全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(4): 374-380(2012)
收稿日期: 2011-07-30; 修回日期: 2012-04-15
基金项目: 浙江省自然科学基金项目(Y3080081); 台州市科技计划项目(08XH02)
通讯作者: 蒋 明, 博士, 副教授, 主要研究方向为植物发育生物学及其分子调控; E-mail: jiangming1973@139. com。
青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因
BoAPX2 的克隆与表达分析
蒋 明1*, 张志仙2, 袁菱婧1
( 1台州学院生命科学学院, 临海 317000; 2台州市农业科学研究院, 临海 317000)
摘要:抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是 H2O2 清除剂,在植物抗逆反应中起着重要作用。 根据 NCBI 发
布的过氧化物体抗坏血酸过氧化物酶(Peroxisomal APX, pAPX)基因序列设计简并引物,分别以青花菜(Brassica oleracea
var. italica)叶片 DNA和 cDNA为材料进行 PCR扩增,克隆到一个 APX基因,命名为 BoAPX2,序列提交 GenBank,登录号
为 JN172929。 BoAPX2 的基因组序列长为 2 013 bp,具有 8 个内含子,编码区全长 864 bp,编码 287 个氨基酸。 序列分析结
果表明,BoAPX2 与已知的过氧化物体 APX 有较高的相似性,氨基酸的 C 端具 1 个跨膜结构域。 RT-PCR 结果表明,
BoAPX2 的表达受霜霉病菌(Hyaloperonospora parasitica)、H2O2、水杨酸和 NaCl诱导。
关键词:青花菜; 霜霉病; 抗坏血酸过氧化物酶; 克隆; 表达
Cloning and expression analysis of an ascorbate peroxidase gene BoAPX2 from
Brassica oleracea var. italica　 JIANG Ming1, ZHANG Zhi-xian2, YUAN Ling-jing1 　 (1 College of Life
Science, Taizhou University, Linhai 317000, China; 2 Taizhou Academy of Agricultural Research, Linhai 317000, China)
Abstract: Ascorbate peroxidase (APX), a scavenger of hydrogen peroxide, plays an important role in plant
stress resistance. Degenerate primers were designed according to peroxisomal APX sequences published in NC-
BI. APX gene, designated BoAPX2, was isolated from DNA and cDNA of leaves of Brassica oleracea var.
italica, respectively. Gene sequence was submitted to GenBank with an accession number of JN172929. The
full length genomic DNA of BoAPX2 was 2 013 bp in length with 8 introns, and the complete coding sequence
was 864 bp in length encoding 287 amino acids. Sequence analysis results indicated that BoAPX2 shared high
homology to known peroxisomal APXs and was possessed of a transmembrance domain at its C-terminal. RT-
PCR results showed that the expression of BoAPX2 was induced by Hyaloperonospora parasitica, H2O2, sali-
cylic acid and NaCl.
