全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 214-218(2012)
收稿日期: 2009-08-05; 修回日期: 2011-10-01
基金项目: 国家自然科学基金项目(30271082,30571496); 高等学校博士学科点专项科研基金项目(20050466003 ); 中国博士后基金项
目(20070410874)
通讯作者: 范国强,教授,主要从事泡桐丰产栽培理论与生物技术研究; Tel: 0371-63558605, E-mail: gqfan@henau. edu. cn。
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췍研究简报
甲基磺酸甲酯处理毛泡桐丛枝病幼苗的
形态变化及 SSR分析
曹喜兵, 范国强*, 翟晓巧
(河南农业大学泡桐研究所, 郑州 450002)
Morphological changes of the witches’ broom seedlings of Paulownia tomentosa
treated with methyl methanesulphonate and SSR analysis 　 CAO Xi-bing, FAN Guo-
qiang, ZHAI Xiao-qiao　 ( Institute of Paulownia, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)
Abstract: Witches’ broom is one of the most serious diseases in Paulownia production. Morphological chan-
ges of the witches’ broom seedlings of Paulownia tomentosa treated with methyl methanesulphonate and SSR
analysis were investigated in order to further study the relation between the disease and DNA changes. The re-
sults indicated that the diseased seedlings treated with optimal concentration of MMS might turn into the ones
without symptom morphologically, but there still existed the phytoplasma in the seedlings treated with 20
mg·L -1 MMS. Not only might MMS of which the concentrations were more than 80 mg·L -1 eliminates the
phytoplasma from the seedlings, but also inhibits the seedling growth. DNA base sequences of the healthy, di-
seased and the diseased-treated with 20 and 100 mg·L -1 MMS seedlings were the same at SSR level.
Key words: Paulownia tomentosa; witches’ broom; phytoplasma; methyl methanesulphonate(MMS); SSR
文章编号: 0412-0914(2012)02-0214-05
　 　 在真核生物中,DNA 甲基化可导致基因特异
表达、细胞分化和染色体失活等[1,2],可在不改变
DNA碱基排列顺序的同时,阻断遗传信息的传递,
从而引起形态等性状的变化[2]。 泡桐(Paulownia
spp. )是我国重要的速生用材和绿化树种之一,对
改善我国生态环境和提高农民收入具有重要的意
义,但丛枝病发生给我国泡桐生产造成了巨大的经
济损失,也严重影响了人们种植泡桐的积极性。 自
从发现泡桐丛枝病病原为植原体以来,人们对其病
原和丛枝病发生的生理生化变化进行了大量的研
究[3,4],但对寄主-染病泡桐本身分子生物学研究较
少。 近年来,虽然科技工作者对丛枝病泡桐蛋白质
组和 DNA甲基化水平开展了一些研究工作[4],但
至今国内外未见有关 DNA 甲基剂对泡桐丛枝病
发生影响的文献报道。 因此,本文以毛泡桐丛枝病
组培苗为材料,利用巢式 PCR和 SSR技术,研究了
DNA甲基剂-甲基磺酸甲酯(MMS)对毛泡桐丛枝
病发生和 DNA碱基序列的影响。
1　 材料与方法
1. 1　 材料及处理
将河南农业大学泡桐研究所林木生物技术实
验室培养 30 d 的毛泡桐(Paulownia tomentosa)丛
枝病组培苗从基部剪断,分别转入含有不同浓度
　
　 2 期 　 　 曹喜兵,等:甲基磺酸甲酯处理毛泡桐丛枝病幼苗的形态变化及 SSR分析
