘿碱
标准品分别点样于Whatman 3 mm 滤纸上进行高压
纸电泳(400 V , 30 mA), 电泳缓冲液为 HCOOH-
CH3COOH-H2O(5∶15∶80)。40 min后将滤纸取出晾
干后均匀浸入碱性硝酸银溶液中染色 ,1 min后取出
滤纸晾干 ,再浸入 20%NaOH 10ml+95%乙醇90 ml
混合液中显影 5 min 后取出 ,待滤纸晾干后再浸于
5%硫代硫酸钠溶液中退色 ,20 min后取出用流水冲
洗5 h后晾干 ,拍照。
1.5　化学成分分析
1.5.1　标准曲线的制备　精密称定对照品水杨酸 、
苯甲酸 、邻氨基苯甲酸 、丁香酸和喹唑酮酸及内标肉
桂酸适量 ,用甲醇溶解并定容至 10 ml量瓶中 ,作为
对照品储备液和内标储备液。各精密量取一定量的
对照品溶液 ,置于 10 ml量瓶中 ,加入 0.1 ml内标溶
液 ,以甲醇定容 ,重复进样 5次。
以对照品校正峰面积(峰面积与迁移时间比值
Ai Ti)同内标校正峰面积之比为纵坐标(Y),对照品
溶液的浓度为横坐标(X),计算回归方程及相关系
数 ,即水杨酸:Y =7.107 ×10-3 +1.486 ×10-2X , r
=0.9994 , 线性范围 1.319 ～ 42.20 μg·ml-1;苯甲
酸:Y =-2.097×10-2+2.232×10-2X , r =0.9991 ,
线性范围 1.55 ～ 36.80 μg·ml-1;邻氨基苯甲酸:Y
=+7.741×10-2+1.415×10-2 X , r =0.9992 , 线性
范围 6.713 ～ 214.8 μg·ml-1;丁香酸:Y =-2.21 ×
10
-2 +1.033×10-2 X , r =0.9971 ,线性范围1.373 ～
43.92μg·ml-1;喹唑酮酸:Y =6.324×10-3 +8.583
×10-3 X , r=0.9982 ,线性范围 1.153 ～ 36.90 μg·
ml
-1 。
1.5.2　样品分析　将二倍体板蓝根(产于河北安
国 ,经本室乔传卓教授鉴定为菘蓝的干燥根)、四倍
体板蓝根(经数代选育获得的菘蓝四倍体植物的干
燥根)及毛状根烘干后粉碎 ,过 60目筛 ,各称取 10 g
(毛状根 5 g),加 500 ml水煎煮 30 min ,过滤 ,重复 3
次 ,合并滤液 ,水浴浓缩至约 100 ml ,加乙醇至醇浓
度为 80%,冷藏 24 h 后过滤 ,滤液回收乙醇至无醇
味 ,残留物以蒸馏水定容至 10 ml ,用 1 mol·L-1的
HCl调 pH值为 1 ,石油醚萃取多次 ,弃去石油醚 ,再
以乙醚萃取多次 ,合并乙醚液 ,以无水 Na2SO4 脱水 ,
过滤 ,回收乙醚 ,残留物以甲醇溶解并定容至 2 ml
(毛状根为 1 ml)量瓶中 ,混匀。吸取其中 80 μl ,以
10000 r·min-1高速离心5 min后 ,置于毛细管电泳仪
中进样分析 。
收集毛状根在 MS液体培养基培养 2周后的液
体培养基100 ml ,加乙醇至醇浓度为 80%,冷藏24 h
后过滤 ,其余处理方法同上 。
1.5.3　加样回收率试验　精密量取 5种有机酸对
照品溶液 ,加入已知含量样品溶液中 ,按上法测定计
算样品的加样回收率。加样回收率试验结果为:水
杨酸 105.0%(n=5),RSD 1.55%;苯甲酸为 98.2%
(n=5), RSD 2.90%;邻氨基苯甲酸为 102.2%(n=
5), RSD 1.69%;丁香酸为 98.4%(n =5), RSD
0.98%;喹唑酮酸为103.9%(n=5),RSD 1.33%。
2　结　果
2.1　毛状根的诱导
发根农杆菌A4感染四倍体菘蓝的子叶或下胚
轴 10 ～ 20 d 后 ,均在外植体伤口处出根 ,其中多数
根具有典型毛状根的特征 ,富有白色根毛 、分枝多且
根尖向上生长 ,部分对照外植体(无农杆菌感染)也
能在切口处出根 ,但出根率低 ,根毛少 ,根尖向下生
长 。A4菌株对四倍体菘蓝的子叶细胞有很高的转
化率(68%), 而对下胚轴的诱导率却较低 , 仅为