Key words: Brassica oleracea var. italica; downy mildew; ascorbate peroxidase; cloning; expression
中图分类号: Q78　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)04-0374-07
　 　 青花菜(Brassica oleracea var. italica)为十字
花科(Cruciferae)芸薹属作物,以绿色的花蕾群为
主要食用部位。 花球中除了丰富的维生素、矿物质
外,还含有萝卜硫素(Sulforaphane)、3-甲磺酰基丙
基异硫代氰酸酯( Iberin)和三芥子酸甘油酯(Eru-
cin)等抗癌成分,成为一种深受人们喜爱的保健蔬
菜[1]。 植物在生长过程中,受多种生物和非生物
因素的胁迫,如病原菌、极端温度、高盐和干旱等,
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过
氧化氢酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶
(Glutathione peroxidase, GPX)和抗坏血酸过氧化
物酶等防御酶在逆境反应中起着十分重要的作用,
　
　 4 期 　 　 蒋 明,等:青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因 BoAPX2 的克隆与表达分析
能有效清除自由基和过氧化物[2]。 利用基因工程
技术改良植物,提高逆境胁迫耐(抗)性已成为育
种的新途径[3]。 APX是植物体内一类重要的防御
酶,它们以抗坏血酸为电子供体,将累积的 H2O2
还原成 H2O和 O2,以减轻对细胞器的毒害[4,5]。
APX基因在高等植物中以基因家族的形式存
在,定位于细胞质、叶绿体的类囊体与基质、微体和
过氧化物体等部位,分别称作细胞质 APX(cytosol-
ic APX, cAPX) 基因、类囊体 APX ( thylakoidal
APX, tAPX) 基因、基质 APX ( stromatic APX,
sAPX)基因、微体 APX(microbody APX, mAPX)
基因和过 氧 化 物 体 APX ( peroxisomal APX,
pAPX)基因等[6 ~ 8]。 pAPX 是存在于过氧化物体
的跨膜蛋白,其 N端活性区域位于细胞质,用于分
解从过氧化物体逃逸和由细胞质生成的 H2O2 [9]。
近年来,已从拟南芥 (Arabidopis thaliana)、大麦
(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、大豆(Gly-
cine max)、南瓜(Cucurbita moschata)、豇豆(Vigna
unguiculata)、 小麦 ( Triticum aestivum ) 和白杨
(Populus tomentosa)等植物中克隆到了 pAPX 基
因[10 ~ 17]。 APX基因的克隆,对揭示作物抗逆机理
和开展抗逆分子育种有着十分重要的意义。 前期
实验室从青花菜中克隆到一个 cAPX 基因(登录
号:HQ871864),本研究根据 NCBI 发布的 pAPX
基因序列设计 PCR 简并引物,从青花菜中克隆一
个 pAPX基因,并进行表达分析,为转基因抗病研
究提供参考。
1　 材料与方法
1. 1　 植物材料
本试验采用的青花菜品种为‘绿雄 90’,在二
叶一心期进行各种处理。 处理 1:喷雾方式接种霜
霉病菌[18];处理 2:叶面喷施 1 mmol / L 水杨酸溶
液;处理 3:叶面喷施 1 mmol / L H2O2 溶液,对照均
喷等量无菌水;处理 4:幼苗栽植于含 150 mmol / L
NaCl 的 Hoagland 培养液,对照不含 NaCl。 培养
24 h后,采集处理和对照植株的叶片,置于 - 70℃
的低温冰箱中备用。
1. 2　 DNA、RNA提取和 cDNA合成
基因组 DNA 的提取采用 SDS 法;RNA 提取
用 TRIzol法;cDNA的合成采用 TaKaRa 公司的试
剂盒,第一链和第二链的合成根据说明书进行。
1. 3　 基因克隆
根据 NCBI 数据库发布的 pAPX 序列,设计
PCR简并引物,分别为 APXP1:5′-ATGGC(G / T)
GCACCGATTG-3′ 和 APXP2: 5′-TTACTTCATC
(T / C) TCTT(T / C) CGGATCTC-3′。 以 35 ng 叶
片 DNA和 cDNA为模板进行 PCR扩增,反应总体
积为 20 μL,含 1 × PCR buffer,1. 5 U 的 Taq 酶
(北京鼎国),0. 2 μmol / L 的 dNTPs(上海生工),
各 0. 2 μmol / L上、下游引物(上海生工)。 PCR扩
增程序为: 95℃ 预变性 5 min; 95℃ 变性 40 s,
57． 3℃退火 60 s,72℃延伸 120 s,32 个循环;72℃
延伸 10 min。 PCR产物经电泳、割胶后回收,回收
试剂盒购自碧云天生物技术研究所,操作按其提供
的说明书进行。 取 3 μL PCR回收产物,克隆到 p-
GEM T-easy 载体(Promega),4℃冰箱连接 12 h,