MMS(分别为 0、20、40、60、80、100和 120 mg·L -1)
的 1 / 2 MS培养基(蔗糖浓度 25 g·L -1, 琼脂 8 g
·L -1)中,每个装有 40 mL培养基的 100 mL三角
瓶中转入 3 个外植体,每处理 20 瓶。 先在温度为
20℃的黑暗条件下处理 5 d,然后再置于温度(25
±2)℃、光强 130 μmol·m -2·s -1以及光照时间
16 h·d -1条件下培养。 以健康苗为对照,试验重
复 3 次。
1. 2　 试验方法
1. 2. 1　 MMS 处理幼苗形态变化 　 在 MMS 处理
10、20 和 30 d 时,分别观察统计幼芽生根率(生根
幼芽数 / 60 × 100% ),按 Fan 等方法[3]观察记录培
养 30 d幼苗形态情况。
1. 2. 2　 MMS处理幼苗植原体检测　 提取上述培
养 30 d 幼苗 DNA,巢式 PCR 扩增参照 Fan 等方
法[3]。
1. 2. 3　 SSR扩增及电泳分析　 参照 Cao等方法[5]。
2　 结果与分析
2. 1　 MMS处理毛泡桐丛枝病幼苗的形态变化
由MMS处理毛泡桐丛枝病幼苗形态变化结
果(图 1,表 1)可以看出,丛枝病幼苗形态变化与
MMS浓度密切相关。 随着 MMS 浓度的升高,丛
枝病幼苗形态上转变为健康幼苗(图 1-B ~ G)。
但是,当 MMS浓度等于或大于 80 mg·L -1时, 处
理幼苗生长明显受到抑制(图 1-E ~ G)。 在幼芽
生根方面,相同 MMS 浓度下,随着培养时间的延
长,幼芽生根率逐渐升高,但不同 MMS 浓度间存
在着明显差异。 相同培养时间内,随着 MMS 浓度
增大,幼芽生根率变化趋势不同。 培养 10 d 时,随
着 MMS浓度的的增大,幼芽生根率逐渐降低。 培
养 20 和 30 d时,除 MMS浓度分别等于或小于 40
和 60 mg·L -1处理幼芽生根率皆可达到 100%外,
其余幼芽的生根率则随 MMS浓度增大逐渐降低。
当 MMS浓度为 120 mg·L -1时,培养 30 d的幼芽
生根率只有 30. 0% 。 此外,随MMS浓度的升高,
幼芽生第一条根的时间也逐渐延迟。 也就是说,
高浓度 MMS 抑制了毛泡桐丛枝病幼芽根诱导,
从而在一定程度上导致高浓度 MMS处理幼苗生
长量的下降。 在本试验浓度范围内,MMS 对丛
枝病幼苗腋芽生长和顶芽膨大都有明显的抑制
作用,并且,随着 MMS 浓度的增大,处理幼苗的
叶色由淡黄变为淡绿色和绿色,并披刚毛,叶片
由小变大再变小,节间距由短变为正常再变短。
这说明,适宜浓度的 MMS 可使毛泡桐丛枝病幼
苗转变为健康幼苗,但浓度过高则能抑制幼苗生
长。 该现象的产生可能与过高浓度 MMS 使毛泡
桐 DNA发生超甲基化,关闭幼苗生长相关基因
有关。
Fig. 1　 Morphological changes of the Paulownia tomentosa seedlings
treated with different concentrations of MMS
A. Diseased seedlings; B-G: Diseased seedlings treated with MMS at concentrations of
20, 40, 60, 80, 100 and 120 mg·L -1, respectively; H. Healthy seedlings.
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Table 1　 Effects of MMS on the morphological changes of the Paulownia tomentosa seedlings with witches’ broom
Concentration
/ mg·L -1
Rooting rate at various days / %
10 d 20 d 30 d
The day of the
first rooting
Axillary
bud
Leaf and internode
Terminal bud
growth
0 90. 0 100 100 6 Yes Small light yellow leaf without seta and short internodes Expand
20 81. 7 100 100 6 None Green leaf with seta and normal internodes Normal
40 75. 0 100 100 7 None Green leaf with seta and normal internodes Normal
60 26. 7 85. 0 100 9 None Green leaf with seta and normal internodes Normal
80 1. 7 75. 0 80. 0 10 None Green leaf with seta and normal internodes Normal