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15.38%。见表 1。
表 1　不同外植体的诱导率比较
外植体 外植体数 出根外植体数 诱导率 %
子叶 25 17 68.00
下胚轴 26 4 15.38
2.2　毛状根的分离 、培养和优良克隆选择
由于一条毛状根起源于一个细胞 ,所以我们把
外植体上的每条毛状根逐一分开 ,作为单个克隆进
行培养 。毛状根在无激素的 MS固体培养基上继续
快速生长并分枝 。MS液体培养结果表明 ,不同毛状
根株系具有不同生长速度 ,见表 2。选出生长最快
的 RV2 株系(生物量在两星期内增加 35倍)作为以
后实验用 。
表 2　不同株系毛状根生长量比较.n =5 , x±s
毛根株系 每瓶鲜重 g 每瓶干重 g
RV1 7.85±1.05 0.429±0.058
RV2 9.14±0.77 0.470±0.036
RV3 6.30±1.07 0.335±0.063
2.3　毛状根的生长曲线
在液体培养基中的毛状根呈现出正常离体器官
的生长模式。一开始毛状根的生物量随时间而迅速
增加 ,约 16 d时产量达最高(鲜重 9.57 g ,干重 0.52
g),16 d后毛状根的生物量随时间而逐渐减少 ,并且
有少量愈伤组织产生 。见表 3。
2.4　冠瘿碱检测
通过高压纸电泳 ,从菘蓝同源四倍体的毛状根
中检测到了原植物中没有的甘露碱 ,这表明发根农
杆菌的 RiT-DNA 部分已凯转化到植物细胞的基因
组中。
表 3　毛状根的生长情况.n=5 , x±s
天数 鲜重 g 干重 g 天数 鲜重 g 干重 g
4 0.89±0.11 0.014±0.007 16 9.57±0.77 0.524±0.045
8 3.17±0.61 0.027±0.179 20 8.88±0.82 0.492±0.030
12 5.29±0.79 0.294±0.036 24 6.33±0.66 0.329±0.038
2.5　化学成分分析
毛状根中 5种有机酸都有一定的含量 ,其中喹
唑酮酸的含量高于自然根 ,而且发状根还向培养基
中分泌一定量的有机酸 。毛细管电泳图谱见图 1 ,
样品测定结果见表 4。
图 1　标准品(A)和样品(B)电泳图谱
1-肉桂酸(内标);2-喹唑酮酸;3-水杨酸;4-苯甲酸;5-邻氨基苯甲酸;6
-丁香酸
表 4　5种有机酸含量测定.μg·g -1 , n =3 , x±s
样　品 喹唑酮酸　 水杨酸　　 苯甲酸　　 邻氨基苯甲酸 丁香酸　　
板蓝根(2 n) 1.595±0.009 7.723±0.070 6.766±0.057 6.040±0.039 2.364±0.012
板蓝根(4 n) 2.106±0.014 7.800±0.012 8.000±0.025 18.148±0.012 7.930±0.018
毛状根 5.193±0.069 2.011±0.016 1.502±0.024 1.492±0.011 1.402±0.017
培养基 μg·100ml-1 9.46±0.069 1.425±0.019 0.946±0.033 1.880±0.018 3.444±0.026
3　讨　论
由于农杆菌转化植物细胞时 Ri 质粒上的 T-
DNA片段的整合是随机的[ 8] ,因此不同毛状根株系
的生长速度也存在差异 ,我们应尽可能选择其中生
长快的株系进行培养 。
利用植物细胞培养方法生产有用的活性物质 ,
虽然已有紫草的细胞培养作为生产紫红色化妆品原
料的例子 ,但至今仍然是唯一进入商品生产行列的
例子。这主要是因为培养物的速度还不够快 ,以及
合成的产物尚不稳定 。毛状根培养物无需加入任何
外源激素 ,生长快速且合成次生代谢物稳定 ,比细胞
培养有更大的优越性 。毛状根还能合成细胞培养物
所不能合成的一些次生代谢物 ,如长春花的毛状根
中含有长春花细胞培养物中不能得到的长春碱
等[ 9] 。更为重要的是 ,发状根的染色体数目与亲体
植株保持一致 , 且不易受体细胞无性系变异的影
响[ 10] ,因而其次生产物的合成能力非常稳定 ,这就
有利于次生代谢物的大规模生产 。