将连接产物转入 DH5α 大肠杆菌感受态细胞(北
京鼎国),经涂布、蓝白斑筛选和菌液 PCR验证后,
各取 4 个阳性克隆测序。
1. 4　 基因表达分析
根据 1. 3 的测序结果,设计一对 RT-PCR引物
用于表达分析。 引物序列分别为 APXP3:5′-GCT-
GGAACCTATGATGCG-3′ 和 APXP4: 5′-GCT-
CAACATAGCGACGAA-3′,条带预期大小为 535
bp。 以各对照和处理叶片 cDNA为模板,采用 1. 3
中的反应体系和模板浓度。 PCR 扩增程序为:
95℃预变性 5 min;95℃变性 30 s,53. 6℃退火 45
s,72℃延伸 60 s,32 个循环;72℃延伸 10 min。
PCR产物在 1. 2% 琼脂糖凝胶上电泳检测,RT-
PCR重复 3 次。
1. 5　 进化分析
为研究 BoAPX2 的进化地位,从 NCBI 数据库
下载 了 豇 豆 ( Vigna unguiculata ) ( 登 录 号:
AAS46016 )、 盐 角 草 ( Salicornia brachiata )
( ACI15209 )、 海 榄 雌 ( Avicennia marina )
( ABS70719 )、 小 麦 ( Triticum aestivum )
(ABQ53157)、大豆(Glycine max) (BAG09367)、
拟南芥(Arabidopsis thaliana) (NP_195226)、油棕
573
　
植物病理学报 42 卷
(Elaeis guineensis)(ACF06512)、玉米(Zea mays)
(ACG32617)和大麦 (Hordeum vulgare ssp. vul-
gare)(BAB62533)等 9 种植物的 pAPX 氨基酸序
列。 用 Clustalx 1. 81 进行序列比对,再用 Mega
3． 1 构建进化树,构建方法为邻接法 (Neighbor-
joining),经 1 000 次自举检验。
2　 结果与分析
2. 1　 BoAPX2 的克隆与序列分析
以 APXP1 / APXP2 为引物对,分别从青花菜叶
片基因组 DNA 和 cDNA 中克隆到了与预期大小
一致的条带。 测序结果表明,该基因的 DNA 全长
为 2 013 bp,具有 8 个内含子,长度分别为 69、77、
539、90、67、80、78 和 49 bp,内含子均遵循 GT-AG
规则;编码区全长为 864 bp,编码 287 个氨基酸。
序列比对结果表明,该基因与已知 pAPX 有很高的
相似性,与其他类型的 APX 则相差很大,氨基酸 C
端有一个跨膜结构域,序列为 TVLAQGAFGVA-
IAAAVVALSY(图 1)。 基因定名为 BoAPX2,序列
已提交 NCBI,登录号为 JN172929。
2. 2　 BoAPX2 的进化分析
为研究 BoAPX2 的进化地位,从 NCBI 数据
库下载了 9 个物种的 pAPX 氨基酸序列,用 Clus-
talx 1. 81 进行序列比对(图 2),再用Mega 3. 1 软
件构建进化树(图 3)。 结果表明,10 条蛋白质序
列含 286-291 个氨基酸残基,序列之间的差异较
小,仅存在个别氨基酸残基的差别,说明 pAPX在
进化上十分保守。 BoAPX2 与拟南芥 pAPX 之间
的遗传距离最小,仅 0. 0925,在进化树上聚为一
组;与油棕、玉米、大麦和小麦的亲缘关系最远,
而这 4 种单子叶植物处于同一进化支;豆科植物
豇豆和大豆的遗传距离为 0. 0733,与遗传距离稍
远的盐角草和海榄雌聚为一组。
Fig. 1　 Complete coding sequence and deduced amino acid sequence of
BoAPX2 from Brassica oleracea var. italica
Underlined sequence indicates the transmembrane domain.
673
　
　 4 期 　 　 蒋 明,等:青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因 BoAPX2 的克隆与表达分析
Fig. 2　 Alignment of amino acid sequences of pAPX from 10 plant species
Fig. 3　 Phylogenetic tree of amino acid sequences of peroxisomal ascorbate
peroxidase in 10 plant species using NJ method
773
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 4　 Expression patterns of BoAPX2
- SA, - HP, - NC and - HO: CK; + SA: 1 mmol / L Salicylic; + HP: Challenged with Hyaloperonospora parasitica;
+ NC: 100 mmol / L NaCl; + HO: 1 mmol / L H2O2; B: Internal control of actin.