100 0 25. 0 58. 3 11 None Green leaf with seta and shortl internodes Normal
120 0 23. 3 30. 0 16 None Small green leaf with seta and short internodes Normal
　
　 2 期 　 　 曹喜兵,等:甲基磺酸甲酯处理毛泡桐丛枝病幼苗的形态变化及 SSR分析
2. 2　 MMS对丛枝病植原体的影响
MMS处理毛泡桐丛枝病幼苗 DNA 巢式 PCR
扩增结果(图 2)表明,不同浓度 MMS 对丛枝病幼
苗内植原体的抑制效果存在明显的差异。 当MMS
浓度为 20 mg·L -1时,虽然处理幼苗形态上呈现
健康状态(图 1B,表 1),但是幼苗 DNA 仍扩增出
了丛枝病植原体 16S rDNA 特有的 1. 2 kb 条带。
也就是说,浓度为 20 mg·L -1的 MMS 处理幼苗
内仍有丛枝病植原体的存在, 而浓度为 40 ~ 120
mg·L -1处理幼苗内皆没有丛枝病植原体的存在。
这说明浓度等于或大于 40 mg·L -1的 MMS 可消
除处理幼苗内丛枝病植原体。 其原因可能是浓度
大于 40 mg·L -1的 MMS 在提高幼苗 DNA 甲基
化水平的同时,也使植原体 DNA 发生了甲基化,
从而抑制了植原体的复制。 并且在此过程中,重新
活化的泡桐防御系统相关酶水解了植原体 DNA
的缘故。
2. 3　 丛枝病发生与毛泡桐幼苗 DNA碱基变化
MMS处理毛泡桐丛枝病幼苗 DNA的 SSR扩
增产物的电泳结果(图 3-A ~ C)表明,不同浓度
MMS处理毛泡桐幼苗的 DNA 的碱基序列在 SSR
水平上没有发生变化。 虽然 45 对引物对病苗、20
和 100 mg·L -1 MMS 处理病苗以及健康苗的
DNA进行 SSR扩增后产生片段出现多态性,但不
同处理幼苗 DNA经同一引物扩增的 DNA 片段没
有多态性。 该结果说明,毛泡桐健康和丛枝病幼苗
及 MMS处理幼苗的 DNA 碱基序列在 SSR 分子
标记水平上相同。 这意味着丛枝病植原体没有导
致毛泡桐 DNA碱基序列的改变。
3　 讨论
丛枝病植原体侵入导致了泡桐体内一系列生
理生化的变化[3,4],这些变化往往是丛枝病植原体
与寄主泡桐相互作用的结果。 由于丛枝病植原体
至今不能体外培养,因此,研究丛枝病植原体与寄
主 DNA 等生物大分子的关系可能有利于泡桐丛
枝病发生机理的阐明。 本试验中,我们用 MMS 处
理毛泡桐丛枝病幼苗后发现,MMS 可使丛枝病幼
苗转变为形态上健康幼苗,并且浓度大于 40 mg·
L -1的 MMS处理后形态上呈现健康的幼苗内检测
不到植原体存在。 此外,毛泡桐丛枝病幼苗、健康
幼苗、MMS 处理后形态呈现健康幼苗 DNA 的
SSR扩增结果表明,它们 DNA 的碱基序列没有发
生变化。 由此可知,丛枝病植原体侵入或侵入后产
生的物质没有引起毛泡桐 DNA 碱基序列的变化,
其之所以表现丛枝病症状可能与 DNA 高级结构
变化有关。 MMS 处理在没有改变寄主幼苗 DNA
碱基序列的前提下使丛枝病幼苗形态上呈现健康
状态,可能与其提高了病原降低寄主 DNA 甲基化
水平[4],从而阻止丛枝病发生相关基因表达和重
新启动抑制丛枝病发生基因表达密切相关。 这与
植原体侵入关闭泡桐丛枝病发生特异相关蛋白质
对应基因表达,消除植原体又重新启动该基因表达
Fig. 2　 The nested PCR of phytoplasma in the Paulownia tomentosa seedlings
treated with different concentrations of MMS
M: DMA marker; 1: Diseased seedlings; 2-7: Diseased seedlings treated with MMS at concentrations of
20, 40, 60, 80, 100 and 120 mg·L -1, respectively; 8: Healthy seedlings; 9: CK.
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植物病理学报 42 卷
Fig. 3　 Gel electrophoresis of the SSR-PCR products of the seedlings treated with MMS
M: DNA marker; a: Diseased seedlings; b-c: Diseased seedlings treated with MMS at concentrations of
20 and 100 mg·L -1, respectively; d: Healthy seedlings; 2、5、19、30……415: Primer codes.
的结果[3]相一致。
参考文献
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责任编辑:李晖
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