本研究采用HPCE对四倍体菘蓝毛状根中 5种
有机酸进行了含量测定 ,分离度较好 ,保留时间短 ,
重现性好。
本实验中我们对四倍体菘蓝的毛状根的 5种抗
内毒素活性成分进行了测定 ,发现这 5种有机酸在
毛状根中都有一定的含量。同时我们发现在悬浮培
养的过程中 ,毛状根还将这 5种有机酸分泌到液体
培养基中 。这与 Hamill等[ 11] 和 Parr 等[ 12] 发现烟草
毛状根向培养基分泌生物碱的现象相似。这一性质
有利于次生代谢物的分离提取 ,为工业化生产提供
了方便 。
参考文献
·730· Chin Pharm J , 2000 November , Vol.35 No.11　　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2000年 11月第 35卷第 11期
[ 1] 乔传卓 ,吴美枢 ,戴富宝 ,等.菘蓝多倍体育种的研究[ J] .植物
学报 , 1989 , 31(9):678.
[ 2] White FF , Taylor BH , Huffman GA , et al.Molecular and genetic anal-
ysis of the transferred DNA regions of the root-inducing plasmid of
Agrobacterium rhizogenes[ J] .J Bacteriol , 1985 , 164(1):33.
[ 3] 常振战 ,果德安 ,沈昕 ,等.掌叶大黄毛状根培养及培养物中蒽
醌类成分分析[ J] .药学学报 , 1998 , 33(11):869.
[ 4] Zhou Y , Hirotani M , Yoshikawa T , et al.Flavonoids and phenyle-
thanoids from hairy root cultures of Scutellaria baicalensis[ J] .Phyto-
chemistry , 1997 , 44(1):83-87.
[ 5] Jung KH , Kwak SS , Choi C , et al.An interchangeable system of hairy
root and cell suspension culture of Catharathus roseus for indole alka-
loid production[ J] .Plant Cel l Rep , 1995 , 15(1 2):51.
[ 6] Wu XY ,Liu YH ,Sheng WY , et al.Chemical constituents of Isatis in-
digotica[ J] .Planta Med , 1996 , 63:55.
[ 7] Morgan AJ ,Cox PN , Turner DA , et al.Transformation of tomato using
an Ri plasmid vector[ J] .Plant Science , 1987 , 49:37.
[ 8] 张毅 ,沈文辉.植物基因工程的新载体一农杆菌 Ri质粒.生物
工程学报[ J] .1989 ,5(2):173.
[ 9] Parr AJ , Peerless ACJ , Hamill JD , et al.Alkaloid production by trans-
formed root cultrues of Lithospermum rosueus[ J] .Plant Cel l Rep ,
1988 , 7(5):309.
[ 10] Aird ELH.A study of the relationship between organizations genetic
stability , and secondary metabolite production of plant cell and organ
cultrue[ J] .FromDiss Abstr Int B ,1990 , 50(10):431.