2. 3　 BoAPX2 的表达分析
以 APXP3 / APXP4 为 引 物 对, 各 对 照、 1
mmol / L水杨酸、霜霉病菌、100 mmol / L NaCl 和 1
mmol / L H2O2 处理的叶片 cDNA为模板进行 PCR
扩增,结果表明,BoAPX2 在各对照中均有表达,但
表达量较小;水杨酸、霜霉病菌和 H2O2 处理叶片
的表达量均有明显增加,NaCl 处理叶片的表达量
虽然有所增加,但增幅较其他处理小(图 4)。 结果
表明 BoAPX2 在叶片中有持续表达的特点,而且其
表达受水杨酸、NaCl、霜霉病菌和 H2O2 的诱导,暗
示该基因与霜霉病抗性、盐胁迫等逆境相关。
3　 讨论
自首次从豌豆(Pisum sativum)中克隆到 APX
基因以来,已从多种高等植物分离到不同类型的
APX,近年来还从低等植物藻类中克隆到了 APX
基因[19, 20]。 pAPX 是一种位于过氧化物体上的
APX,用于清除过氧化物体内外的 H2O2 [9]。 NCBI
数据库中可检索到 10 余条 pAPX 序列,这些物种
包括豇豆、盐角草、海榄雌、小麦、大豆和拟南芥等。
在拟南芥中,pAPX 的表达受低温、紫外线、H2O2
和百草枯等的诱导[21];在白粉病菌(Erysiphe gra-
minis f. sp. tritici)侵染下,小麦 pAPX的表达量增
加[22];红树植物海榄雌 pAPX 的表达受盐胁迫、高
光和 H2O2 的诱导[23];大麦 pAPX 在热激、盐胁迫
和脱落酸处理下大量表达[12]。 过量表达 pAPX 可
提高植物的抗逆性,将大麦 pAPX 导入拟南芥,在
盐胁迫下,转基因植株 APX 的活性显著增加,
H2O2 和脂质过氧化物的积累量低于对照,增加了
耐热性[24],将其导入水稻,转基因植株的根系伸长
量、生物量、叶绿素含量以及 APX活性都显著高于
野生型植株,对镉的耐性增加[25];过量表达白杨
pAPX基因,烟草的抗旱和耐盐能力显著增加[26]。
H2O2 是植物的一种重要信号分子,在调控系
统获得抗性( systematic acquired resistance,SAR)、
细胞衰老与程序性细胞死亡(PCD)、气孔开闭和
细胞壁发育等生理生化过程起着重要作用[27];在
抗病反应中,H2O2 是 SAR 的第二信使[27 ~ 29]。 水
杨酸作为植物抗病防卫反应中的内源信号分子,在
诱导过敏反应(hypersensitive response,HR)和产生
SAR方面起着重要作用[30]。 本研究中,青花菜
BoAPX2 的表达受到水杨酸、H2O2 和霜霉病菌的
诱导,表达量较对照植株高,暗示该基因与霜霉病
抗性相关;另外,BoAPX2 的表达受 NaCl 诱导,表
明该基因可能与盐胁迫有关。 不同类型 APX在组
成、结构、底物特异性和亲和能力等方面存在一定
差异,而同类 APX之间的相似性较高[31]。 本研究
从青花菜中克隆到了一个 pAPX 基因(登录号:
JN172929),该基因序列与已知过氧化物体 APX 存
在较高的同源性,而与其他类型 APX 的差异较大。
pAPX为跨膜蛋白,推导的 BoAPX2 蛋白 C端具有
一个跨膜结构域 TVLAQGAFGVAIAAAVVALSY。
BoAPX2 基因的克隆和表达分析,为进一步开展功
能验证和青花菜抗逆分子育种奠定了基础。
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