[ 11] Hami ll JD , Ahuja PS , Davey MS , et al.Protoplast-derived st reptomy-
eiu resistant plants of the forage Onobryehis veciifolia Scop(Sainforn)
[ J] .Plant Cell Rep , 1986 , 5:11.
[ 12] Parr AJ , Hamill JD.Relationship between Agrobacterium Rhizogenes
transformed hairy roots and intact , uninfected Nicotiana plants[ J] .
Phytochemistry ,1987 , 26:3241.
(收稿日期:2000-04-19)
草乌多糖的分离纯化和组成性质研究
孙玉军1 ,陈彦2 ,吴佳静2 ,汪邦顺2 ,郭志荣2(1.安徽技术师范学院基础部 ,安徽 凤阳 233100;2.安徽大学生命科学学院, 安徽合肥
230039)
摘要:目的　从草乌中分离草乌多糖 , 并研究其组成性质。方法　采用 DEAE 纤维素(DEAE-52)柱层析和凝胶柱层析分离纯化
草乌多糖 ,气相色谱法和薄层层析法测定其多糖组成 , 凝胶过滤法测定其相对分子质量 , 红外光谱测定其苷键类型 , 比色法测
定其糖含量。结果　分离得到的草乌多糖(Aconitum kusnezoffii Reichb., AK)含有鼠李糖 、木糖 、甘露糖 、葡萄糖 、半乳糖 、阿拉伯
糖 ,它们的摩尔比为 1∶1.7∶203∶1.7∶59.7∶3.5。其糖含量 88%。AK的平均相对分子质量为 2.8×104 。它的红外光谱中有典
型的多糖吸收峰 ,并具有 α-型糖苷键 , 紫外扫描无核酸和蛋白特征吸收峰。结论　AK首次从草乌块根中提取获得 , 为草乌多
糖的主要成分。
关键词:草乌;多糖;分离;纯化;组成
中图分类号:R284.2　文献标识码:A　文章编号:1001-2494(2000)11-0731-03
Studies on the isolation ,purification and composition of Aconitum kusnezoffii polysaccharide
SUN Yu-jun ,CHEN Yan ,WU Jia-jing ,WANG Bang-shun ,GUO Zhi-rong(Anhui Technical Teachers College , Fengyang 233100 ,
China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To study the isolation and composition of Aconitum kusnezoffii Reichb.polysaccharkide(AK).METHODS　AK
was purified by DEAE ion-exchange cellulose(DEAE-52)and sepharose Cl-4B.The component of the saccharide was determined by GC and
TLC.Its MW was measured by gel filtration.The form of glucosidic bond was detrermined by IR.The content of the saccharide was measured by
colorimetry.RESULTS　Rhamnose , xylose ,mannose , glucose , galactose and arabinose were included in AK with the molar ratio of 1∶1.7∶203
∶1.7∶59.7∶3.5.Its average MW was estimated t be 2.8×104.The content of saccharide was 88%.Typical absorption of polysaccharide was
shown in its IR spectrum.It contained α-glucosidic bonds by IR analysis.It had no typical absorption of nucleic acid or protein by UV scan-
ning.CONCLUSION　AK is first isolated from the root of Aconitum kusnezoffii Reichb..
KEY　WORDS:Aconitum kusnezoffii;polysaccharide;isolation;purification;composition
基金项目:安徽省自然科学基金资助项目(97422002)
　　草乌(Aconitum kusnezoffii Reichb.)块根是我国
传统的中药材 ,具有祛风湿 ,温经止痛等功能 。还具
有抗肿瘤活性[ 1] 。它含有乌头碱等多种生物碱[ 2] ,
但对其生物大分子活性物质多糖的分离纯化及其组
成性质的研究尚未见报道 ,我们对此进行了这方面
的研究工作 。
1　仪器 、材料和试剂
1.1　仪器
·731·中国药学杂志 2000年 11月第 35卷第 11期　　　　　　　　　　　　　 Chin Pharm J ,2000 November , Vol.35 No.11